uji efek antiinflamasi topikal ekstrak milk thistle
advertisement
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI UJI EFEK ANTIINFLAMASI TOPIKAL EKSTRAK MILK THISTLE ® PADA JUMLAH NEUTROFIL DAN EKSPRESI COX-2 MENCIT BETINA TERINDUKSI KARAGENIN SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Diajukan oleh : Sinta Atmi Utami NIM : 128114078 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016 i PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN “Ketika kau yakin dan percaya akan takdir dan ketentuan-Nya, lantas apa yang harus dirisaukan?”. “Wahai orang-orang yang beriman! Mohonlah pertolongan (kepada Allah) dengan sabar dan shalat. Sungguh, Allah beserta orang-orang yang sabar” (QS. Al-Baqarah : 153). “Ingatlah, hanya dengan mengingat Allah hati menjadi tentram” (QS. Ar-Ra’d : 28). “Cukuplah Allah (menjadi penolong) bagi kami dan Dia sebaik-baik pelindung” (QS. Ali- ‘Imran : 173). Skripsi ini saya persembahkan untuk : Tuhan Yang Maha Esa Allah SWT, Kedua orang tua saya, saudara-saudara saya, para sahabat dan almamater iii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN “Ketika kau yakin dan percaya akan takdir dan ketentuan-Nya, lantas apa yang harus dirisaukan?”. “Wahai orang-orang yang beriman! Mohonlah pertolongan (kepada Allah) dengan sabar dan shalat. Sungguh, Allah beserta orang-orang yang sabar” (QS. Al-Baqarah : 153). “Ingatlah, hanya dengan mengingat Allah hati menjadi tentram” (QS. Ar-Ra’d : 28). “Cukuplah Allah (menjadi penolong) bagi kami dan Dia sebaik-baik pelindung” (QS. Ali- ‘Imran : 173). Skripsi ini saya persembahkan untuk : Tuhan Yang Maha Esa Allah SWT, Kedua orang tua saya, saudara-saudara saya, para sahabat dan almamater iv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI v PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI vi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala berkat, rahmat, dan kurnia-Nya yang telah dilimpahkan, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Efek Antiinflamasi Topikal ® Ekstrak Milk Thistle pada Jumlah Neutrofil dan Ekspresi COX-2 Mencit Betina Terinduksi Karagenin”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penyusunan skripsi telah banyak melibatkan berbagai pihak baik langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan terimakasih kepada : 1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Ibu drh. Sitarina Widyarini, MP. PhD., selaku pembimbing utama atas segala motivasi dan kesabaran dalam membimbing, mendukung, dan membantu penulisan dari awal hingga skripsi ini dapat terselesaikan. 3. Bapak Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. selaku dosen pembimbing kedua atas segala kesabaran untuk membimbing dan membantu penulis dalam menyusun skripsi ini. 4. Ibu Phebe Hendra, M.Si.,Ph.D.,Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun. vii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun. 6. Staf laboratorium, Bapak Heru Purwanto, Mas Kayatno, serta laboran lainnya yang telah membimbing dan membantu penulis dalam penelitian di laboratorium. 7. Kedua orang tua, Ngadiran dan Sudiyem yang selalu memberi doa, dukungan, motivasi, dan kasih sayang. Hal tersebut memicu saya menjadi semangat dan kuat sehingga penulis bisa menyelesaikan skripsi ini. 8. Saudara saya, Ria Andriani yang senantiasa memberikan doa dan semangat kepada penulis. 9. Dubhe Fajar Shidiq yang selalu menjadi motivasi dan penyemangat penulis untuk menyelesaikan skripsi ini. 10. Teman-teman seperjuangan dalam penelitian : Monika Febrianti, Dui Sostales, F.X. Rury Henggar, Kathrin Cinthika, dan Farra Ayu Efriyanti atas kerja sama, kebersamaan, bantuan, dan perjuangan selama penelitian ini berlangsung. 11. Sahabat-sahabat penulis, Citra, Dorry, Teguh, Rara, Ghea, Akbar, Linda, Ope, Iwat, Putri, Nova dan Nonik yang selama ini selalu memulihkan semangat saya, tempat berkeluh kesah, berbagi canda tawa, senang dan sedih. Terimakasih dukungan dan doanya. 12. Teman-teman FSM B dan FKK A angkatan 2012 atas kebersamaan selama ini. viii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ......................................................................... i PERSETUJUAN PEMBIMBINGAN ............................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ........................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN........................................................ iv SURAT PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ........................ v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................... vi PRAKATA ........................................................................................ vii DAFTAR ISI ..................................................................................... x DAFTAR TABEL ............................................................................. xiii DAFTAR GAMBAR ........................................................................ xiv DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................... xvi INTISARI .......................................................................................... xviii ABSTRACT ........................................................................................ xix BAB 1 PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah .............................................................. 1 1. Rumus masalah ..................................................................... 5 2. Keaslian penelitian ................................................................ 5 ix PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ......................................................................... i PERSETUJUAN PEMBIMBINGAN ............................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ........................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN........................................................ iv SURAT PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ........................ v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................... vi PRAKATA ........................................................................................ vii DAFTAR ISI ..................................................................................... x DAFTAR TABEL ............................................................................. xiii DAFTAR GAMBAR ........................................................................ xiv DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................... xvi INTISARI .......................................................................................... xviii ABSTRACT ........................................................................................ xix BAB 1 PENDAHULUAN B. Latar Belakang Masalah .............................................................. 1 3. Rumus masalah ..................................................................... 5 4. Keaslian penelitian ................................................................ 5 5. Manfaat penelitian ................................................................. 7 C. Tujuan Penelitian ........................................................................ 7 x PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Milk Thistle .................................................................. 8 1. Klasifikasi Tanaman.............................................................. 8 2. Sinonim ................................................................................. 9 3. Nama Umum ......................................................................... 9 4. Penyebaran ............................................................................ 9 5. Morfologi .............................................................................. 10 6. Kegunaan............................................................................... 10 7. Kandungan Kimia ................................................................. 11 B. Kulit ............................................................................................ 12 C. Inflamasi ...................................................................................... 13 D. Antiinflamasi ............................................................................... 18 E. Karagenin .................................................................................... 21 F. Biocream® .................................................................................. 21 G. Hidrokortison Asetat ................................................................... 22 H. Landasan Teori ............................................................................ 23 I. Hipotesis...................................................................................... 24 BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................. 25 B. Variabel penelitian dan Definisi Operasional ............................. 25 1. Variabel penelitian ................................................................ 25 2. Skala Variabel ....................................................................... 26 3. Definisi Operasional.............................................................. 26 xi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI C. Bahan Penelitian.......................................................................... 28 D. Alat Penelitian dan Instrumen Penelitian .................................... 29 E. Tata Cara Penelitian .................................................................... 30 F. Tata Cara Analisis Hasil.............................................................. 33 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Ekstrak Milk Thistle ....................................................................... 35 B. Uji Orientasi Karagenin .............................................................. 36 C. Hasil Pengujian Efek Antiinflamasi Topikal Ekstrak Milk Thistle Terhadap Jumlah Sel Neutrofil ................................................................... 38 D. Hasil Persen (%) Penghambatan Ekspresi COX-2 Ekstrak Milk Thistle Dengan Metode Imunohistokimia Dengan Antibodi Anti- COX-2 ..................................................................................................... 48 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan ................................................................................. 60 B. Saran ............................................................................................ 