teknik pembuatan dan penggunaan sel darah merah ayam yang

Tenm Tekms Fungsfonal non Penelia 2000
TEKNIK PEMBUATAN DAN PENGGUNAAN SEL
DARAH MERAH AYAM YANG DIFIKSASI
GLUTARALDEHIDA UNTUKDETEKSI ANTIBODI
HAEMOPHILUS PARAGALLINARUM
SUTARMA, AGUS EFFENDI, MUL YADI, KOKO BAR&4H don ISKANDAR
Balai Penefitian Veteriner, Jl. RE. Martadinata 30, Bogor 16114 .
RINGKASAN
Haemophilus paragallinarum adalah bakteri penyebab penyalat snot menular (coryza)
pada ayam yang dapat mengakibatkan produksi telur turun 10 - 40 %. Ayam bisa tahan terhadap
samngan penyakit ini bila mempunyai kekebalan (antibodi) . Titar kekebalan dapat dideteksi
dengan uji hambatan haemagglutinasi (Haemagglutination-Inhibition / HI) dari senminya dengan
. Antigen yang
menggunakan sel dash merah yang difiksasi dengan glutaraldehida dan antigen
dipakai adalah antigen H. paragallinamm 18 (2) serotipe A isolat lokal. Sampel serum yang
dipenksa berasal dart 2 peternakan ayam petelur di Sukabumi, jumlahnya 376 sampel dart 2
jenis strain, yaitu strain Isa-Brown dan Hubbard. Senun diperiksa setelah 3 dan 4 minggu pasca
vaksinasi ulangan (booster). Pemenksaan titar HI memberikan hasil sbb : titar 20 HI = 2
(0,53%), titan 40 HI = 11 (2,93 %), titan 80 HI = 36 (9,57%), titar 160 In = 73 (19,42 %) dan
titer 320 HI = 254 (67,55 %).
Kate kunci : Sel dash mesh, glutaraldeldda, antigen H . paragallmanun, serum ayam
PENDAHULUAN
Haemophilus paragallinarum adaU bakteri yang dapat menyebabkan
penyakit snot (coryza), yaitu penyakit spesifik dan akut dari saluran pernafasan ayam
bagian atas . Akibat penyakit ini dapat mengakibatkan kerugian ekonomi, karena dapat
menurunkan produksi telur 10-40 %pada ayam petelur (YAMAMOTO, 1984).
Ayam bisa tahun terhadap serangan penyakit ini jika mempunym
kekebalan/antibodi . Untuk mengetahui apakah ayam tersebut terinfeksi atau
mempunyai kekebalan terhadap penyakit snot, dilakukan uji serologi . Kekebalan dapat
terjadi secara alami atau buatan yaitu dengan vaksinasi. Diagnosis secara serologi
terhadap infeksi H.paragallinarum pertama kali dilaporkan oleh PAGE pads tahun
1962, yaitu dengan uji cepat aglutinasi plat . Cara ini tidak dapat mendeteksi secara
penuh tipe-tipe spesifik kekebalan, karena diketahut Hparagallinarum mempunyai 3
serotipe : A, B dan C, dimana serotipe B dinyatakan sebagai serotipe yang tidak
patogen (KUME dkk, 1980). Selanjutnya untuk mendeteksi kekebalan Aldbat terinfeksi
secara alami atau buatan dilakukan uji hambatan haemagglutinasi
(Haemagglutination- Inhibition/HI) dengan menggunakan sel-sel darah merah.
Menurut KATO dkk, (1965) sel darah merah dari macam-macam spesies hewan dapat
46
Tsm Tibw FYngsiomleonPemaa 1060
dipakai untuk mendeteksi kekebalan spesifik dan serotipe A, namun tidak bisa untuk
mendeteksi kekebalan spesifik serotipe C. Pada tahun 1982, SAWATA dkk melaporkan
bahwa uji HI menggunakan sel darah mesh ayam yang difiksasi dengan
glutataraldehida dapat mendeteksi kekebalan spesifik dari ketiga serotipe
H.paragallinarum.
