pengantar perlindungan tanaman (hpt….)

PENETAPAN POTYVIRUS ISOLAT
INDONESIA
Reverse Transcriptase-polymerase Chain Reaction (RTPCR) menggunakan primer spesifik Potyvirus
 RNA total diekstraksi dari tanaman nilam sumber
Potyvirus menggunakan Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen)
 First strand cDNA disintesa menggunakan oligo dT
sebagai primer (Promega)
 Primer spesifik Potyvirus:
MJ1 [5’-ATGGTHTGGTGTGYATHGARAAYGG-3’] dan
MJ2 [5’-TGCTGCKGCKGCYTTCATYTG-3’]
[Alpha DNA spore, Singapore] ukuran 327 bp
PENETAPAN DAN ANALISA SIKUEN
GEN CP POTYVIRUS
AMPLIFIKASI GEN CP POTYVIRUS
 RNA total diekstraksi dari nilam sumber Potyvirus
menggunakan Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen)
 PCR menggunakan forward primer yang didesain di
bagian upstream dan reverse primer di bagian
downstream gen CP Potyvirus (acc. no. EU625351,
GenBank)
P1
VPg
HC-Pro
P3
CI (Hel.)
VPg/Pro
NIb
CP
Poly A
33K
52K
41K
6K
71K
6K
Ukuran ± 10 059 nt
22; 27K
59K
31K
PENETAPAN DAN ANALISA SIKUEN
GEN CP POTYVIRUS
PENENTUAN HUBUNGAN KEKERABATAN POTYVIRUS
[GEN CP]
 Produk RT-PCR disikuen lansung [tanpa kloning]
 Sikuen gen CP Potyvirus isolat Indonesia dibandingkan
dengan isolat-isolat dari negara lain
 Analisis pohon pilogeni dilakukan dengan program
Clustal V
KLONING GEN CP POTYVIRUS DAN
KONTRUKSI PLASMID VEKTOR
EKSPRESI
Gen CP Potyvirus (gen virulen) diamplifikasi secara utuh
[RT-PCR]:
Forward primer didesain mulai dari start codon dan reverse
primer diakhiri dengan stop codon dari ORF gen CP
Pada ujung 3' forward primer ditambahkan sikuen CCATGG
(NcoI) dan pada ujung 3' reverse primer ditambahkan sikuen
GGTNACC (BstEII)
KLONING GEN CP POTYVIRUS DAN
KONTRUKSI KIMERA PLASMID
EKSPRESI
Gen CP [produk PCR ] disisipkan ke plasmid vektor pJET1.2
[melalui reaksi ligasi dan transformasi ke E.coli]
Gen CP disisipkan ke plasmid vektor ekspresi pCAMBIA1301
[melalui pemotongan dengan ensim Ncol dan BstEII, purifikasi, ligasi]
Hasil ligasi [pCAMBIA1301::gen CP] di transformasi ke sel
kompeten E. coli
[dikonfirmasi melalui seleksi koloni dengan kanamycin, isolasi DNA dan
pemotongan DNA dengan ensim Ncol dan BstEII]
DNA [pCAMBIA1301::gen CP] di transformasi ke sel
kompeten A. tumefaciens LBA4404
[seleksi koloni dengan kanamycin, isolasi DNA dan pemotongan DNA
dengan ensim yang unik]