60 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................... 61 LAMPIRAN ...................................................................................... 65 BIOGRAFI PENULIS ...................................................................... 109 xii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Hasil rerata jumlah sel neutrofil pada setiap kelompok perlakuan ..................................................................................................... 43 Tabel 2. Hasil uji Scheffe aktivitas efek antiinflamasi pada mencit setelah pemberian ekstrak Milk Thistle secara topikal ........................................ 46 Tabel 3. Rerata persen penghambatan ekspresi COX-2 pada kelompok perlakuan beserta kontrol ........................................................................ xiii 53 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Tanaman Milk Thistle ............................................................ 8 Gambar 2. Struktur utama Milk Thistle ................................................... 11 Gambar 3. Struktur lapisan kulit ............................................................. 13 Gambar 4. Pembentukan metabolit asam arakidonat dan peranan dalam inflamasi ....................................................................................... 16 Gambar 5. Skema biosintesis prostaglandin dan tempat obat-obat antiinflamasi non steroid bekerja ............................................................ 20 Gambar 6. Kurva grafik peningkatan tebal lipat kulit selama enam jam ................................................................................................. 37 Gambar 7. Mikrofotografi pengecatan HE kulit normal, perlakuan ekstrak Milk Thistle konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit (tanda lingkaran kuning) ............... 41 Gambar 8. Diagram batang aktivitas efek antiinflamasi pada mencit setelah pemberian ekstrak etanol buah Sylibum marianum L.Gaertn secara topikal...................................................................................................... 44 Gambar 9.Mikrofotografi pengecatan immunositokimia terhadap COX-2 pada sel neutrofil (tanda lingkaran kuning) di daerah subkutan jaringan kulit mencit di bawah mikroskop binokuler pada perbesaran 100 kali (1) dan 400 kali (2). Tanda panah kuning menunjukkan hasil positif COX-2, tanda panah merah menunjukkan hasil negatif COX-2 .......................... xiv 50 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Gambar 10.Mikrofotografi pengecatan Immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 kulit normal, perlakuan ekstrak Milk Thistle konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit (tanda lingkaran kuning). .................................................................................. Gambar 11. Diagram % penghambatan ekspresi COX-2 52 antar tiap kelompok perlakuan dan kontrol............................................................. 56 Gambar 12.Target flavonoid dalam memodulasi respon inflamasi melalui jalur asam arakidonat dan protein kinase yang mengatur faktor-faktor transkripsi seperti CREB, AP-1, NF-κB, dan C/EBP yang memodulasi ekspresi penanda pro-inflamasi seperti COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β, dan IL-6 ................................................................................................... xv 58 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian .............. 66 Lampiran 2. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ...................... 68 Lampiran 3. Pemotongan kulit untuk histopatologi ................................ 70 ® Lampiran 4. Ekstrak Millk Thistle . ....................................................... 72 Lampiran 5. Surat Ethical Clearence ...................................................... 73 Lampiran 6. Data tebal lipat kulit dalam uji pendahuluan karagenin ..... 74 Lampiran 7. Data rata-rata perhitungan jumlah neutrofil ....................... 74 Lampiran 8. Data rerata persen penghambatan inflamasi dalam penekanan COX-2 .................................................................................................... 76 Lampiran 9. Hasil analisis statistik perhitungan rata-rata jumlah sel-sel neutrofil pada masing-masing kelompok ............................................................... 83 Lampiran 10. Hasil analisis statistik uji normalitas dengan uji Shapiro-Wilk ........................................................................................... 86 Lampiran 11. Hasil pengujian ANOVA .................................................. 87 Lampiran 12. Hasil pengujian uji Post-Hoct dengan uji Scheffe ............ 88 Lampiran 13. Perhitungan persen penghambatan inflamasi ekspresi COX-2 ..................................................................................................... 90 Lampiran 14. Hasil uji normalitas dengan Shapiro-Wilk ........................ 91 Lampiran 15. Hasil perhitungan rata-rata persen penghambatan Inflamasi .................................................................................................. 91 Lampiran 16. Hasil pengujian Kruskal-Wallis ........................................ 94 xvi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 17. Hasil pengujian Mann-Whitney Test................................. xvii 95 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI INTISARI Inflamasi merupakan suatu mekanisme untuk melindungi tubuh dari gangguan luar atau infeksi. Secara makroskopis tanda-tanda pokok terjadinya inflamasi antara lain rubor (kemerahan), kalor (panas), dolor (nyeri), dan tumor (pembengkakan).Inflamasi dapat diatasi menggunakan obat modern maupun tradisional, salah satu tumbuhan yang secara empirik digunakan untuk antiinflamasi adalah ekstrak Milk Thistle (Silybum marianum L.). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak Milk Thistle (Silybum marianum L.) mempunyai efek antiinflamasi yang diberikan secara topikal pada mencit yang diinduksi karagenin. Penelitian ini dilakukan pada mencit yang berumur 6-8 minggu dengan beratbadan 20-25 gram. Hewan uji dibagi menjadi 6 kelompok yaitu kelompok kontrol negatif karagenin 3%, control basis Biocream®, kelompok kontrol positif Hidrokortison asetat, dan kelompok perlakuan krim ekstak Milk Thistle 1,67; 2,5; 3,75% B/B. Penelitian ini termasuk kedalam penelitian murni rancangan acak lengkap pola searah. Punggung hewan uji diinduksi karagenin setelah dibersihkan kemudian krim dioleskan. Pemotongan kulit hewan uji dilakukan pada 24 jam setelah perlakuan. Kulit hewan uji diawetkan mengunakan larutan fiksatif, yaitu larutan formalin 10%. Sel neutrofil yang bermigrasi di daerah subkutan diamati menggunakan metode pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan dilanjutkan dengan uji persen penekanan ekspresi siklooksigenase (COX) 2 dengan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 200x. Data yang diperoleh dianalisis mengunakan uji Shapiro Wilk, dilanjutkan uji non parametrik Kruskal Wallis dengan Post Hoc Test menggunakan uji Mann Whitney. Hasil penelitian menunjukan bahwa ekstak Milk Thistle mempunyai efek antiinflamasi topikal. Konsentrasi optimum yang menunjukan adanya efek antiinflamasi topikal sebesar 3,75%. Persen (%) besar rerata jumlah neutrofil dari ekstrak Milk Thistle pada konsentrasi 1,67; 2,5; 3,75% berturut-turut adalah 77,84; 61,64; 42,32. Pada konsentrasi yang sama memberikan persen (%) penghambatan ekspresi enzim COX-2 berturut-turut adalah 11,56 ; 13,96 dan 8,48 lebih besar dibandingkan dengan kontrol negatif (karagenin), yaitu 1,45. Kata kunci : Milk Thistle, antiinflamasi, karagenin xviii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT Inflammatory is a mechanism for the protection of the body from disturbance outside or infection. In makroskopis basic signs the inflammatory among others rubor (reddish), heat engine (heat), dolor (pain) , and tumor (swelling). Inflammatory insurmountable the use of drugs modern and traditional , one herbs that is empirical used to antiinflamasi is Milk Thistle (Silybum marianum L.). This study attempts to know whether extract Milk Thistle (Silybum marianum L.) have an effect antiinflamatory given topically on middorsal induced carragenane. The study is done at middorsal from 6-8 weeks with weight 20-25 grams .Animals divided into 6 group that is the control group negative carragenane 3 % , control the base biocream ® , the control group positive hidrokortison acetic , and the treatment group cream Milk Thistle extract 1.67 ; 2.5 ; 3.75 % b / b .This research are part research pure design random complete pattern in line. Backbone of an animal test induced carragenane after cleaned then cream smeared. Cutting animal skin test performed for 24 hours. Skin test animals preserved using a fixative solution, 10% formalin solution. The neutrophils migration was observed using Hematoxylin and Eosin (HE) Staining Method. And than Immunohistochemical Method using antibody anti cyclooxygenase-2’sobserved suppress the expression of cyclooxygenase 2 (COX-2) with a microscope light with event 200x. These data were analyzed using Shapiro-Wilk test, continued by Kruskal–Wallis test and Post Hoc test by Mann Whitney test. The results of the study showed that Milk Thistle extract has topical antiinflammatory effect. The optimum concentration showed a topical antiinflamatory effect of 3.75 %. Percent ( % ) duration of mean neutrophil of Milk Thistle extract on concentration 1.67 ; 2.5 ; 3.75 % is 77.84; 61.64; 42.32. And the suppression expression of COX-2 activity of (in %) 11.56; 13.96 and 8.48 respectively. They are higher than negative control group (carrageenan) at 1.45%. Keywords: Milk Thistle, antiinflamatory, carragenane xix PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB 1 PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Inflamasi merupakan respon terhadap cedera jaringan dan infeksi. Saat proses inflamasi berlangsung, terjadi reaksi vascular di mana cairan, elemen-elemen darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada tempat cedera jaringan atau infeksi. Proses inflamasi dimana tubuh berusaha untuk menetralisir dan membasmi agen-agen yang berbahaya pada tempat cedera dan untuk mempersiapkan keadaan untuk memperbaiki jaringan. Berbagai mediator kimia dilepaskan selama proses inflamasi (Kee dan Hayes,1996). Tanda-tanda utama inflamasi yaitu eritema (kemerahan), terjadi pada tahap pertama dari inflamasi. Darah berkumpul pada daerah cedera jaringan akibat pelepasan mediator kimia tubuh (kinin, prostaglandin, dan histamin) histamin mendilatasi arteriol. Kedua adalah edema (pembengkakan), merupakan tahap kedua dari inflamasi. Plasma merembes ke dalam jaringan intestinal pada tempat cedera. Kinin mendilatasi asteriol, meningkatkan permeabilitas kapiler. Ketiga adalah panas, disebabkan oleh bertambahnya pengumpulan darah. Dan dapat disebabkan dari pirogen (substansi yang menimbulkan demam) yang mengganggu pusat pengaturan panas pada hipotalamus. Nyeri, disebabkan oleh pembengkakan pada pelepasan mediator-mediator kimia. Hilangnya fungsi, disebabkan oleh penumpukan cairan pada tempat cedera jaringan dan karena rasa nyeri. Keduanya mengurangi mobilitas pada daerah yang terkena (Kee dan Hayes, 1996). 