Tulisan ini disajikan untuk memberikan informasi tentang cara pemlwatan
dan penggunaan sel-sel darah merah yang diiksasi dengan glutaraldehida untuk
deteksi titer antibodi terhadap Hparagalfnarum.
BAHAN DAN CARA
Bahan
Laruton Abever
D-dektrosa .. . . . . . .. . .. ... . . . 20 gram
natrium sitrat .. . . . . . . . . . . ... . 12 gram
asam sitrat . .. ... ... . . . . . . . ... 0,55 gram
NaCl . . . ... ... .. . .. . . . . . .. ..... 4,20 gram
air siding ... ... . . . . .. . .. ... ... . 1000 ml
steril dengan autoclove . . ... 115 °C, 10 menit
Larutan garam
Na3PO4 0,15 M .. . . . . . . .. . . . 1 bagian
MCI 0,15M . . . . . . ... .. . . ... 9 bagian
air suling .. . . . . . . . . .. ... . . . ... 5 bagian
Larutan garam glutaraldehida
glutaraldehida 25% . . . . . . .. 1 bagian
larutan pram . .. ... .. . . . . . . 24 bagian
Sampel
Sampel serum diambd dari dua peternakan ayam petelur di Kabupaten
Sukabumi, sebanyak 376 sampel (Tabel 1).
Cara Kerja
Penyiapan sel dash merah
McWui vena sayap, darah ayam diambil sebanyak 5 ml kemudian dicampur
dengan 5 ml larutan alsever, lalu dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse
47
Ternu Teknis Fungsional non Peneliii 2000
berskala/berukuran . Kemudian disentrifuse 3000 putaran permenit (rpm) selama 15
menit, pada suhu 4 °C. Cairan jernihnya (supernatan) dibuang, sel-sel darah merahnya
(sedimen) dicuci 3 kali dengan larutan NaCl 0,15 M, masing-masing disentrifuse 3000
rpm selama 10 menit. Sedimen kemudian di suspensikan dengan larutan garam
glutaraldehida dengan konsentrasi 1-2 % (v/v). Campuran disimpan di dalam lemari es
pada suhu 4 °C selama 30 menit, setiap 10 menit diaduk. Kemudian disentrifuse 2000
rpm, selama 10 menit, cairan jernih dibuang . Sedimen dicuci 5 kali dengan larutan
NaCl 0,15 M, disentrifuse 2000 rpm, masing-masing 5 menit. Selanjutnya sedimen
dicuci 5 kali dengan air suling, disentrifuse 2000 rpm, masing-masing 5 menit.
Sendimen sel-sel darah merah diukur konsentrasinya dengan menggunakan sentrifuse
haematokrit putaran 12000 rpm selama 10 menit, kemudian konsentrasinya dibuat 30
dengan air suling dan ke dalamnya ditambahkan merthiolat 0,01 % sebagai
pengawet . Sel-sel darah merah dnsikan kedalarn botolfiotol kecil isinya 0,5-1,0 ml,
lalu disimpan dalam tempat gelap pada suhu 4 °C selama belum/tidak dipakai. Untuk
penggunaannya dipakai konsentrasi 1 % dengan penambahan 0,1 % (w/v) bovin serum
albumin dan 0,01 % (w/v) gelatin.
Penyiapan antigen
Pupukan bakteri H.paragallinarum 18(2) isolat lokal (serotipe A) umur 20 jam
dalam "Test Medium" (TS) cair menurut RUvfl..ER 1979, disentrifuse 8000 rpm pada
suhu 4 °C selama 20 menit . Kemudian sedimen dicuci 2 kali dengan larutan fosfat
buffer salin (PBS) . Sedimen (antigen) disuspensikan dengan PBS, kekeruhannya diukur
sebanding dengan skala opasiti MC. FARLAND No. 6 (menffandung sekitar 10 11
sel/ml), lalu ke dalamnya ditambahkan merthiolat 0,01 % sebagai pengawet.
