26 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat

26
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Kegiatan penelitian dilakukan di Laboratorium Virologi, Departemen
Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium
Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN), Cimanggu-Bogor, sejak Juni 2008
hingga Februari 2010.
Metode Penelitian
Kegiatan penelitian ini meliputi lima tahapan utama yaitu: (1) isolasi DNA
total Begomovirus, (2) amplifikasi DNA Begomovirus, (3) kloning DNA
Begomovirus hasil amplifikasi dan konfirmasi klon rekombinan, (4) karakterisasi
gen Begomovirus dan (5) hibridisasi DNA dengan pelabelan digoxigenin
menggunakan DIG-High Prime DNA labeling and Detection Starter Kit I (Roche
2004).
Isolasi DNA Total Begomovirus
Isolat Begomovirus dalam penelitian ini berasal dari tanaman tomat yang
terinfeksi oleh Begomovirus yang diperoleh dari Segunung-Cianjur, SeyeganSleman, Ngluwar-Magelang dan Sedan-Rembang. DNA total diperoleh dengan
teknik isolasi DNA metode CTAB (Doyle & Doyle 1990).
Tahapan isolasi DNA total diawali dengan memanaskan 10 ml bufer
ekstraksi (2% CTAB, 100 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1%
2-β-merkaptoetanol) dalam penangas air pada suhu 65°C. Sampel daun tanaman
sakit (seberat 0,1 gram) digerus sampai lembut dengan menggunakan mortar
dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro
berukuran 1,5 ml dan ditambahkan 500 μl bufer ekstraksi yang sudah dipanaskan
kemudian dicampur dengan baik. Campuran hasil gerusan dan bufer ekstraksi
diinkubasi pada suhu 65 °C selama 60 menit dan setiap 10 menit tabung mikro
dibolak-balik untuk membantu proses lisis. Setelah 60 menit, campuran tersebut
diambil dari penangas air dan didiamkan sebentar (2 menit) pada suhu ruang,
kemudian ditambahkan 500 μl campuran Kloroform:Isoamilalkohol (CI) dengan
perbandingan 24:1. Agar tercampur dengan baik, tabung divorteks selama 5 menit
27
kemudian disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 12.000 rpm. Supernatan
yang terbentuk diambil secara hati-hati dan dipindahkan ke tabung mikro yang
baru, lalu ditambahkan 0,1 volume sodium asetat 3 M CH3COONa, pH 5,2 (408,1
g Na-asetat.3H2O di dalam 800 ml H2O) dan dicampur dengan baik. Setelah itu,
ditambahkan lagi dengan 2/3 x volume isopropanol atau 2,5 x volume etanol
absolut yang bertujuan untuk mengendapkan DNA dengan membolak-balik
tabung perlahan. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu -20°C selama 60
menit atau semalam, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama
10 menit untuk mengendapkan DNA. Endapan DNA yang diperoleh kemudian
dikeringanginkan.
Sebagai tahap akhir dari isolasi DNA adalah pencucian dan suspensi DNA.
Pencucian DNA dilakukan dengan etanol 70% yang berfungsi untuk
membersihkan sisa-sisa garam maupun kontaminan lainnya yang mengendap.
Selanjutnya endapan dilarutkan dengan bufer TE 1x (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1
mM EDTA) sebanyak 50-100 μl.
