Ringkasan Pengkajian Keamanan Lingkungan Produk Rekayasa

Ringkasan Pengkajian Keamanan Lingkungan Produk Rekayasa Genetik
Vaksin Nobilis® rHVT-ND
I.
Pendahuluan
Vaksin Nobilis® rHVT-ND merupakan produk rekayasa genetik (PRG)
dengan kandungan virus Herpesvirus of Turkey (HVT) strain PB1 yang
disisipi gen F dari virus Newcastle Disease Virus (NDV) strain Clone 30.
Oleh karena itu, virus rHVT-ND mampu memberikan proteksi terhadapa
dua jenis penyakit yang berbeda, yaitu penyakit Marek dan ND. Di
samping itu, keunggulan vaksin tersebut mempunyai durasi proteksi yang
lebih lama dibandingkan dengan vaksin konvensional sejenis. Secara
khusus vaksinasi dengan vaksin Nobilis® r-HVT-ND tidak mengintroduksi
virus ND utuh ke tubuh ayam, oleh karena itu timbulnya reaksi pasca
vaksinasi yang pada umumnya terjadi pada vaksin ND aktif konvensional
dapat dihilangkan.
Vaksin Nobilis® rHVT-ND diproduksi oleh Intervet Inc. (Merck Animal
Health) USA, yang di negara lain terdaftar dengan nama Innovax-ND atau
Innofusion-ND atau Marek’s Disease – Newcastle Disease Vaccine,
Serotype 3, live Marek’s Disease Vector. Vaksin Nobilis® rHVT-ND akan
dipasarkan oleh PT Intervet Indonesia untuk pengendalian dan
penanggulangan penyakit Marek’s Disease (MD) dan Newcastle Disease
(ND) pada ayam di Indonesia.
Sampai saat ini, vaksin Nobilis® rHVT-ND telah terdaftar dan memperoleh
Certificate of Free Sale di 19 negara, yaitu di Amerika Serikat (2010),
Kanada (2010), Costa Rica (2011), Yordania (2011), Thailand (2011),
Kuwait (2012), Kolombia (2013), Guatemala (2013), Mexico (2013), Maroko
(2013), Panama (2013), Peru (2013), Filipina (2013), Rusia (2013),
Trinidad and Tobago (2013), Ukraina (2013), Brazil (2014) dan El Savador
(2014).
Berdasarkan Peraturan Pemerintah No.21 Tahun 2005 tentang Keamanan
Hayati Produk Rekayasa Genetik, dan Peraturan Menteri Lingkungan
Hidup No.25 Tahun 2012 tentang Pedoman Penyusunan Analisis Risiko
Lingkungan Produk Rekayasa Genetik, maka Tim Teknis Keamanan
Hayati Produk Rekayasa Genetik (TTKH PRG) telah melakukan pengkajian
keamanan lingkungan vaksin Nobilis® rHVT-ND. Pengkajian didasarkan
pada informasi genetik dan informasi keamanan lingkungan yang terdiri
atas, sifat genetik yang direkayasa, stabilitas genetik jasad renik PRG,
kemampuan penyebaran jasad renik, hospes alami dari tetua jasad renik
PRG dan kemungkinan menimbulkan risiko terhadap lingkungan,
sebagaimana diuraikan di bawah ini.
II. Informasi Jasad Renik PRG
II.1 Deskripsi Umum Jasad Renik PRG
Jasad renik PRG yang digunakan untuk memproduksi Nobilis® rHVT-ND
adalah virus HVT strain PB1 sebagai inang yang disisipi gen F virus ND
strain Clone 30 sebagai gen donor.
II.2 Informasi Sifat Genetik Jasad Renik
Tetua jasad renik PRG adalah virus HVT Serotipe 3 strain PB1 yang
merupakan strain virus MD yang tidak patogen dan telah digunakan
secara luas sebagai strain vaksin untuk pencegahan penyakit Marek
(Calnek et. al.1997)
Donor gen dari vaksin Nobilis® rHVT-ND ini adalah gen F dari virus ND
strain Clone 30, yang termasuk dalam strain Lentogenik. Gen F telah
biasa digunakan sebagai donor gen dalam produksi jasad renik PRG
untuk vaksin hewan. Fungsi protein F adalah sebagai mediator fusi
amplop virus dengan membran plasma (Ganar et al., 2014 dan Kapczynski
et al., 2013). Secara detil sekuen gen F virus ND strain Clone 30 ini dapat
dilihat di GenBank www.ncbi.nih.gov/genbank/ dengan nomor akses
Y18898.1.