Gambar 1. Uji haemsWatinasi (RA)
48
Tent Tab- Fangaiond ron Penelid 2oo0
Untuk pemeriksaan titar kekebalan (HI) diperlukan antigen yang mempunyai nilai 20
haemagglutinasi (Haemagglutination - HA), dan dapat disiapkan sbb : dengan
mikropipet antigen dibuat enceran kelipatan dua dalam lubang plat Elisa yang dasarnya
berbentuk U, dimulai dari enceran 1 :5, 1:10 sampai 1:1280 dengan larutan PBS, isi tiap
lubang dengan 40 ~L1, lubang terakhir untuk kontrol, tidak diisi enceran antigen.
Kemudian ke dalam tiap lubang ditambahkan sel darah merah 1% masing-masing 40
~1, homogenkan, dibiarkan 15 menit pada suhu kamar. Hasil positif akan terjadi
aglutinasi (pelengketan antigen pada sel darah merah), pengerjaannya dilakukan 2
ulangard 2 deret.
Pemeriksaan titar kekebalan (uji HI)
Serum serum yang akan diperiksa dibuat enceran kelipatan dua, dimulai dan
enceran 1 :5, 1 :10 sampai dengan 1 :1280 pads plat Elisa yang lubang dasarnya
berbentuk U (U-bottom) dengan larntan PBS, masing-masing hibang berisi enceran
serum 40 lil, lubang terakhir untuk kontrol. Tambahkan ke dalamnya masing-masing
20 ul antigen 20 HA, terkecuali lubang kontrol, homogenkan, dibiarkan 15 menit pads
suhu kamar. Kemudian ke dalam masing-masing lubang ditambahkan 40 0 sel darah
mesh 1%, homogenkan, dibiarkan 45 menit pada suhu kamar. Hasil positif terjadi
pengendapan sempurna dari sel-sel darah merah. Pda up HI serum negatif dan positif
disertakan sebagai kontrol.
Gambar 2. Uji hambstan haemagglutinasi (HI)
49
Tenw Te ms Fungsfonal non Pewhtl 2000
HASIL DAN PEMBARASAN
Dan 5 ml darah ayam setelah diproses menghasilkan stok sel darah merah
30 % sebanyak 11,25 ml.
Sampel serum ayam yang dipenksa berasal dari dua peteennakan ayam
petelur (layer) di Sukabumi, masing-masing peternakan mempunyai strain ayam yang
berbeda . Peternakan pertama strain ayamnya adalah Isa-brown, umurnya bervariasi
dari umur 17 minggu (menjelang bertelur) sampai dengan umur 46 minggu (label 1),
serum diperiksa 4 mmggu paska vaksnasi ulangan (booster) . Peternakan kedua strain
ayamnya Hubbard, umumyapun bervariasi dari 24 sampai 37 minggu, semuanya
sedang bertelur (label 1). Senmz diperiksa 3 minggu paska vaksinasi ulangan
(booster) . Vaksm Hparagallinarum yang dipakai adalah serotipe A.
Pada penentuan mlai HA stok antigen yang mempunyai kekeruhan 10 11
set/ml, terjadi pelengketan sel bakten pada sel darah merah sehingga terjadi aglutinasi
sampai pada lubang 6/enceran 1 :160 (deret 1 dam 2 pada gambar 1). Jadi stok antigen
mempunyai nilai 160 HA. Untuk membuat antigen 20 HA, stok diencerkan 8 kali,
1 bagian antigen dengan 7 bagian PBS. Deret 4 dam 5 pada
gambar 1 adalah
aglutinasi antigen yang mempunyai nilai 20 HA (agludnasi sampai pada lubang 3).