Amplifikasi DNA Begomovirus
Amplifikasi DNA Begomovirus dilakukan dengan teknik PCR yang
dilakukan mengikuti prosedur Rojas et al. (1993) dengan primer spesifik untuk
gen AV1 Begomovirus yaitu: CPPROTEIN-V1 dan CPPROTEIN-C1 yang akan
mengamplifikasi bagian gen protein selubung (coat protein). Sekuen nukleotida
primer
CPPROTEIN-V1
TCGAAGCGACCCGCCGA-3’
yaitu:
sedangkan
5’TAATTCTAGATG
CPPROTEIN-C1
yaitu:
5’-
GGCCGAATTCTTAATTTTGAACAGAATCA-3’ (AVRDC, Taiwan). Program
amplifikasi terdiri atas 30 siklus dengan tahapan: predenaturasi pada suhu 940C
selama 4 menit, denaturasi (fase pemisahan utas DNA) pada suhu 940C selama 1
menit, annealing (pengintegrasian primer) pada suhu 500C
selama 2 menit,
amplifikasi (sintesis untaian DNA baru) pada suhu 720C selama 3 menit dan
tahapan pasca extention pada suhu DNA 720C selama 5 menit. DNA hasil
amplifikasi dielektroforesis pada gel agarosa 1% dan divisualisasi di bawah UV
transiluminator. Untuk memperoleh fragmen tunggal DNA yang tidak tercampur
dari fragmen DNA lainnya, fragmen DNA yang teramplifikasi dielusi dengan
menggunakan QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Selanjutnya fragmen DNA
28
dikonfirmasi dengan perunutan nukleotida dan digunakan sebagai DNA sisipan
(insert) dalam proses ligasi.
Pengklonan DNA Begomovirus Hasil Amplifikasi
Tahapan pengklonan meliputi 3 kegiatan yaitu: Ligasi, Transformasi dan
Konfirmasi klon rekombinan.
Ligasi
Ligasi merupakan proses penyambungan antara vektor dan DNA sisipan
dengan bantuan enzim ligase. Ligasi dilakukan mengikuti metode Promega
(2007). Fragmen DNA hasil amplifikasi PCR disisipkan pada plasmid pGEM -T
Easy dengan bantuan enzim ligase. Reaksi ligasi terdiri atas 60 ng fragmen DNA,
50 ng DNA vektor pGEM-T Easy, 5 μl 2x bufer ligasi T4 DNA ligase, 1 μl T4
DNA Ligase (3 Weiss Unit/μl) dan ditambahkan ddH2O sampai mencapai volume
akhir 10 μl. Bahan-bahan yang sudah dicampur dalam tabung mikro kemudian
diinkubasi pada suhu 4oC selama 16 jam.
Transformasi
Tahapan ligasi dilanjutkan dengan proses introduksi rekombinan yang
dilakukan mengikuti metode Sambrook (1989). Hasil ligasi diintroduksi ke dalam
sel E. coli DH5α yang kompeten sebagai inang, kemudian ditumbuhkan dalam
media yang mengandung agen seleksi untuk mengetahui adanya sisipan di dalam
plasmid.
Penyiapan Bakteri Kompeten. Bakteri E. coli DH5α yang akan digunakan dalam
tahapan transformasi harus berada dalam kondisi kompeten. Penyiapan bakteri
kompeten dilakukan mengikuti metode Sambrook (1989). Sebuah koloni bakteri
E. coli DH5α dari biakan media LB agar (1% Bacto tryptone, 0,5% yeast extract,
0,5% NaCl, pH 7) diambil dan dikulturkan dalam 50 ml medium LB cair pada
suhu 37oC di dalam penggoyang (shaker) pada 200-250 rpm selama 16-18 jam.
Kultur E. coli DH5α tersebut diambil sebanyak 1 ml, diinokulasi pada 10 ml
media LB cair, serta diinkubasi pada kondisi yang sama dengan sebelumnya
sampai diperoleh kerapatan optik A600=0,4-0,5. Selanjutnya kultur bakteri
diinkubasi dalam es selama 10 menit dan dilanjutkan dengan proses pengendapan
dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4oC selama 1 menit.
29
Endapan yang diperoleh disuspensi dengan menambahkan 1 ml 0,1 M CaCl2,
divortex secara perlahan-lahan dan dibiarkan di dalam es selama 10 menit. Setelah
itu suspensi bakteri disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4oC selama
1 menit. Endapan yang diperoleh kemudian disuspensi dengan hati-hati ke dalam
200 l LB cair dan dibiarkan dalam es selama 15 menit. Bakteri yang kompeten
tersebut siap untuk digunakan dalam tahapan transformasi.