Lokasi penyisipan adalah pada tapak restriksi BglII pada posisi 138.193 di
dalam open reading frame (ORF-086) HVT PB 1, yang merupakan bagian
non-esensial bagi HVT. Jumlah kopi yang disisipkan adalah satu kopi.
Penyisipan tersebut tidak memberikan dampak yang merugikan atau
tidak mempengaruhi virulensi virus tetuanya, bahkan memberikan nilai
tambah berupa perlindungan terhadap penyakit ND (Sondermeijer, 1993).
Kestabilan sisipan gen F NDV dan promotornya pada HVT PB1 ketika dipasase secara in vitro ditunjukkan pada Report 04R/0238. Sekuens gen F
dan daerah HVT pengapit bersifat stabil setelah 11 kali pasase di sel
kultur chicken embryo fibroblast (CEF). ditunjukkan dengan Virus PRG
HVT/ND-F memiliki kesamaan identitas sekuens 100% dengan virus
Master Seed.Gen NDV-F stabil di dalam genom HVT dan tidak mengubah
HVT/NDV-F menjadi virulen ketika di-pasase secara in vivo (Report 7.
Genetic and phenotypic stability of HVT/NDV-F following back passage
through the natural host;).
II.3 Metode Konstruksi Genetik
Virus rekombinan berasal dari rekombinasi klasik homolog vektor
rekombinan linear (berisi gen F NDV dengan sekuens promotor yang
nantinya diapit oleh sekuens HVT) dan genom HVT lengkap.
Langkah lengkap kloning terdapat pada flow chart “Cloning and
Generation of HVT/NDV-F” serta Sondermeijer et al., 1993. Secara singkat,
metode konstruksi genetik HVT/NDV-F adalah sebagai berikut:
1. Unique short segment (Us) dari DNA HVT yang dibuat dengan melakukan
digesti parsial genom HVT dengan enzim Sau3A selanjutnya diligasi
dengan vector pGEM3Z untuk menjadi pMD07. Plasmid pMD07
merupakan plasmid rekombinan yang mengandung daerah insersi genom
HVT yang non-essential.
2. Konstruksi vektor rekombinan dibuat dengan menyisipkan daerah
promoter long terminal repeat (LTR) dari virus Rous sarcoma (RSV) pada
plasmid pRSVcat. Di bagian downstream dari promoter RSV LTR, yang
merupakan fragmen hasil digesti NdeI-HindIII pada plasmid pRSVcat
sebesar 0.6kb, dibuat daerah unik untuk beberapa situs restriksi yang
memungkinkan untuk menyisipkan satu atau beberapa gen ke dalam
vektor rekombinan. Rekombinasi plasmid pVEC01 yang mengandung LTR
yang diapit sekuens genom HVT dari plasmid pMD07 sebesar 0.8 kb dan
0.4 kb selanjutnya merupakan plasmid pVEC04.
3. cDNA dari virus ND Clone 30 dimasukkan ke dalam pustaka λgt10. Filter
replika dari pustaka λgt10 ditumbuhkan dalam E coli strain NM514
selanjutnya discreen/diseleksi untuk mendapatkan gen F dari virus NDV.
Fragmen gen F tersebut disubklon ke plasmid pGEM4Z dan dimanipulasi
dengan pemotongan situs menggunakan enzim Bal-31 untuk
menghilangkan beberapa sekuens di bagian upstream dan downstream
gen F untuk selanjutnya disebut plasmid pNDV01. Gen F virus ND dalam
plasmid pNDV01 diklon pada situs BamHI dari plasmid pVEC04 pada
bagian downstream dari promoter LTR untuk membuat plasmid pNDV04.
4. Plasmid pNDV04 dibuat linier dan ko-transfeksi dilakukan bersama HVTPB1 ke dalam biakan CEF. Rekombinan virus HVT yang mengandung gen
F virus ND dideteksi dengan teknik indirect immunofluorecent
menggunakan antibodi anti ND.