1 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2 Antiinflamasi adalah sebutan untuk agen/obat yang bekerja melawan atau menekan proses peradangan (Dorlan, 2002). Rute pemberian obat menentukan jumlah dan kecepatan obat yang masuk kedalam tubuh, sehingga merupakan penentu keberhasilan terapi atau kemungkinan timbulnya efek yang merugikan. Rute pemberian obat dibagi 2, yaitu enternal dan parenteral. Rute pemberian secara parenteral dalam hal ini adalah topikal mempunyai keuntungan tidak sukar dalam pemakaian, tidak perlu steril, penyerapan (absorbsi) cepat dan bisa digunakan untuk pasien yang sadar maupun tidak sadar dan bisa digunakan secara terus menerus walaupun pasien dalam keadaan tidak sadar. Penggunaan anttiinflamasi topikal semakin banyak dicari terkait keuntungan penggunaan sediaan topikal yang dapat mempercepat aksi obat ditempat kerja karena tidak melalui sistem percernaan dan menghindari rusaknya zat aktif disebabkan oleh aktifitas enzim dan interaksi dengan makanan pada terapi antiinflamasi secara oral. Sedangkan pemberian obat secara oral atau melalui gastrointestinal (GI) mempunyai kekurangan tidak dapat digunakan pada pasien yang tidak sadar dan penyerapan dalam tubuh yang tergolong lambat (Priyanto, 2008). Maka dalam penelitian ini penulis menggunakan sediaan topikal mengingat kelebihan yang dimiliki olah sediaan tersebut. Indonesia dikenal mempunyai keanekaragaman hayati (biodiversity) yang terbesar di dunia yang terdiri dari tumbuhan tropis dan biota laut. Di wilayah Indonesia terdapat sekitar 30.000 jenis tumbuhan dan 7.000 di antaranya diduga memiiliki khasiat sebagai obat. Sekitar 90% tumbuhan obat di kawasan Asia, tumbuh di Indonesia. Di negara-negara maju, biodiversity prospecting yaitu PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 3 upaya pencarian sumber daya hayati yang mempunyai potensi untuk masa depan, terus digiatkan termasuk penelitian berbagai tumbuhan sebagai sumber bahan obat. Oleh karena itu akan didapatkan informasi dari tumbuhan yang bisa membantu dalam penggunaan yang optimal (Sampurno, 2007). Informasi yang sudah didapatkan nantinya akan membantu masyarakat dalam memilih obat tradisional atau tanaman obat dalam upaya kesehatan. Pada penggunaan produk dari bahan alam ini cenderung mengalami peningkatan. Obat tradisional dan tanaman obat sudah banyak digunakan oleh masyarakat, baik dalam upaya preventif, rehabilitatif maupun promotif. Anggapan lain dari masyarakat yang memacu meningkatnya penggunaan obat tradisional dan tanaman obat adalah penggunaan yang relatif aman dibandingkan dengan obat sintetis yang umum dijual. Salah satu tanaman obat adalah Milk Thistle atau Silybum marianum (L.). Menurut penelitian yang dilakukan oleh Sonnenbichler et al. (1999) bagian yang diteliti dari tanaman Milk Thistle antara lain buah, daun, dan biji. Bagian tanaman tersebut mengandung silymarin dimana silybin merupakan zat yang paling aktif secara biologis konstituen. Efek yang ditunjukkan oleh tanaman ini adalah penghambatan migrasi sel netrofil, penghambatan sel Kupffer, menghambatan sintesis leukotrien, dan menghambat pembentukan prostaglandin. Dehmlow et al. (1996) melaporkan bahwa mekanisme aktivitas antiinflamasi dari tanaman Milk Thistle dilakukan dengan menghambat pembentukan hidrogen peroksida. Efek silybin yang terkandung pada daun dilaporkan dapat menghambat sintesis leukotrien B4. Namun tidak berpengaruh pada pembentukan prostaglandin E2. Menurut penelitian yang dilakukan Balian et al. (2006) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 4 melaporkan bahwa aktivitas antiinflamasi dalam ekstrak Milk Thistle dalam pengujiannya dilakukan pada tikus albino. Pemberian peroral ekstrak Milk Thistle menunjukan adanya aktivitas antiinflamasi pada tikus yang terinduksi karagenin 1% secara subkutan pada punggung tikus. Tanaman Milk Thistle telah terbukti memiliki efek antiinflmasi yang spesifik untuk inflamasi akut. Silymarin yang merupakan ekstrak bioaktif Milk Thistle mengandung flavonolignans seperti silychristin, isosilychristin, silydianinsilybin A dan B, isosilybin A dan B. serta asam 35% lemak, flavonoid dan polifenol. Untuk menguji adanya efek antiinflamasi Milk Thistle diuji dengan mengekstraksi pada 96% etanol, dan adanya aktivitas penangkapan radikal bebas dalam DPPH (2,2difenil-1-pycryl-hydrazyl). Ekstrak tanaman ini menunjukkan aktivitas hepatoprotektif pada tikus yang terinduksi parasetamol (Hadaruga et al.,2009). Mekanisme aktifitas antiinflamasi dari tanaman Milk Thistle dilakukan dengan menghambat pembentukan hydrogen peroksida. Efek silybin yang terkandung pada daun, buah dan biji Milk Thistle menghambat sintesis leukotrien B4 (IC50 15umol / l) pada tikus terisolasi sel Kupffer. Ditemukan pada konsentrasi 100 umol/1 namun tidak berpengaruh pada pembentukan prostaglandin E2 (Dehmlow et al., 1996). Penelitian ini menggunakan pengamatan secara kualitatif dan kuantitatif. Kualitatif dengan melakukan pengamatan histopatologi kulit punggu mencit yang diinduksikan karagenin secara subkutan, sedangkan kuantitatif dengan menghitung jumlah sel neutrofil dan ekspresi COX-2. Pengamatan histopatologi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5 berguna untuk mendeteksi adanya komponen patogen yang bersifat infektif. Pemeriksaan ini dilakukan melalui pemeriksaan terhadap perubahan-perubahan abnormal pada tingkat jaringan. Pemeriksaan ini juga bertujuan untuk memeriksa penyakit atau dalam hal ini adalah mendiagnosa penyakit dilihat dari kondisi jaringan (Harmita, 2006). Sejauh pengamatan yang dilakukan penulis terkait penelitian tentang efek antiinflamasi topikal ekstrak Milk Thistle yang terinduksi karagenin 3% secara subkutan yang didukung hasil pengamatan kualitatif histopatologi kulit mencit dan secara kuantitatif dengan menghitung jumlah netrofil pada kulit mencit yang mengalami peradangan belum pernah dilaporkan. 1. Rumusan masalah Berdasarkan beberapa uraian yang sudah disampaikan diatas, rumusan masalah yang akan diteliti dalam penelitian ini adalah: a. Apakah ekstrak Milk Thistle memiliki aktifitas antiinflamasi topikal pada mencit betina yang diinduksi karagenin 3%? b. Bagaimana aktifitas antiinflamasi topikal yang dilihat dari besar rerata jumlah sel neutrofil ekstrak Milk Thistle pada mencit betina yang diinduksi karagenin 3% ? c. Bagaimana aktifitas antiinflamasi topikal yang dilihat dari persen penghambatan ekspesi COX-2 ekstrak Milk Thistle pada mencit betina yang diinduksi karagenin 3%? PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 6 2. Keaslian penelitian Menurut penelitian yang dilakukan oleh Sonnenbichler et al. (1999) bagian yang diteliti dari tanaman Milk Thistle antara lain buah, daun, dan biji. Bagian tanaman tersebut mengandung silymarin di mana silybin merupakan zat yang paling aktif secara biologis konstituen. Dehmlow et al. (1996) melaporkan bahwa mekanisme aktifitas antiinflamasi dari tanaman Milk Thistle dilakukan dengan menghambat pembentukan hydrogen peroksida. Efek silybin yang terkandung pada daun Milk Thistle menghambat sintesis leukotrien B4 pada tikus terisolasi sel Kupffer, namun tidak berpengaruh pada pembentukan prostaglandin E2. Menurut penelitian yang dilakukan Balian et al. (2006) bahwa aktivitas antiinflamasi dalam ekstrak etanol dari daun Milk Thistle dalam pengujiannya dilakukan pada tikus albino. Tanaman Milk Thistle telah terbukti memiliki efek antiinflmasi yang spesifik untuk inflamasi akut. Silymarin yang merupakan ekstrak bioaktif Silybum marianum L. mengandung flavonolignans seperti silychristin, isosilychristin, silydianinsilybin A dan B, isosilybin A dan B. Serta asam, 35% lemak, flavonoid dan polifenol. Untuk menguji adanya efek antiinflamasi Milk Thistle diuji dengan mengekstraksi pada 96% etanol, dan adanya aktivitas penangkapan radikal bebas dalam DPPH (2,2-difenil-1-pycryl-hydrazyl). Ekstrak tanaman ini menunjukan aktivitas hepatoprotektif pada tikus yang terinduksi parasetamol (Hadaruga et al.,2009) Penelitian yang dilakukan oleh Balian et al. (2006) pemberian ekstrak daun Silybum marianum L. menunjukan adanya aktivitas antiinflamasi pada tikus yang terinduksi karagenin 1% secara subkutan pada punggung tikus. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7 Sejauh penelusuran yang dilakukan penulis, penelitian terkait uji efek antiinflamasi topikal ekstrak Milk Thistle pada mencit betina terinduksi karagenin belum pernah dilakukan. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini dapat menambah informasi dan pengetahuan tentang efek antiinflamasi ekstrak Milk Thistle secara topikal. b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai pembuktian efek antiinflamasi dari ekstrak Milk Thistle sehingga dapat dijadikan alternatif untuk menggobati inflamasi. B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum Untuk mengetahui aktifitas antiinflamasi yang terdapat pada ekstrak Milk Thistle. 2. Tujuan khusus a. Untuk mengetahui aktifitas antiinflamasi pada ekstrak Milk Thistle secara topical pada mencit betina galur Swiss yang terinduksi karagenin 3%. b. Untuk mengetahui besar rerata jumlah sel neutrofil ekstrak Milk Thistle pada mencit betina terinduksi karagenin 3%. c. Untuk mengetahui persen penghambatan ekspresi COX-2 ekstrak Milk Thistle pada mencit betina terinduksi karagenin 3%. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Milk Thistle Gambar 1.Tanaman Milk Thistle (Sabil et al.,2014). 1. Klasifikasi Tanaman Domain : Eukaryota Kingdom : Plantae Subkingdom : Viridaeplantae Filum : Tracheophyta Subfilum : Euphyllophytina Infrafilum : Radiatopses Kelas : Magnoliopsida Sub Kelas : Asteridae Superorder : Asteranae Order : Asterales Famili : Asteraceae Genus : Silybum Spesies : Silybum marianum(L.) Gaertn (Sabiret al.,2014) 8 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 9 2. Sinonim holy thistle, marian thistle, mary thistle, milk thistle, our lady’s thistle, St. mary thistle, wild artichoke, marien distel, chardon-marie (Peirce, 1999). 