Introduksi DNA Rekombinan. Introduksi DNA dilakukan dengan mencampurkan
10-50 ng plasmid hasil ligasi (volumenya kurang dari 10 μl) dengan 100-200 μl
bakteri kompeten dalam 1,5 ml tabung mikro dan setelah itu diinkubasi pada es
selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan perlakuan panas (heat shock) pada suhu
42oC selama 90 detik dan segera diinkubasi pada es selama 2 menit. Sebanyak
250 μl media LB diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit dengan kecepatan
250 rpm. Setelah itu bakteri disebar pada media LB padat yang telah mengandung
100 mg/l ampisilin. Pada media LB ditambahkan juga 0,1 M IPTG (10 μl/ cawan)
dan 2% X-Gal (50 μl/ cawan) untuk memudahkan seleksi koloni. Biakan tersebut
dinkubasi pada suhu 37oC semalam.
Konfirmasi Klon Rekombinan
Konfirmasi klon rekombinan dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu:
seleksi plasmid rekombinan dengan media selektif, isolasi plasmid rekombinan,
isolasi DNA sisipan melalui pemotongan dengan enzim restriksi EcoR1 dan
perunutan DNA (sequensing) terhadap fragmen sisipan dari klon tersebut
sehingga klon yang diperoleh dipastikan membawa fragmen DNA target
Begomovirus.
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif. Seleksi plasmid
rekombinan dilakukan berdasarkan warna koloni yang tumbuh pada media selektif
(LB + Ampisilin + IPTG/X-Gal). Koloni berwarna putih akan dipilih dan
dikonfirmasi pada tahapan berikutnya.
Isolasi Plasmid Rekombinan. Isolasi plasmid dilakukan dengan menggunakan
GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas 2006). Koloni E. coli yang
mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam 2 ml media LB yang
mengandung 100 mg/l ampisilin dan diinkubasi di dalam shaker (250 rpm) pada
suhu 37oC selama semalam. Biakan bakteri dalam volume besar kemudian dibagi
30
kedalam tabung mikro yang pangkalnya meruncing (konical). Setelah itu bakteri
diendapkan dengan sentrifugasi pada 13.000 rpm, pada suhu 4oC selama 5 menit
dan hasil endapan bakteri disuspensi dalam 250 μl bufer resuspensi sel (50 mM
Tris HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA). Setelah tersuspensi dengan baik, yaitu ditandai
dengan tidak adanya endapan (atau gumpalan), bakteri dilisis dengan penambahan
250 μl bufer lisis (0,2 M NaOH; 1% SDS). Supaya bufer lisis tercampur rata,
tabung reaksi dibalik-balikkan sebanyak 4-6 x dan dibiarkan 1-2 menit. Bakteri
yang telah lisis ditambah 350 μl bufer netralisasi (1,32 M potasium asetat, pH 4,8)
dan tabung reaksi dibalik-balikkan 4-6 x hingga bufer netralisasi tercampur
merata. Campuran kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2
menit. Cairan jernih dibagian atas diambil dan dipindahkan ke kolom tabung
reaksi yang bersih. Setelah itu ditambahkan 500 μl bufer pencuci dan
disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit, diulangi kembali
kemudian sentrifugasi kolom kosong (tanpa cairan) pada kecepatan 13.000 rpm
selama 1 menit. Langkah berikutnya adalah memindahkan kolom ke tabung mikro
baru dan steril, menambahkan 50 μl bufer elusi, inkubasi selama 2 menit di suhu
ruang dan sentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit.
Isolasi DNA Sisipan Melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi. DNA
sisipan dipisahkan dari plasmid pGEM-T menggunakan enzim restriksi EcoR1
(Gambar 3).
Gambar 3 Situs pemotongan EcoR1 pada plasmid pGEMT-Easy
31
Sebanyak 10 μl DNA plasmid rekombinan, 2,5 μl larutan penyangga 3NIB
dan 1,5 μl enzim restriksi EcoRI (10 unit/μl) dimasukkan ke dalam tabung mikro
yang kemudian ditambah H2O hingga volume akhir larutan menjadi 25 μl.