II.4 Karakter Modifikasi Genetik
Nobilis® rHVT-ND merupakan rekombinasi Herpesvirus of Turkey (HVT)
strain PB-1 yang disipi gen F virus Newcastle Disease (ND) strain Clone
30.
Modifikasi genetik berupa penyisipan gen F virus ND ke genom HVT tidak
mempengaruhi virulensi tetuanya (HVT), sebaliknya bahkan memberikan
nilai tambah berupa ekspresi protein F virus ND yang berfungsi
memberikan perlindungan terhadap infeksi virus ND.
Rekombinan HVT-ND bersifat stabil ketika dipasase 11 kali secara in vitro
pada sel kultur CEF dan secara genotip dan fenotip stabil pada studi in
vivo setelah dilakukan back-passage 5 kali pada inang alaminya.
II.5 Kemungkinan terjadinya gen yang disisipkan pada jasad renik PRG
untuk vaksin hewan dipindahkan ke organisme lain
Gen F yang disisipkan ke dalam genom HVT bersifat stabil sesuai dengan
uraian pada butir II.2. Untuk mengetahui kemungkinan pemindahan gen
donor (gen F) ke organisme lain telah dilakukan analisis BLAST pada
nukleotida dari gen F virus ND strain Clone 30 dengan nomor akses
Y18898.1.
Hasil analisis BLAST menunjukkan bahwa gen F tersebut tidak memiliki
homologi dengan sekuen gen organisme lain, oleh karena itu pemindahan
gen ke organisme lain tidak dimungkinkan.
II.6 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik dapat disimpulkan
bahwa:
a. Ekspresi dari gen interes (gen F dari virus ND) yang disisipkan dalam
virus HVT tidak mengubah sifat virulensi HVT bahkan dapat
memberikan nilai tambah perlindungan terhadap penyakit Marek dan
ND.
b. Virus rekombinan HVT-NDV-F mengandung satu kopi gen F yang
bersifat stabil secara genotip dan fenotip.
c. Tidak ada kemungkinan penyebaran/pemindahan gen F yang
disisipkan dalam jasad renik PRG (HVT-NDV-F) ke organisme lain.
III. Informasi Keamanan Lingkungan
III.1 Kemampuan Penyebaran Jasad Renik
Jasad renik PRG Nobilis® rHVT-ND memiliki sifat yang sama dengan virus
HVT tetuanya yaitu tidak patogen dan tidak diekskresikan dalam ekskreta
hewan sehingga tidak menimbulkan risiko buruk terhadap lingkungan
(Sondermeijer, 1993).
III.2 Informasi Cakupan Inang Organisme Tetua Virus PRG untuk Vaksin
Jasad renik tetua vaksin PRG Nobilis® rHVT-ND ini adalah virus HVT
strain PB1 (HVT PB1). Inang alami dari virus HVT adalah kalkun (Calnek
et al., 1997).
III.3 Informasi Kajian Molekuler
Modifikasi genetik HVT strain PB-1 dengan penyisipan gen F asal NDV
strain Clone 30. Lokasi penyisipan adalah di dalam open reading frame
(ORF-086) HVT PB 1, yang merupakan bagian non-esensial bagi HVT.
Tujuan dari modifikasi gen ini adalah untuk membuat vaksin PRG yang
mengandung virus HVT rekombinan yang mengekspresikan protein F
NDV, sehingga penggunaan vaksin Nobilis® rHVT-ND dapat menginduksi
kekebalan dan memberikan perlindungan ganda terhadap penyakit Marek
dan ND.
Virus rekombinan HVT/NDV-F mengandung satu kopi gen F virus ND
yang bersifat stabil secara genotip dan fenotip, serta tidak ada
kemungkinan penyebaran/pemindahan gen F yang disisipkan dalam
jasad renik PRG (HVT-NDV-F) ke organisme lain sehingga aman terhadap
lingkungan.
Penanda yang dapat dipakai untuk mengidentifikasi jasad renik PRG ini
adalah sekuens gen F virus ND strain Clone 30. Teknik untuk
mengidentifikasi sekuens ini dapat menggunakan teknik Polymerase
Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan primer sebagai berikut:
Forward primer F2: TGAACATGTCGCATCCCTGC; dan Reverse primer R7:
ATTCTTCATGCAATTGTCGG.