Dalam serum terdapat zat aglutinin dam pada antigen terdapat zat
aglutinogen. Jika aglutinin bertemu dengan aglutinogen yang homologus akan terjadi
pengikatan dam akan terjadi aglutinasi, sehingga kalau ditambah sel darah merah akan
mengendap tanpa dihambat oleh antigen yang sudah dukat (dinetralkan) oleh serum
sampai pada enceran tertentu. Hambatan imlah sebagai dasar penentuan dam nilai titar
HI. Pada gambar 2 deret pertama dam kedua (A dam B) serum mempunyai titar HI 160
(sampai lubang 6), deret ketiga ( C ) serum mempunyai titar 320 (sampai lubang 7),
pada deret 4 dam 5
(D dam E) serum mempunyai titan 20 (sampai lubang 3), deret 6
(F) adalah kontrol serum negatif, titarnya 0, sodangkan deret 7 (G) adalah kontrol
serum positif, titarnya 1280 HI (sampai lubang 9).
Tabel 1. Hasil pemeriksaan titer kekebalan serum ayam dari Peternakan
ayam asal Sukabumi
Peternakan
I
II
50
Sham
arm
ISABROWN
HUBBARD
Umw
(n*)
17
Jim,
Sampel
2,4
24
31
37
43
46
24
25
27
29
37
15
32
15
19
15
15
52
98
29
62
376
10
20
-
-
2
2
(0,53%)
Tita
40
2
9
11
(2,93%)
80
-
160
6
2
7
6
10
11
3
8
8
5
9
73
(19,42%)
1
1
5
6
18
36
(9,57%)
HI
320
18
8
24
19
11
37
84
24
24
254
(67,5596)
Tarr Tab- FuVtiondnonPenf 2000
Serum dimlai positif mempunyai kekebalan jika mempunyai titar minimum 5 HI. Dan
376 sampel serum yang dipenksa dart dua peternakan (Tabel 1) membenkan hash sbb
titan 20 = 2 sampel (0,53 %), titan 40 = 11 sampel (2,93 %), titan 80 = 36 sampel (9, 57
%), titan 160 = 73 sampel (19,42 %) dam titan 320 = 254 sampel (67,55 %).
KESU"ULAN
1. Sel darah mesh ayam yang difiksasi dengan glutaraldehida dapat dip" untuk
mendeteksi titan kekebalan H paraga1lina»rm dari serum Warn.
2. Semua serum yang dipenksa mempmyai titan kekebalan (antibodi) cukup bai7k
(tingp), sehmgga keommgbnan besar ayam to seb t tahan terhadap serangan
penyakit jika teriadi wabah peayakit soot.
UCAPAN TERIMA KASIR
Pada kesempatan ini pemilis mengucapkan terima kasih kepada 1bu SRI
POERNOMO, BSc. atasbimbingannya sehingga tulisan ini bisa disajikan.
DAFI'AR BACAAN
KATO K, H. TSUBAHARA and S. OKUMA, 1965 . Ifffectious OOFM of chickens VI.
Hernaggiutinating properties of Haemophilus gallinarum. Jpn. J. Vet. Sci
27; 457 .
KUME K, SAWATA- A and NAKASE Y, 1980. Immunologigicc relationships between
Page's and Sawata's serotype strains of Haemophilus Paragallinarirm.
Am. J. Vet. Res 41 :757-760.
PAGE L. A, 1962. Haemophilus infectious in.ochickens I. Characieristik of 12
Haemophilus isolates recovered from diseased chickens. Am. J.Vet. Res
23, 85-95 .
RB4LER RB. 1979. Studies of the pathogenic avian Haemophili. Avian Deseases, 24
(4) : 1006-1018 .
SAWATA A. K. KUME and Y. NAKASE, 1982. Hemaglutinin of Hca mophilus
paragallinarum seroptype 2 organisms occurrence and immunologic
properties of hemagglutinin. Am . J. Vet. Res 43 : 1311-1314 .
ed. Hofstad. M.S
YAMAMOTO R, 1984. Infectious coryza. In Deseases ojpoultry,
178-186.
et al (eds). Iowa State University Press. Ames. Iowa
e