Larutan diinkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam. Visualisasi hasil pemotongan
dengan enzim restriksi dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1,5%
seperti diuraikan sebelumnya.
Perunutan DNA. Untuk memastikan bahwa fragmen DNA yang diperoleh dari
klon rekombinan tersebut adalah DNA Begomovirus maka perlu dilakukan
perunutan nukleotida dengan teknik perunutan. Perunutan dilakukan oleh PT.
Macrogen, Korea Selatan.
Karakterisasi Gen Protein Selubung Begomovirus
Gen protein selubung Begomovirus yang diperoleh dalam penelitian ini
selanjutnya akan dikarakterisasi melalui beberapa analisis yaitu analisis
kesejajaran urutan nukleotida gen protein selubung dengan program BLAST
(Basic Local Aligment Search Tools) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) dan
analisis spesifisitas gen protein selubung dilakukan dengan program multiple
alignment, Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/Clustal W). Melalui tahapan analisis
ini dipastikan bahwa fragmen DNA yang diperoleh adalah DNA Begomovirus dan
memiliki tingkat spesifisitas yang tinggi terhadap anggota Begomovirus lainnya
sebagai salah satu syarat utama dalam pengembangannya sebagai metode deteksi .
Hibridisasi DNA
Hibridisasi pelacak DNA sebagai metode deteksi Begomovirus meliputi
beberapa tahapan yaitu: persiapan sampel uji, persiapan membran, pelabelan
pelacak DNA, prehibridisasi, pencucian membran, hibridisasi dan deteksi.
Persiapan Sampel Uji
Pengujian spesifisitas pelacak DNA dilakukan dengan menggunakan
beberapa tanaman sampel yaitu: tanaman tomat sehat (bebas infeksi virus) sebagai
kontrol negatif, tanaman tomat terinfeksi Begomovirus sebagai kontrol positif,
tanaman target terdiri dari gulma Babadotan (Ageratum conyzoides) dan tanaman
tomat yang dikumpulkan dari lapangan yang menunjukkan gejala infeksi
Begomovirus, tanaman yang terinfeksi oleh virus lain terdiri atas tanaman tomat
32
yang terinfeksi ToCV (Tomatto Chlorosis Virus), tanaman cabai yang terinfeksi
ChiVMV (Chilli Veinal Mottle Virus) dan tanaman tembakau yang terinfeksi
TMV (Tobacco Mosaic Virus). Sampel yang akan digunakan terdiri dari 3 jenis
penyiapan: 1) DNA total tanaman yang diperoleh dengan metode ekstraksi
Doyle&Doyle yang dimodifikasi (1990), 2) Cairan perasan tanaman yang
diperoleh berdasarkan prosedur Gilbertson et al. (1991) yaitu 1 gr daun tanaman
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, lalu ditambahkan 200 μl bufer TE (pH
7,5) kemudian digerus dengan pistil dan selanjutnya tabung tersebut disentrifugasi
pada 10000 rpm selama 10 menit, dan 3) DNA produk amplifikasi menggunakan
primer spesifik AV1 dengan teknik PCR (Rojas et al. 1993). Sebagai pembanding
digunakan plasmid rekombinan utuh, sisipan gen protein selubung Begomovirus
dan vektor pGEM-T Easy serta beberapa plasmid rekombinan Begomovirus yaitu:
plasmid rekombinan gen AV1 TYLCV (TJ Santoso, BB-Biogen), plasmid
rekombinan Full Length dan partial PYLCV (WS Tsai, AVRDC). Seluruh sampel
yang disiapkan dikuantifikasi (1µg/µl) melalui pengukuran nilai absorbansinya
dengan spektrofotometer. Pengujian sensitifitas teknik hibridisasi dilakukan
melalui pengenceran berseri terhadap seluruh sampel yaitu: 10, 10-1 , 10-2 ,10 -3 , 10
-4
,10
-5
-6
, 10 .