3. Nama Umum Belanda : Mariendistel, vrouwendistel Inggris : thistle Lady, milk thistle Perancis : Artichautsauvage, chardon marie Jerman : Feedistel, mariendistel, silberdistel Yunani : Silybon Italia : Cardodel latte, Cardomariano Malta : thistle Blessed Rumania : Armurariu Rusia : Ostropestro Spanyol : Cardolechal, Cardolechero Swedia : Sempertin (Kirtikar et al., 2006) 4. Penyebaran Milk Thistle memiliki sejarah yang panjang dan penting dalam pengobatan herbal lebih dari 2.000 tahun dalam tradisi herbal Eropa.Tanaman ini tersebar luas di Amerika Selatan dan Amerika Utara di timur Amerika Serikat dan Caifornia (Peirce, 1999). Di Austria (wilayah Waldviertel), Jerman, Hungaria, Polandia, PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 10 Cina dan Argentina perkembangan Milk Thistle ini digunakan pada bidang farmasi (Bisset,1994). 5. Morfologi Milk Thistlemerupakan tanaman yang tingginya 5 sampai 10 kaki dengan tinggi batang 20-150 cm. Sedikit berbulu halus dan pada bagian atasnya bercabang. Tanaman ini memiliki akar tunggang dan terkadang berserat (Kumar Takeshwar et al.,2011). Memiliki daun yang besar, pada tepi daun berduri dan bergaris, berwarna putih berurat dan berbulu.Tanaman Milk Thistlememiliki buah yang berkulit keras dengan panjang 6-8 mm yang terdapat pada bunga, yang dikenal secara teknis sebagai achenes, menyerupai biji dan umumnya brwarna coklat.Milk Thistle memiliki bunga capitula besar dan bulat, dan setiap pucuk batang atau cabang memiliki satu bunga (Peirce, 1999). 6. Kegunaan Menurut Balianet al. (2006) Milk Thistlemerupakan tanaman obat yang bisa digunakan sebagai antioksidan, antiinflamasi, hepatoprotektif, antikanker, dan antidiabetes.Kandungan dari tanaman ini yang dilaporkan Hadaruga et al. (2009) mengandung flavonolignan Silymarin, yang memiliki aktivitas antioksidan dengan menangkap radikal bebas, antiinflamasi, efek antiimunomodulator dan antikanker. Di Eropa tanaman MilkThistledigunakan untuk mengobati hepatitis dan kerusakan pada hati yang diakibatkan karena keracunan alcohol dan keracunan oleh beberapa jenis jamur. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 11 7. Kandungan Kimia Silymarin merupakan ekstrak bioaktif dari biji Silybum marianum L. (Asteraceae) mengandung 65-85%flavonolignans (Silymarin) seperti silychristin, isosilychristin, silydianin, silybin A dan B, isosilybin A dan B, dan juga 20-35% asam lemak, flavonoid, stimulan metabolik dan polifenol lainnya.Selain mengandung flavolignans (silymarin) tanaman Milk Thistlejuga mengandung tyramine, histamine, asam linoleat gamma, dan minyak esensial (Hadaruga et al.,2009). Sumber utama dari Milk Thistleadalah buah-buahan dan biji-bijian dari tanaman ini, namun kandungan lain terdapat pada semua bagian tanaman. Senyawa alami, silybin adalah campuran dari dua diastereomer dengan rasio 1:1 yaitu silybin A/B (2R, 3R) -3,5,7-trihidroksi-2 - [(2R, 3R / 2S, 3S) -3- (4hidroksin 3-metoksifenil) -2-hidroksimetil-2,3-dihidro-1,4benzodioxin-6-il] chroman-4-satu. Gambar 2.Struktur utama Milk Thistle(Hadaruga et al., 2009). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 12 B. Kulit Kulit merupakan pembungkus yang elastis yang terletak paling luar yang melindungi tubuh dari pengaruh lingkungan hidup manusia dan merupakan alat tubuh yang terberat dan terluas ukurannya, yaitu kirakira 15% dari berat tubuh dan luas kulit orang dewasa 1,5 m 2 . Kulit sangat kompleks, elastis dan sensitif, serta sangat bervariasi pada keadaan iklim, umur, seks, ras, dan juga bergantung pada lokasi tubuh serta memiliki variasi mengenai lembut, tipis, dan tebalnya.Rata-rata tebal kulit 1-2m. Paling tebal (6 mm) terdapat di telapak tangan dan kaki dan paling tipis (0,5 mm) terdapat di penis. Kulit merupakan organ yang vital dan esensial serta merupakan cermin kesehatan dan kehidupan (Djuanda, 2007). Pembagian kulit secara garis besar tersusun atas tiga lapisan utama, yaitu lapisan epidermis, dermis, subkutis (Djuanda, 2007).Lapisan epidermis terdiri dari stratum korneum (lapisan tanduk) merupakan lapisan kulit yang terluar dan terdiri atas sel-sel gepeng yang mati, tidak berinti, dan keratin.Stratum lusidum merupakan lapisan sel-sel gepeng tanpa inti dengan protoplasma yang telah menjadi protein.Stratum granulosum (lapisan keratohialin) yaitu dua atau tiga lapis sel-sel gepeng dengan sitoplasma butir kasar dan berinti di antaranya. Stratum spinosum (stratum Malphigi) terdiri atas beberapa lapis sel yang berbentuk poligonal dengan besar yang berbeda akibat adanya proses mitosis. Stratum basale terbentuk oleh sel-sel berbentuk kubus (kolumnar) yang tersusun vertikal dan berbaris seperti pagar (palisade). Selanjutnya adalah lapisan dermis berada di bawah lapisan epidermis dan lebih tebal daripada lapisan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 13 epidermis.Terdiri dari lapisan elastik dan fibrosa padat dengan elemen-elemen selular dan folikel rambut (Djuanda, 2007). Lapisan subkutis adalah kelanjutan dermis yang terdiri atas jaringan ikat longgar berisi sel lemak.Lapisan sel-sel lemak disebut panikulus adiposa yang berfungsi sebagai cadangan makanan.Di lapisan ini terdapat ujung-ujung saraf tepi, pembuluh darah, dan getah bening (Wasitaatmadja, 2010). Struktur lapisan kulit dapat dilihat pada gambar 3. Gambar 3. Struktur lapisan kulit (Kee dan Hayes,1996). C. Inflamasi Inflamasi merupakan respon terhadap cedera jaringan dan infeksi. Saat proses inflamasi berlangsung, terjadi reaksi vascular di mana cairan, elemen-elemen darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada tempat cedera jaringan atau infeksi. Proses inflamasi dimana tubuh berusaha untuk menetralisir dan membasmi agen-agen yang berbahaya pada tempat cedera dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 14 untuk mempersiapkan keadaan untuk memperbaiki jaringan. Berbagai mediator kimia dilepaskan selama proses inflamasi (Kee dan Hayes,1996). Tanda-tanda utama inflamasi yaitu eritema (kemerahan), terjadi pada tahap pertama dari inflamasi.Darah berkumpul pada daerah cedera jaringan akibat pelepasan mediator kimia tubuh (kinin, prostaglandin, dan histamin) histamin mendilatasi arteriol.Tahap kedua adalah edema (pembengkakan), merupakan tahap kedua dari inflamasi. Plasma merembes ke dalam jaringan intestinal pada tempat cedera.Kinin mendilatasi asteriol, meningkatkan permeabilitas kapiler.Tahap ketiga adalah panas, disebabkan oleh bertambahnya pengumpulan darah. Dapat disebabkan dari pirogen (substansi yang menimbulkan demam) yang mengganggu pusat pengaturan panas pada hipotalamus.Nyeri, disebabkan oleh pembengkakan pada pelepasan mediator-mediator kimia.Hilangnya fungsi, disebabkan oleh penumpukan cairan pada tempat cedera jaringan dan karena rasa nyeri.Keduanya mengurangi mobilitas pada daerah yang terkena (Kee dan Hayes, 1996). Inflamasi terbagi menjadi 3 fase yaitu inflamasi akut, respon imun dan inflamasi kronis. Inflamasi akut merupakan respon awal terhadap cedera jaringan hal tersebut terjadi melalui media rilisnya autacoid yang terlibat antara lain histamin, serotonin, bradikinin, prostaglandin dan leukotrien. Respon imun terjadi bila sejumlah sel yang mampu menimbulkan kekebalan diaktifkan untuk merespon organisme asing atau substansi antigenik yang terlepas selama respon terhadap inflamasi akut serta kronis. Akibat respon imun bagi tuan rumah mungkin menguntungkan, misalnya menyebabkan organisme penyerang PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 15 difagositosis atau dinetralisir. Sebaliknya akibat tersebut juga dapat bersifat merusak bila menjurus pada inflamasi kronis tanpa penguraian dari proses cedera yang mendasarinya. Inflamasi kronis menyebabkan keluarnya sejumlah mediator yang tidak menonjol dalam respon akut. Salah satu kondisi yang paling penting yang melibatkan mediator ini adalah artritis rheumatoid, dimana inflamasi kronis menyebabkan sakit dan kerusakan pada tulang dan tulang rawan yang bisa menjurus pada ketidakmampuan untuk bergerak (Katzung, 2002). Bila membran sel mengalami kerusakan oleh suatu rangsang kimiawi, fisik, atau mekanis, maka enzim fosfolipase diaktifkan untuk mengubah fosfolipida yang terdapat di situ menjadi asam arakidonat, kemudian untuk sebagian diubah oleh enzim cyclo-oxygenase menjadi asam endoperoksida dan seterusnya menjadi zat-zat prostaglandin. Bagian lain dari asam arakidonat diubah oleh enzym lipooksigenase menjadi zat leukotrien. Baik prostaglandin maupun leukotrien bertanggungjawab bagi sebagian besar dari gejala peradangan. Beberapa lipooksigenase mampu bekerja pada asam arakidonat untuk membentuk 5HPETE, 12-HPETE, dan 15-HPETE yang merupakan turunan dari peroksida yang tidak stabil, kemudian dikonversi menjadi turunan hidroksilasi yang sesuai (HETES) atau menjadi lipoksin atau leukotrien, hal ini tergantung pada jaringan. Cyclo-oxygenase terdiri dari 2 isoenzym yakni COX-1 dan COX-2. COX-1 terdapat di kebanyakan jaringan, antara lain di pelat-pelat darah, ginjal, dan saluran cerna. Zat ini berperan pada pemeliharaan perfusi ginjal, homeostase vaskuler, dan melindungi lambung dengan jalan membentuk bikarbonat dan lendir serta menghambat produksi asam. Enzim-enzim ini memiliki peran yaitu PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 16 mengubah asam arakidonat menjadi prostlagandin dan tromboksan. COX-2 dalam keadaan normal tidak terdapat di jaringan, tetapi dibentuk selama proses peradangan oleh sel-sel radang dan kadarnya dalam sel meningkat sampai 80 kali (Tjay dan Raharja, 2002). Proses pembentukan metabolit asam arakidonat dan peranan dalam inflamasi dapat dilihat pada gambar 4. Gambar 4. Pembentukan metabolit asam arakidonat dan peranan dalam inflamasi.(Robbins, 2004). Ketika melalui jalur sikloogsigenase akan dihasilkan prostaglandin D 2 (PGD2), Prostaglandin E2(PGE2), Prostaglandin F2α (PGF2α), Prostasiklin (PGI2) dan tromboksan A2(TXA2). Setiap produk yang dihasilkan berasal dari Prostaglandin H2(PGH2) yang dipengaruhi oleh kerja enzim yang spesifik. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 17 Prostaglandin H2(PGH2) adalah prekursor hasil akhir biologi aktif jalur siklooksigenase. Trombosit mengandung enzim tromboksan sintetase, produk utamanya adalah TXA2 yang merupakan agen agregasi trombosit yang kuat dan vasokonstriktor. Namun disisi lain endotelium mengalami kekurangan dalam tromboksan sintetase, tetapi kaya akan prostasiklin sintetase yang akan membentuk PGI2. PGI2adalah vasodilator serta penghambat agregasi trombosit. Prostaglandin E2(PGE2) menyebabkan kulit lebih sensitif terhadap rangsang yang menyakitkan. Sedangkan D2(PGD2) merupakan metabolit utama dari jalur siklooksigenase pada sel mast, nantinya akan menyebabkan vasodilatasi dan meningkatkan permeabilitas venula postcapillary. Kerja prostaglandin dalam hal ini bersama dengan PGE2dan PGF2α sehingga menyebabkan pembentukan edema. 5-lipoksigenase merupakan enzim metabolit asam arakidonat yang utama pada neutrofil. Enzim ini berada pada jalur lipoksigenase. Asam 5- hidroperoksieikosatetranoik atau 5-HPTE adalah derivat 5-hdroperoksi asam arakidonat dan direduksi menjadi asam 5-hidroksieikosatetraenoik (5-HETE) sebagai kemotaksis untuk neutrofil atau diubah menjadi leukotrien. Produk dari 5HPTE diantaranya leukotrien A4(LTA4), LTB4, LTC4, LTD4, LTE4, dan LTE5. Leukotrien B4(LTB4) adalah agen kemotaksis yang kuat dan dapat menyebabkan neutrofil mengalami agregasi. LTC4, LTD4, danLTE4menyebabkan bronkospasme, vasokonstriksi dan dapat meningkatkan permeabilitas vaskular (Kumar,2005). Pada jalur lipoksigenase yang disintesis menggunakan jalur transeluler juga menghasilkan lipoksin. Trombosit tidak dapat membentuk lipoksin A4(LXA4) dan lipoksin B4(LXB4), namun trombosit dapat membentuk metabolit PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 18 yang berasal dari intermediet LTA4dari neutrofil. Lipoksin memiliki aksi yang baik dan daya antiinflamasi misalnya LXA4dapat menyebabkan vasodilatasi dan antagonis vasokonstriksi yang distimulasi LTC4. Aktifitas lainnya mampu menghambat kemotaksis neutrofil dan perlekatan ketika menstimulasi perlekatan monosit (Robbins, 2004). D. Antiinflamasi Antiinflamasi adalah sebutan untuk agen/obat yang bekerja melawan ataumenekan proses peradangan (Dorlan, 2002). Terdapat tiga mekanisme yangdigunakan untuk menekan peradangan yaitu pertama penghambatan enzimsiklooksigenase. Siklooksigenase mengkatalisa sintetis pembawa pesan kimia yangpoten yang disebut prostaglandin, yang mengatur peradangan, suhu tubuh, analgesia,agregasi trombosit dan sejumlah proses lain. Mekanisme kedua untuk mengurangikeradangan melibatkan penghambatan fungsi-fungsi imun. Dalam proses peradangan,peran prostaglandin adalah untuk memanggil sistem imun. Infiltrasi jaringan lokaloleh sel imun dan pelepasan mediator kimia oleh selsel seperti itu menyebabkangejala peradangan (panas, kemerahan, nyeri). Mekanisme ketiga untuk mengobatiperadangan adalah mengantagonis efek kimia yang dilepaskan oleh sel-sel imun.Histamin, yang dilepaskan oleh sel mast dan basofil sebagai respon terhadap antigen,menyebabkan peradangan dan konstriksi bronkus dengan mengikat respon histaminpada sel-sel bronkus. Terdapat dua jalan untuk mengurangi peradangan secara farmakologi. Pendekatan yang pertama adalah kortikosteroid, dan yang kedua adalah penggunaan obat antiinflamasi non steroid (NSAID) (Olson, 2003). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 19 Obat-obat antiinflamasi non steroid (NSAID) merupakan suatu kelompok obat yang secara kimiawi berbeda aktivitas antiinflamasinya. Obat-obat ini bekerja dengan jalan menghambat enzim siklooksigenase tetapi tidak menghambat enzim lipooksigenase (Mycek, 2001). Walaupun demikian obat-obat ini memiliki banyak persamaan dalam efek terapi maupun efek samping (Wilmana, 1995). Antiinflamasi nonsteroid menghambat siklooksigenase yang mengubah asamarakidonat menjadi PGG2 dan PGH2, yang akan diubah menjadi tromboksan A2 (TXA2) dan bentuk prostaglandin lainnya. Dosis terapeutik NSAID menurunkan biosintesis prostaglandin dengan menghambat COX, dan terdapat korelasi antara potensi sebagai penghambat COX dan aktivitas antiinflamasi(Nogrady, 1992).NSAID biasanya diklasifikasikan sebagai analgesik ringan.Obat ini efektif ketika inflamasi menyebabkan sensitisasi pada reseptor nyeri karena stimulus kimia atau mekanik.Nyeri yang menyertai inflamasi dan kerusakan jaringan dapat berasal dari stimulus lokal dari jaringan yang rusak dan meningkatkan sensitivitas nyeri (hiperalgesia), sebagai konsekuensi dari peningkatan rangsangan dari neuron di medula spinalis. Kapasitas prostaglandin untuk membuat reseptor nyeri peka terhadap stimulasi mekanik dan kimia berasal dari penurunan ambang pada nosiseptor fiber C. Umumnya, NSAID tidak memiliki efek langsung terhadap nyeri, karena kerja obat ini adalah dengan menghambat biosintesis prostaglandin (Brunton et al., 2008).Ada tujuh kelompok NSAID yaitu derivat salisilat, derivat asam para klorobenzoat atau indol, derivat pirazolon, derivat asam propionat, derivat fenamat, derifat oksikam, derivat asam fenilasetat (Kee dan Hayes, 1996). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 20 Golongan steroid bekerja dengan cara menghambat pelepasan prostaglandin melalui penghambatan metabolisme asam arakidonat. Dalam klinik umumnya kortikosteroid dibedakan menjadi 2 golongan besar, yaitu glukokortikoid dan mineralokortikoid. Efek terapeutik glukokortikoid yang paling penting adalah kemampuannya untuk mengurangi respon peradangan secara dramatis. Efek ini didapat dari proses penurunan dan penghambatan limfosit serta makrofag perifer A2 secara tidak langsung yang menghambat pelepasan asam arakidonat, prekursor prostaglandin dan leukotrien (Mycek, 2001). Setelah pemberian dosis tunggal glukokortikoid bekerja singkat dengan konsentrasi neutrofil meningkat yang menyebabkan pengurangan jumlah sel pada daerah peradangan (Katzung, 2002). Biosintesis prostaglandin dan tempat obat-obat antiinflamasi non steroid dapat dilihat pada gambar 5. Gambar 5. Skema biosintesis prostaglandin dan tempat obat-obat antiinflamasi non steroid bekerja (Anonim, 2008). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 21 E. Karagenin Karagenin adalah polimer linear yang tersusun dari sekitar 25.000 turunan galaktosa yang strukturnya tergantung pada sumber dan kondisi ekstraksi.Karagenin dikelompokkan menjadi 3 kelompok utama yaitu kappa, iota, dan lambda karagenin. Karagenin lambda (λ karagenin) adalah karagenin yang diisolasi dari ganggang Gigartina pistillata atau Chondrus crispus, yang dapat larut dalam air dingin (Chaplin, 2005). Karagenin dipilih untuk menguji obat antiinflamasi karena tidak bersifat antigenik dan tidak menimbulkan efek sistemik (Chakraborty et al., 2004). F. Biocream® Obat topikal terdiri dari vehikulum (bahan pembawa) dan zat aktif. Saat ini, banyaknya sediaan topikal yang tersedia ditujukan untuk mendapat efi kasi maksimal zat aktif obat dan menyediakan alternatif pilihan bentuk sediaan yang terbaik (Strober,2008). Krim adalah bentuk sediaan setengah padat yang mengandung satu atau lebih bahan obat terlarut atau terdispersi dalam bahan dasar yang sesuai.Formulasi krim ada dua, yaitu sebagai emulsi air dalam minyak (W/O) dan minyak dalam air (O/W) misalnya biocream. Krim ini bersifat ambifilik artinya berkhasiat sebagai W/O atau O/W. Krim dipakai pada kelainan yang kering, superfi sial (Djuanda,1994). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 22 G. Hidrokortison Asetat Hidrokortison adalah golongan kortikosteroid yang mempunyai daya kerja antialergi dan antiradang. Kortikosteroid bekerja dengan cara mencegah reaksi alergi, mengurangi peradangan, dan menghambat sel epidermis. Hidrokortison asetat (C23H32O6) digolongkan ke dalam obat antiinflamantori analgesik yang dapat mengurangi radang, rasa gatal, dan rasa sakit pada kulit. Indikasi krim ini ,menekan reaksi radang pada kulit yang bukan diseba kulit 2-3 kali sehari. Hidrokortison dalam bentuk krim biasanya dikombinasikan dengan suatu asam, misalnya bila dikombinasikan dengan suatu asam asetat maka nama dari sediaan tersebut adalah hidrokortison asetat ( Anief, 1996 ). Untuk mengatasi gangguan fungsi dan struktur kulit, digunakan obat topikal yang mengandung obat-obat seperti golongan antibiotika, kortikosteroid, antiseptik lokal, antifungi, dan lain-lain.Bentuk obat topikal dapat berupa salep, krim, lotio, dan pasta. Pemilihan bentuk obat topikal dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain, parahnya kerusakan kulit, daya kerja obat yang dikehendaki, kondisi penderita, dan daerah kulit yang diobati. Biasanya obat topikal mengandung obat yang dimaksudkan untuk bekerja pada lapisan kulit yang lebih dalam dari permukaan kulit, misalnya pada opengobatan penyakit kulit kronik dengan obat topikal yang mengandung kortikosteroid ( Sartono, 1996). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 23 H. Landasan Teori Inflamasi merupakan respon terhadap cedera jaringan dan infeksi. Saat proses inflamasi berlangsung, terjadi reaksi vascular di mana cairan, elemen-elemen darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada tempat cedera jaringan atau infeksi. Proses inflamasi dimana tubuh berusaha untuk menetralisir dan membasmi agen-agen yang berbahaya pada tempat cedera dan untuk mempersiapkan keadaan untuk memperbaiki jaringan. Berbagai mediator kimia dilepaskan selama proses inflamasi (Kee dan Hayes,1996). Aktivitas protein siklooksigenase (COX) bertanggung jawab untuk pengeluaran produksi prostaglandin (PG) yang tinggi selama proses inflamasi dan respon imum melalui metabolisme asam arakidonat. Respon imun berupa migrasi sel neotrofil ke daerah inflamasi merupakan fase seluler awal proses inflamasi. Penurunan jumlah sel neutrofil yang secara langsung menghambat pelepasan asam arakidonat yang menyebabkan kurang tersedianya substart arakidonat bagi jalur siklooksigenase, yang pada akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin(Gomeset al., 2008). Kandungan flavonoid padatanaman Milk Thistle diduga bertanggung jawab dalam memberi efek antiinflamasi. Flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan dengan cara mengikat berbagai macam radikal bebas sehingga mencegah kerusakan jaringan yang semakin parah akibat aktifitas radikal bebas dari RSO yang dihasilkan dari proses metabolisme oksigen sel radang. Flavonoid juga menghambat pelepasan asam arakidonat dari sel radang PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 24 sehinggamenyebabkan berkurangnyaketersedian substrat arakidonat, baik jalur siklooksigenase dan jalur lipooksigenase, untuk membentuk mediator inflamasi(Kimet al.,2004). Silymarin yang merupakan ekstrak bioaktif Milk Thistle mengandung flavonolignans seperti silychristin, isosilychristin, silydianinsilybin A dan B, isosilybin A dan B. serta asam 35% lemak, flavonoid dan polifenol. Ekstrak tanaman ini menunjukan aktivitas hepatoprotektif pada tikus yang terinduksi parasetamol (Hadaruga et al.,2009). Penelitian yang dilakukan oleh Balian et al. (2006) pemberian peroral ekstrak etanol-air daun Milk Thistle menunjukan adanya aktivitas antiinflamasi pada tikus yang terinduksi karagenin 1% secara subkutan. I. Hipotesis EkstrakMilk Thistlememberikan efek antiinflamasi topikal ditandai dengan berkurangnya jumlah sel netrofil dan ekspresi COX-2 pada mencit betina yang telah diinduksi karagenin 3%. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian tentang efek antiinflamasi ekstrak Milk Thistlesecara topikal pada mencit betina galur Swiss adalahjenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak lengkap pola searah. B. Variabel penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian a. Variabel utama 1) Variabel bebas : konsentrasi dari ekstrak Milk Thistle 2) Variabel tergantung : pengurangan sel-sel neutrofl dan ekspresi pada COX-2 pada daerah subkutan yang diinduksi karagenin dan diberikan denganekstrak Milk Thistle b. Variabel pengacau 1) Variabel pengacau terkendali a) Subyek uji : mencit betina galur Swiss b) Umur subyek uji : 2-3 bulan (6–8 minggu) c) Berat badan subyek uji : 20–30 gram d) Keadaan subyek uji : sehat 2) Variabel pengacau takterkendali : kondisi patofisiologis mencit yang digunakan dalam penelitian ini. 25 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 26 2. Skala Variabel 1. Ekstrak Milk Thistle: skala nominal 2. Penghitungan jumlah sel radang dan ekspresi COX-2 dari efek antiinflamasi : skala numerik 3. Definisi Operasional a. Ekstrak Milk Thistledidapatkan dari Naturex ltimate Botanical Benefit, Eropa. Dibuktikan dengan adanya sertifikat dari Naturex. Dalam sertifikat tersebut di cantumkan bahwa ekstrak ini berbentuk serbuk dengan warna kuning kecoklatan. Ekstrak ini merupakan ekstrak etanol air dengan total etanol residual <0,1% yang berarti bahwa ekstrak ini aman bagi tubuh. b. Perhitungan jumlah neutrofil yang bermigrasi dari pembuluh darah ke daerah subkutan (punggung mencit) dan ekspresi COX-2 secara mikroskopik pada pengukuran 24 jam setelah diinjeksikan karagenin 3 %. Pengukuran ini dilakukan karena sel neutrofil adalah sel yang bermigrasi pertama dan mendominasi pada 6 sampai 24 jam pertama yang dilakukan pengecatan Hematoksilin dan Eosin (HE), serta ekspresi COX-2 yang diduga merupakan sel neutrofil setelah dilakukan pengecatan dengan menggunakan antibodi anti COX-2. c. Pengecatan Hematoksilin dan Eosin (HE) ini bertujuan untuk memberikan gambaran kemampuan ekstrak Milk Thistledalam memberikan efek antiinflamasi yang dinyatakan dengan penurunan jumlah migrasi sel neutrofil pada daerah subkutan. Perhitungan migrasi sel neutrofil mengunakan perhitungan langsung (direct counting) dengan mikroskopbinokuler (Olympus®) untuk setiap lima PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 27 bidang pandangberbeda denganperbesaran 400 kali. Metode ini dimulai dengan membedah kulit punggung mencit setelah diinjeksi dengan karagenin 3% serta pemberian perlakuan pada pengamatan selama 24 jam. Bagian kulit yang diambil diawetkanmengunakan larutan fiksatif, yaitu larutan formalin 10%. Pengawetan bertujuan untuk mengawetkan morfologi sel dan jaringan sesuai dengan kondisi pada saat hewan uji masih dalam keadaan hidup d. Pengujian dengan metode immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 bertujuan untuk mengetahui mekanisme antinflamasi dari ekstrak etanol daun maja melalui pemeriksaan ekspresi protein COX-2. Pemeriksaan ekspresi COX-2 ekstrak Milk Thistledilakukan dengan melakukan pengecatan mengunakan antibodi anti COX-2 terhadap sel kulit punggung kulit yang selanjutnya dianalisis secara kuantitatif. e. Efek antiinflamsi ekstrak Milk Thistlemerupakan kemampuan ekstrak Milk Thistleuntuk mengurangi akumulasi jumlah sel neutrofil dan ekspresi COX-2 di daerah subkutan secara mikroskopik pada pengukuran 24 jam setelah dilakukan penginjeksian karagenin 3%. f. Pemberian secara topikal ekstrak Milk Thistledilakukan dengan cara mengoleskan sediaan sebanyak 0,1 gram yang akan menutupi area seluas 2,25 cm2 (1,5 cm x 1,5 cm) pada punggung kulit mencit setelah pemberian dengan karagenin secara merata. g. Injeksi subkutan merupakan jenis injeksi yang dilakukan pada jaringan di bawah kulit pada punggung kulit yang sudah dicukur rambutnya terlebih dahulu. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 28 C. Bahan Penelitian Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu : 1. Bahan uji yaitu ekstrak ekstrak Milk Thistleyang diperoleh dariNaturexltimate Botanical Benefit, Eropa 2. Hewan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah mencit betina galur Swiss yang berumur sekitar 6 – 8 minggu (2-3 bulan) dengan bobot sekitar 20- 30 gram dalam kondisi yang sehat yang diperoleh dari Laboratorium Immunologi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 3. Karagenin yang digunakan dalam penelitian ini adalah karagenin tipe I (Sigma Chemical co.) sebagai Inflamatogen yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Falkutas Farmasi Universitas Islam Indonesia. 4. Etanol diperoleh dari PT. Brataco. 5. NaCl 0,9% sebagai pelarut karagenin diperoleh dari Apotek K-24 Yogyakarta. 6. Akuades diperoleh dari PT. Brataco. 7. Biocream® sebagai basis krim diproduksi oleh Meck. 8. Hidrokortison cream sebagai control positif mengandung Hidrokortison Asetat 2.5% diproduksi oleh Galenium. 9. Veet® sebagai perontok bulu diproduksi oleh Reckitt Benckiser. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 29 D. Alat Penelitian dan Instrumen Penelitian Alat – alat yang digunakan dalam penelitian antara lain : 1. Alat Ekstraksi : a. Oven b. Etanol c. Mesin penyerbuk d. Ayakan no. 40 e. Alat – alat gelas Labu ukur, gelas beer, erlenmeyer, gelas ukur, cawan porselin, pipet tetes, batang pengaduk dan gelas arloji. 2. Alat induksi dan pengukuran edema kulit punggung mencit dan lain-lain a. Gunting b. Alat pencukurur bulu mencit c. Spuit injeksi 1 ml d. Mortir dan stamper e. Neraca analitik f. Stopwatch g. Jangka sorong digital h. Mikroskop binokuler 3. Alat dan bahan yang digunakan untuk pemotongan organ kulit a. Karton PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 30 b. Container c. Papan lilin dan pines d. Gunting bedah e. Pinset f. Formalin 10% E. Tata cara Penelitian 1. Pembuatan krim ekstrak Milk Thistle Konsentrasi krim ekstrak Milk Thistleditentukan bedasarkan konsentrasi zat aktif Hidrokortison asetat 2,5 % pada Hidrokortison® cream sebagai krim kontrol positif. Konsentrasi tersebut dijadikan konsentrasi tengah (konsentrasi kedua) untuk sedian krim ekstrak Milk Thistle.Konsentrasi pertama diturunkan 1,5 kalinya dan konsentrasi ketiga dinaikan 1,5 kalinya. Maka diperoleh tiga konsentrasi ekstrak Milk Thistledalam krim yaitu 1,67; 2,5; dan 3,75 % b/b. Pembuatan krim ekstrak Milk Thistledengan menimbang ekstrak seberat 0,167; 0,25; dan 0,375 g yang dilarutkan dalam 10 g basis boicream®. 2. Penyiapan Hewan Uji Dibutuhkan hewan uji sebanyak 30 ekor mencit betina, berumur 2-3 bulan, dengan bobot 20-30 gram. Hewan uji ini dibagi menjadi 6 kelompok yaitu kelompok karagenin, Biocream®, Hidrokortison®, ekstrak Milk Thistle1,67%; 2,5%; dan 3,75% b/b. Masing-masing Kelompok terdiri dari lima ekor mencit yang dipilih secara acak (random) untuk memenuhi syarat representative dari sampel.Hewan uji terlebih dahulu dicukur bulu punggungnya dengan gunting, PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 31 kemudian dioleskan Veet® untuk merontokkan bulu yang belum tercukur sempurna.Kulit punggung yang telah dicukur bulunya ini dibiarkan selama 2 hari untuk menghindari timbulnya inflamasi yang disebabkan oleh pencukuran dan pemberian Veet®. 3. Uji pendahuluan Uji pendahuluan bertujuan untuk menetapkankonsentrasikarageninoptimal yang akandigunakansebelumpenelitimelakukanujiefek anti inflamasitopikal. Konsentrasi karagenin 1,5%; 2% dan 3% dibuat dengan menimbang masingmasing karagenin sebanyak 1,5; 2; dan 3g karagenin dan melarutkanya dengan larutan fisiologis NaCl 0,9% dalam gelas beaker yang kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan larutan NaCl 0,9% hingga batas tanda.Tiga ekor mencit yang digunakan dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan konsentrasi karagenin, yaitu karagenin 1,5; 2; dan 3% masingmasing kelompok dinjeksi sebanyak 0,1 mL secara subkutan pada kulit punggung mencit yang telah dicukur bulunya. Tebal lipat kulit diukur setelah pemberian karagenin setriap 1 jam selama 6 jam. Kelompok karagenin yang dipilih,apabila edema yang timbul menunjukkan penebalan lipatan kulit sebesar 2-3 kali dari tebal lipat kulit awal . 4. Pembuatan larutan karagenin Karagenin 3% dibuat dengan melarutkan 0,75 gram karagenin kedalam larutan NaCl 0,9% kemudian dimasukan kedalam labu ukur 25mL, di add sampai tanda. Sehingga akan diperoleh larutan karagenin 3%. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 32 5. Pengujian ekstrak Milk Thistle Sebanyak 30 ekor mencit betina dibagi secara acak menjadi enam kelompok perlakuan : a. Kelompok I Terdiri dari lima ekor mencit sebagai kontrol negatif (karagenin). Mencit diinjeksi karagenin dengan konsentrasi 3%. b. Kelompok 2,3,4, 5, dan 6 Masing-masing kelompok terdiri dari lima ekor mencit sebagai perlakuaan Biocream®, Hidrokortison®, ekstrak Milk Thistle 1,67; 2,5; dan 3,75% b/b. Ekstrak seberat 1,67; 2,5; dan 3,75 gram masing-masing dicampur dengan basis krim (Biocream) seberat 10 gram sehingga didapat konsentrasi 1,67; 2,5 dan 3,75% B/B. Biocream®, Hidrokortison®, dan masing-masing konsentrasi ekstrak dalam basis krim diambil sebanyak 0,1 gram untuk dioleskan seluas 2,25 cm2 disekitar suntikan. 