III.4 Kemungkinan dampak negatif jasad renik PRG vaksin terhadap
lingkungan
Hasil analisis BLAST nukleotida dari gen F menunjukkan tidak ditemukan
homologi sekuen genom organisme lain, sehingga kemungkinan transfer
gen ke organisme lain tidak dimungkinkan.
Vaksin PRG Nobilis® rHVT-ND tidak membentuk spora karena tetua dari
vaksin ini adalah termasuk dalam golongan virus. Hasil studi
menunjukkan bahwa tidak ada penyebaran virus melalui kontak antara
ayam yang divaksin dan ayam yang tidak divaksin (Report 5. Test for
Spreading of the Recombinant Herpesviruses of Turkey HVT/NDV-F to
Various Avian Species after Intramuscular Inoculation). Hal ini
mengindikasikan bahwa kemungkinan penyebaran virus vaksin
rekombinan dari peternakan ayam sangat tidak mungkin terjadi.
Virus vaksin dapat menyebar ke lingkungan kemudian menginfeksi inang
alamiahnya yaitu kalkun, namun sebagaimana sifat alami tetuanya virus
ini tidak bersifat patogen.
Kesimpulan
1. Vaksin Nobilis® rHVT-ND bersifat aman terhadap lingkungan karena
tidak berisiko menyebarkan jasad renik ke lingkungan.
2. Berdasarkan kajian stabilitas genotip dan fenotip jasad renik PRG dalam
vaksin Nobilis® rHVT-ND dinyatakan stabil.
3. TTKH PRG Bidang Keamanan Lingkungan menilai bahwa vaksin Nobilis®
rHVT-ND yang diajukan adalah aman terhadap lingkungan.
4. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai
dengan data keamanan lingkungan yang diperoleh hingga saat ini, maka
status aman lingkungan terhadap vaksin Nobilis® rHVT-ND perlu dikaji
ulang.
5. Apabila telah ditetapkan aman lingkungan, kemudian produk tersebut
terbukti menimbulkan risiko terhadap kesehatan manusia dan hewan
maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan
penanggulangan serta memusnahkan vaksin Nobilis® rHVT-ND yang
berada di wilayah teritori Indonesia.
6. Vaksin Nobilis® rHVT-ND tidak boleh digunakan sebagai vaksin ayam
sebelum memperoleh sertifikat aman lingkungan dari Kementerian
Lingkungan Hidup dan Kehutanan
Pustaka
1
Calnek BW, Barnes JH, Beard CW, McDougald LR, Saif YM. 1997.
Disease of Poultry: Marek’s Disease. Iowa State University Press: USA.
Hal. 369 – 413
2
Ganar K, Das M, Sinha S, Kumar S.. 2014. Newcastle disease virus:
Current status and our understanding. Virus research (184): 71 – 81.
3
Kapczynski DR, Afonso CL, Miller PJ. 2013. Immune responses of
poultry to Newcastle disease virus. Dev. and Comparative Immun. (41):
447 – 453.
4
Sondermeijer PJA, Claessens JAJ. Jenniskens PE, Mockett APA, Thijssen
RAJ, Willemse MJ, Morgan RW. 1993. Avian herpesvirus as a live viral
vector for the expression of heterologous antigens. Vaccine 11 (3): 349358.
5
Laporan No. 04R/0238. Genetic Stability of the HVT-NDV F recombinant
by sequence analysis of the insertion site and flanking regions. Hal. 1 – 8.
6
SID Innovax-ND. Intervet Schering-Plough, 2010. Report 7. Genetic and
Phenotypic Stability of HVT/NDV-F Following Backpassage through the
Natural Host. Hal. 141 – 154.
7



Flow Chart Cloning and Generation of Innovax-ND. Internal Documents
Global R&D MSD Animal Health.
Schematic representation of pNDV04. Internal Documents Global R&D MSD
Animal Health.
Sequence of NDV04. Internal Documents Global R&D MSD Animal Health
[Report No. 04R/0238]
8
Blast Result of the NDV-F gene
9
Newcastle disease virus cDNA to complete genomic RNA, clone 30.
[GenBank: Y18898.1].