Persiapan Membran
Membran nilon Hybond-N (Roche) dipotong sesuai kebutuhan kemudian
dicuci selama 3 menit dalam 50 ml 20x SSC (35,06 g NaCl, 17,64 g Na sitrat
dalam 200 ml liter larutan, pH 7), selanjutnya membran dikeringkan di atas kertas
saring Whatman steril dan disimpan atau langsung digunakan untuk hibridisasi,
dengan meneteskan 1 μl sampel sesuai dengan rancangan perlakuan. Setelah itu
membran diberi perlakuan UV-Crosslink di ruang gelap selama 3 menit dan dicuci
dengan menggunakan air steril dan dikeringanginkan.
Pelabelan Pelacak DNA
Di dalam penelitian ini digunakan pelacak DNA spesifik Begomovirus yang
berasal dari sisipan gen selubung protein rekombinan Begomovirus Ngluwar.
Pelabelan pelacak DNA dilakukan dengan metode Roche (2004). Sebanyak 1 g/
templat DNA dan akuades steril dengan total volume 16 l di inkubasi selama 10
menit di dalam air mendidih (100oC). Setelah itu ditambahkan 4 l DIG-HIGH
33
Prime, dicampur secara merata, dan di sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm
selama 1 menit lalu diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC. Selanjutnya
ditambahkan 2 l 0,2 M EDTA pH 8 untuk menghentikan reaksi pelabelan.
Prehibridisasi
Membran yang telah diteteskan cairan perasan tanaman terlebih dahulu di
prehibridisasi mengikuti metode Roche (2004). Langkah pertama yaitu dengan
memanaskan larutan Dig-Easy Hyb (10 ml/100 cm2 membran) pada suhu 37oC
selama 30 menit dengan sedikit goyangan. Sementara itu pelacak DNA yang telah
dilabel (25 ng/ml) di denaturasi pada suhu 100 oC selama 5 menit dan diinkubasi
di es dengan segera. Pelacak DNA tersebut kemudian dicampurkan ke dalam DigEasy Hyb yang telah dipanaskan. Selanjutnya membran dalam campuran tersebut
diinkubasi selama 16 jam.
Pencucian Membran
Membran di cuci dengan larutan yang mengandung 2x SSC dan 0,1% SDS
pada suhu 15-25oC dengan sedikit goyangan selama 2x5 menit. Selanjutnya
membran dicuci kembali dengan larutan yang mengandung 0,5x SSC dan 0,1%
SDS pada suhu 65-68oC dengan sedikit goyangan selama 2x15 menit.
Hibridisasi
Hibridisasi dilakukan mengikuti metode Roche (2004). Membran yang telah
diberi perlakuan pada tahapan sebelumnya di cuci selama 1-5 menit dalam bufer
pencuci (0,1 M Maleic acid, 0,15 M NaCl, pH 7,5; 0,3% Tween 20) pada suhu 1525oC dengan sedikit goyangan selanjutnya di inkubasi selama 30 menit pada suhu
dan kecepatan goyangan yang sama ke dalam 100 ml Blocking solution. Setelah
itu membran dinkubasi ke dalam larutan antibodi selama 30 menit pada suhu dan
kecepatan goyangan yang sama. Terakhir membran di cuci dalam bufer pencuci
selama 15 menit sebanyak 2 kali.
Deteksi
Membran yang telah dihibridisasi segera diinkubasi ke dalam 20 ml
Detection buffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 9,5) selama 2-5 menit pada
suhu 15-25oC dengan sedikit goyangan. Kemudian membran diinkubasi ke dalam
10 ml Color substrate solution di dalam wadah gelap pada suhu 15-25oC dengan
sedikit goyangan. Perubahan warna yaitu warna ungu akan terjadi selama inkubasi
34
dan 16 jam inkubasi merupakan waktu maksimum yang dibutuhkan. Reaksi
dihentikan dengan cara mencuci membran selama 5 menit dengan menggunakan
air steril. Deteksi reaksi hibridisasi yang positif didasarkan pada perubahan warna
pada membran tersebut.