6. Pengambilan Bagian kulit punggung mencit untuk data histopatologi Dua puluh empat jam setelah diinjeksi karagenin 3% mencit dikorbankan dengan cara dislokasi tulang leher mencit dan dilakukan pengambilan kulitpunggung mencit dengan cara dibedah yang dilakukan dipapan bedah. Area pengambilan kulit disekitar daerah injeksi subkutan dengan ukuran 1 x 1cm. Hasil pemotongan jaringan kulit diletakkan di container yang telah berisi larutan fiksatif yaitu formalin 10% hingga potongan kulit terendam sempurna yang kemudian dibawa PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 33 ke bagian Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada untuk pembuatan preparat histologi. Pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dikerjakan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada dan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi RS Dr. Sardjito, Yogyakarta.Hasil pengecatan dianalisis di bawah mikroskop cahaya (Olympus CX21) dengan perbesaran 400xdi Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada. F. Tata Cara Analisis Hasil 1. Analisis hasil dilakukan dengan menghitung jumlah sel neutrofil yang bermigrasi dan sel yang mengekspresikan COX-2 pada daerah subkutan jaringan kulit punggung mencit pada 5 sudut pandang yang berbeda di bawah mikroskop cahaya (Olympus CX21) dengan perbesaran 400x. 2. Nilai persentase ekspresi COX-2 masing-masing perlakuan dihitung dengan persamaan: % 𝑒𝑘𝑠𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖 𝐶𝑂𝑋 − 2 = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑒𝑘𝑠𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖 𝑐𝑜𝑥 − 2 × 100% 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑠𝑒𝑙 ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 (Ikawati, 2006) 3. Menghitung persentase penekanan ekspresi COX-2 % 𝑝𝑒𝑛𝑒𝑘𝑎𝑛𝑎𝑛 𝑒𝑘𝑠𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖 𝐶𝑂𝑋 − 2 = 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑠𝑒𝑙 ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 − 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑒𝑘𝑠𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖 𝐶𝑂𝑋 − 2 × 100% 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑠𝑒𝑙 ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 (Ikawati, 2006) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 34 4. Data yang diperoleh terlebih dahulu dianalisis secara statistik dengan ShapiroWilk untuk melihat kenormalan dan homogenitas distribusi data. Data yang terdistribusi dengan normal dan homogenitas sama dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA (taraf kepercayaan 95%) karena skala variabel penelitian adalah skala numerik, data tidak berpasangan dan lebih dari dua kelompok. Analisis dilanjutkan dengan Post Hoc Testdengan Scheffe test. Namun jika syarat uji One Way ANOVA tidak dapat dipenuhi maka digunakan uji alternatif non-parametrik Kruskal Wallis. Apabila uji Kruskal Wallis menunjukkan perbedaan signifikan (p<0,05)maka dilanjutkan dengan Post Hoc Test menggunakan uji Mann Whitney. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Tujuan penelitian ini adalah mengetahui aktifitas antiinflamasi topikal pada ekstrak Milk Thistle dan mengetahui persen (%) penghambatan inflamasi ekstrak Milk Thistle pada mencit betina galur Swiss, melihat jumlah sel-sel neutrofil, dan ekspresi COX-2 pada jaringan subkutan. Hasil yang akan dibahas dalam penelitian meliputi ekstrak Milk Thistle, uji orientasi karagenin, dan pengujian efek antiinflamasi ekstrak Milk Thistle. A. Ekstrak Milk Thistle Pada penelitian ini peneliti tidak melakukan determinasi dan proses ekstraksi secara langsung karena peneliti mendapatkan ekstrak Milk Thistle dari NATUREX dengan disertakan sertifikat resmi yang menyatakan kebenaran bahwa ekstrak tersebut adalah ekstrak Milk Thistle. Menurut sertifikat dari NATUREX, ekstrak Milk Thistle ini berbentuk serbuk dan berwarna kuning kecoklatan. Ekstrak ini merupakan ekstrak etanol air dengan total etanol residual <0,1% yang berarti bahwa ekstrak ini aman bagi tubuh. Dalam sertifikat tersebut juga dicantumkan kandungan dari ekstrak, kandungannya sesuai dengan kandungan ekstrak Milk Thistle seperti Silymarin yang berpotensi memberikan efek antiinflamasi mencapai >80%. Sehingga peneliti langsung melakukan tahap pengujian perlakuan dengan menggunakan ekstrak Milk Thistle. 35 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 36 B. Uji Orientasi Karagenin Uji orientasi karagenin dilakukan sebelum uji efek antiinflamasi topikal ekstrak Milk Thistle. Tujuan dilakukan uji orientasi adalah untuk menetapkan konsentrasi karagenin yang akan digunakan dalam penelitian. Tahap awal dilakukan uji orientasi adalah penetapan konsentrasi dari karagenin yang akan diinjeksikan pada mencit sebagai penginduksi terjadinya inflamasi. Pada penelitian ini, konsentrasi yang digunakan dalam orientasi adalah 1,5; 2 dan 3%. Dibagi berdasarkan tiga kelompok perlakuan, setiap kelompok terdapat satu ekor mencit dan diberikan injeksi karagenin dengan rute peberian secara subkutan. Setelah mencit diinjeksikan dengan karagenin, mencit diamati dengan mengukur ketebalan dari lipat kulit punggung yang sudah diinjeksi karagenin, dilakukan setiap satu jam sekali selama enam jam. Setelah punggung mencit diinjeksidengan karagenin, akan menunjukkan peningkatan dari tebal lipat kulit punggung mencit sekitar 2-3 kali dari tebal lipat kulit pada awal pengukuran, sehingga tebal tersebut yang akan dipilih menjadi konsentrasi karagenin penginduksi inflamasi. Kurva grafik dari hasil pengukuran peningkatan tebal lipat kulit punggung mencit yang menunjukkan adanya edema yang terjadi di setiap jamnya selama enam jam dapat dilihat pada gambar 6. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 37 Karagenin 1,5% 4 Karagenin 2% Karagenin 3% 3.5 Edema (mm) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 1 2 3 waktu (jam) 4 5 6 Gambar 6.Kurva grafik peningkatan tebal lipat kulit selama enam jam. Pada uji efek antiinflamasi ini hasil pengukuran tebal lipat kulit mencit yang sudah diinduksi karagenin menunjukkan adanya edema pada setiap jamnya selama enam jam. Kelompok perlakuan konsentrasi karagenin 1,5% peningkatan tebal lipat kulit punggung sebesar 1,17 kali. Pengukuran awal tebal lipat kulit 0,35 mm, setelah diinjeksi dengan karagenin pada satu jam pertama tebal kulit hanya menjadi 0,41 mm. Konsentrasi karagenin 2% peningkatan tebal lipat kulit punggung sebesar 2,31 kali dari 1,27 mm menjadi 2,94 mm. Konsentrasi karagenin 3% peningkatan tebal lipat kulit punggung sebesar 4,52 kali dari pengukuran tebal awal 0,75 mm menjadi 3,39 mm. Dari hasil pengukuran menunjukan bahwa konsentrasi karagenin 1,5% belum memperlihatkan peningkatan penebalan hingga 2-3 kali dari tebal lipat kulit awal. Konsentrasi karagenin 2% sudah menunjukan peningkatan penebalan hingga 2-3 kali dari tebal lipat kulit awal, tetapi edema terbentuk terdapat gelembung berisi cairan dan edema yang terbentuk tidak bertahan selama enam jam pengamatan. Konsentrasi karagenin yang digunakan sebagai penginduksi inflamasi pada penelitian ini PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 38 adalah konsentrasi karagenin 3% karena pada konsentrasi karagenin 3% sudah menunjukan peningkatan tebal lipat kulit punggung mencit pada jam pertama yaitu lebih dari 2-3 kali dari lipat kulit awal dan tetap menunjukan edema lebih dari 2-3 kali dari lipat kulit awal selama enam jam pengamatan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Balian et al. (2006), konsentrasi karagenin yang digunakan pada uji efek antiinflamasi Milk Thistle diinduksi dengan karagenin 1%. Namun dalam prapenelitian antiinflamasi ekstrak etanol buah Sylibum marianum L. apabila diberikan karagenin dengan konsentrasi 1%, tidak menghasilkan edema yang diharapkan. Pada uji orientasi yang dilakukan, konsentrasi edema dinaikan menjadi 1,5; 2; dan 3%, dan konsentrasi karagenin yang digunakan sebagai penginduksi inflamasi adalah karagenin dengan konsentrasi 3% karena dari hasil peningkatan tebal lipat kulit, konsentrasi 3% menunjukan peningkatan lebih dari 2-3 kali dari pengukuran awal. C. Hasil Pengujian Efek Antiinflamasi Topikal Ekstrak Milk Thistle Terhadap Jumlah Sel Neutrofil Sebelum dilakukan pengujian efek antiinflamasi topikal ekstrak Milk Thistle, maka terlebih dahulu bubuk ekstrak dibuat menjadi krim Milk Thistle menggunakan Biocream® sebagai basisnya sehingga dapat diaplikasikan secara topikal pada kulit punggung mencit. Ekstrak dibuat dalam seri konsentrasi yang berbeda yaitu 1,67; 2,5 dan 3,75%. Pembuatan tiga seri konsentrasi ini bertujuan untuk melihat apakah pada setiap seri konsentrasi tersebut menunjukan adanya efek antiinflamasi topikal yang berbeda dan untuk mengetahui masing-masing PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 39 perbandingan khasiat dari ekstrak Milk Thistle terhadap kontrol sebagai antiinflamasi topikal. Pencukuran rambut pada bagian punggung mencit bertujuan untuk membersihkan tempat aplikasi (tidak terdapat rambut halus) agar mempermudah pembedahan kulit mencit. Setelah pencukuran mencit didiamkan selama satu hari yang betujuan untuk menghindari iritasi yang disebabkan selama proses pencukuran sehingga saat diinjeksikan dengan karagenan 3% secara subkutan, reaksi inflamasi yang terjadi murni disebabkan oleh induksi karagenan 3%. Pada pengujian efek antiinflamasi topikal ekstrak Milk Thistle, menunjukkan terjadinya pengurangan jumlah sel-sel neutrofil pada bagian sub kutan kulit punggung mencit yang diinduksi karagenin 3% dan telah diberikan perlakuan ekstrak Milk Thistle secara topikal, dan dilihat pula pengurangan sel-sel neutrofil pada masing-masing kelompok perlakuan terhadap kelompok kontrol. Untuk mengetahui kemampuan ekstrak Milk Thistle dalam memberikan efek antiinflamasi yang dinyatakan dengan penurunan jumlah migrasi sel neutrofil pada daerah subkutan dapat dilihat gambarannya dengan melakukan pengecatan hematoksilin eosin (HE). Perhitungan migrasi sel neutrofil mengunakan perhitungan langsung (direct counting) dengan mikroskop binokuler (Olympus®) untuk setiap lima bidang pandang berbeda dengan perbesaran 400 kali. Reaksi inflamasi merupakan proses adanya reaksi pada pembuluh darah sehingga mengakibatkan eksudasi cairan dan protein plasma yang kemudian memicu terjadinya emigrasi leukosit dalam hal ini adalah neutrofil pada jaringan ekstravaskular yang dapat disebut sebagai edema (Kumar dkk., 2005). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 40 Data yang didapatkan merupakan jumlah dari sel neutrofil yang berada pada daerah subkutan di area terjadinya edema setelah 24 jam dari masing-masing kulit yang diberikan perlakuan, oleh sebab itu data tersebut digunakan untuk melihat aktifitas antiinflamasi. Sel neutrofil adalah sel darah putih pertama yang bermigrasi dari pembuluh ke daerah cedera yang dijumpai pada waktu tingkat akut atau awal inflamasi. Sel neutrofil ditarik ke daerah inflamasi oleh faktor kemotaktik, yang dihasilkan oleh bakteri, produk perombakan jaringan, faktor komplemen aktif dan faktor lainnya (Tambayong, 2000). Neutrofil berupa sel bundar dengan diameter 12 µm, memiliki sitoplasma yang bergranula halus dan di tengah terdapat nukleus bersegmen. Neutrofil matang atau dewasa yang berada dalam peredaran darah perifer memiliki bentuk inti yang terdiri dari dua sampai lima segmen, sedangkan neutrofil yang belum matang (neutrofil band) akan memiliki bentuk inti seperti ladam kuda (Schmeltzerand Norsworthy, 2012). Sel neutrofil mendominasi infiltrat peradangan selama 6 sampai 24 jam pertama, kemudian digantikan oleh monosit setelah 24 jam sampai 48 jam (Kumar dkk., 2005). Hasil perhitungan sel neutrofil maka terlebih dahulu dihitung ratarata dari setiap jumlah sel yang ada pada perlakuan. Profil pengecatan hematoksilin eosin (HE) dan rerata masing-masing kelompok perlakuan dan kontrol dapat dilihat pada gambar 7 dan tabel 1. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 41 1 2 3 4 5 6 Gambar 7. Mikrofotografi pengecatan HE kulit normal, perlakuan Milk Thistle konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit (tanda lingkaran kuning) Keterangan : 4. Kulit kontrol negatif 1. Kulit normal dengan (karagenin) dengan perbesaran perbesaran 100 kali 400 kali 2. Kulit normal dengan 5. Kulit Milk Thistle 2,5% dengan perbesaran 400 kali perbesaran 100 kali 3. Kulit kontrol negatif 6. Kulit Milk Thistle 2,5% dengan (karagenin) dengan perbesaran perbesaran 400 kali 100 kali PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 42 Tabel 1. Hasil rerata jumlah sel neutrofil pada setiap kelompok perlakuan Kelompok Perlakuan Perlakuan Rerata Jumlah sel neutrofil ± SE I Kontrol negatif 111,36 ± 6,98 II Kontrol Biocream® 109,32 ± 13,26 III Kontrol positif 67,68 ± 7,50 IV Milk Thistle1,67% 77,84 ± 4,45 V Milk Thistle2,5% 61,64 ± 7,26 VI Milk Thistle3,75% 42,32 ± 3,45 Tabel diatas menunjukan hasil pengujian efek antiinflamasi ekstrak Milk Thistle secara topikal pada setiap perlakuan hewan uji. Kelompok kontrol negatif, hewan uji hanya diinjeksikan karegenin menunjukkan rerata jumlah neutrofil pada daerah sub kutan yaitu 111,36 ± 6,98 dan pada perlakuan kontrol Biocream® rerata jumlah neutrofil yaitu 109,32 ± 13,26 masih tergolong jumlah yang cukup besar dibandingkan kelompok perlakuan yang lain. Hal ini menunjukan bahwa karagenin dapat menjadi penginduksi inflamasi yang ditandai terdapat peningkatan jumlah neutrofil pada daerah subkutan kulit punggung mencit. Inflamasi yang diinduksi oleh karagenin dapat digunakan sebagai model peradangan akut. Pada penelitian ini digunakan tipe κ-karagenin yang merupakan polisakarida sulfat yang dapat menginduksi respon inflamasi dengan mengaktifkan respon imun. Adapun migrasi sel neutrofil merupakan respon dari inflamasi akut (Wade, 2014). Berdasarkan pengamatan yang dilakukan secara mikroskopik, pada perlakuan sebagai kontrol positif dan perlakuan yang diberikan ekstrak Milk PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 43 Thistle menunjukkan adanya pengurangan jumlah sel-sel neutrofil yang cukup berarti. Rerata jumlah sel neutrofil yang ditunjukan pada perlakuan kontrol positif (hidrokortison asetat 2,5% ) yaitu 67,68 ± 7,50, sedangkan pada tiap perlakuan yang diberikan ekstrak dengan pemberian konsentrasi 1,67% rerata yang didapatkan 77,84 ± 4,45. Hasil rerata pada konsentrasi 1,67% menujukan ekstrak Milk Thistle mampu menghambat terjadinya edema dan pengurangan jumlah sel neutrofil yang bermigrasi pada daerah sub kutan, walaupun aktivitas penghambatannya tidak tinggi jika dibandingkan dengan kontrol positif. Profil rerata jumlah migrasi sel neutrofil pada daerah subkutan pada pengukuran 24 jam setelah injeksi karagenin 3% dapat dilihat pada gambar 8. Gambar 8.Diagram batang aktivitas sel neutrofil pada mencit setelah pemberian ekstrak Milk Thistle secara topikal. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 44 Berdasarkan diagram diatas, profil kurva kontrol negatif dan kontrol Biocream® memiliki migrasi jumlah neutrofil pada daerah subkutan paling besar dibanding dengan kelompok lainnya. Hal ini menunjukan bahwa karagenin merupakan zat inflamatogen yang dibuktikan dengan peningkatan jumlah sel neutrofil di daerah subkutan. Basis yang digunakan untuk ekstrak Milk Thistle tidak memiliki efek dalam menurunkan migrasi sel neutrofil yang ditunjukan dari profil garis kurvanya hampir mirip dengan garis kurva kontrol negatif. Pada penelitian ini kontrol positif yang diberikan adalah hidrokortison asetat 2,5%, yang termasuk kedalam golongan obat kortikosteroid. Memiliki mekanisme menghambat pembentukan interleukin, tumor nekrosis faktor (TNF) dan menurunkan permeabilitas kapiler. Selain itu kortikosteroid bekerja dengan cara mencegah reaksi alergi, mengurangi peradangan, dan menghambat sel epidermis (Dipiro, 2008). Kortikosteroid merupakan antiinflamasi yang identik dengan kortisol, hormon steroid pada manusia yang disentesis dan di ekskresi oleh korteks adrenal. Efek dari antiinflamasi kortikosteroid mempengaruhi berbagai sel imunokompeten seperti sel T, makrofag, sel dendritic, eosinophil, neutrophil, dan sel mast, dengan cara menghambat respons inflamasi yang menyebabkan apoptosis (Mycek, 2001). Hasil perhitungan jumlah neutrofil antar kelompok dianalisis menggunakan uji Shapiro-Wilk untuk menentukan kenormalan data yang diperoleh. Uji ShapiroWilk menunjukan bahwa data terdistribusi normal dengan nilai p setiap kelompok lebih besar dari p=0,05. Dilanjutkan dengan uji Anova karena data yang didapatkan terdistribusi secara normal. Kemudian dilakukan uji Scheffe untuk PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 45 melihat perbedaan bermakna atau tidak antar tiap kelompok perlakuan. Hasil uji Scheffe setiap kelompok perlakuan dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2.Hasil uji Scheffe aktivitas sel neutrofil pada mencit setelah pemberian ekstrak Milk Thistle secara topikal. I I II III IV V VI Rerata Jumlah sel neutrofil ± SE BTB BB BTB BB BB 111,36 ± 6,98 BB BTB BB BB 109,32 ± 13,26 BTB BTB BTB 67,68 ± 7,50 BTB BTB 77,84 ± 4,45 BTB 61,64 ± 7,26 II BTB III BB BB IV BB BTB BTB V BB BB BTB BTB VI BB BB BTB BTB Keterangan : I II III IV V VI BB BTB SE BTB 42,32 ± 3,45 : Kontrol negatif (Karagenin 3%) : Kontrol Biocream ® : Kontrol positif (Hidrokortison asetat 2,5%) : Ekstrak Milk Thistle 1,67% : Ekstrak Milk Thistle 2,5% : Ekstrak Milk Thistle 3,75% : Berbeda bermakna (p < 0,05 ) : Berbeda tidak bermakna (p > 0,05) : Standart error Berdasarkan tabel diatas dapat dilihat bahwa pengurangan jumlah migrasi neutrofil pada daerah subkutan secara statistik dari hasil pemberian ekstrak Milk Thistle konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% terhadap kontrol negatif, kontrol positif dan kontrol biocream®. Rerata sel neutrofil kelompok karagenin PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 46 3% berbeda tidak bermakna dengan rerata sel neutrofil kelompok Biocream®. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok Biocream® tidak memiliki efek antiinflamasi. Rerata sel neutrofil kelompok karagenin 3%berbeda bermakna dengan kelompok kontrol positif dan ketiga kelompok konsentrasi ekstrak Milk Thistle. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok karagenin 3% pada penelitian ini bertindak sebagai agen inflamatogen yang menginduksi mediator inflamasi. Sedangkan rerata kontrol negatif dengan kontrol positif (Hidrokortison asetat 2,5%) mempunyai hubungan yang berbeda bermakna (p<0,05). Hirokortison secara statistik mampu menurunkan jumlah sel neutrofil yang bermigrasi. Hal tersebut menunjukan bahwa aktifitas keduanya tidak sama. Pada rerata ekstrak Milk Thistle konsentrasi 1,67; 2,5 dan 3,75% masingmasing menunjukkan adanya perbedaan yang berbeda bermakna (p < 0,05) dengan kontrol negatif (induksi karagenin) dan kontrol biocream®. Hal ini menunjukan bahwa ketiga konsentrasi tersebut aktifitasnya tidak sama dengan kontrol negatif dan biocream®. Secara statistik menunjukan bahwa ekstrak Milk Thistle dengan konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% mempunyai efek penghambatan migrasi sel neutrofil pada daerah sub kutan, namun rerata ketiga konsentrasi tersebut dengan kontrol positif (hidrokortison asetat 2,5%) memiliki hubungan berbeda tidak bermakna (p > 0,05) dapat dikatakan bahwa aktifitas ketiga konsentrasi ekstrak Milk Thistle sebanding dengan kontrol positif (hidrokortison asetat 2,5%). Rerata sel neutrofil ekstrak Milk Thistle 1,67% lebih besar dibandingkan dengan 2,5%. Dapat diartikan bahwa ekstrak Milk Thistle 2,5% efek penurunan sel neutrofil lebih besar dari 1,67%. Ekstrak Milk Thistle 3,75% PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 47 mempunyai rerata yang paling kecil yang menunjukan pada konsentrasi ini efek penurunan sel neutrofilnya paling besar jika dibandingkan dengan konsentrasi lainnya. Namun secara statistik ketiga konsentrasi berbeda tidak bermakna. Hal ini menunjukan bahwa dari ketiga ekstrak tersebut memiliki efek penurunan sel neutrofil yang sama menurut statistik. Berdasarkan penelitian Hadaruga et al., (2009) kandungan pada ekstrak buah Milk Thistle antara lain 65-85% flavonolignans (silymarin) seperti silychristin, isosilychristin, silydianin, silybin A dan B, isosilybin A dan B, dan juga 20-35% asam lemak, flavonoid, stimulan metabolik dan polifenol lainnya. Selain mengandung flavolignans (silymarin) tanaman Milk Thistle juga mengandung tyramine, histamine, asam linoleat gamma, dan minyak esensial. Senyawa flavonoid memiliki aktivitas antioksidan dalam menangkap radikal bebas sehingga memiliki efek antiinflamasi. Senyawa tersebut juga dapat mengatur aktivitas regulasi seluler dari sel-sel peradangan seperti, sel mast, makrofag, limfosit dan neutrofil. Flavonoid juga dapat menghambat degranulasi neutrofil, dan juga mengurangi pelepasan asam arakidonat oleh neutrofil dan selsel mediator inflamasi lainnya. Sehingga dapat mengurangi eksudat dan jumlah migrasi leukosit (Kim et al., 2004). D. Hasil Persen (%) Penghambatan Ekspresi COX-2 Ekstrak Milk Thistle Dengan Metode Imunohistokimia Dengan Antibodi Anti-COX-2 Tujuan dari uji immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 yaitu mengetahui mekanisme antinflamasi dari ekstrak Milk Thistle melalui pemeriksaan ekspresi protein COX-2. Pemeriksaan ini dilakukan dengan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 48 dilakukan pengecatan mengunakan antibodi anti COX-2 terhadap sel kulit punggung kulit yang selanjutnya dianalisis secara kuantitatif. Enzim siklooksigenase (cyclooxygenase = COX) merupakan enzim kunci yang menghidrolisis asam arakidonat (AA) menjadi prostaglandin, COX-1 dan COX-2, keduanya merupakan jenis enzim COX. COX-1 hampir pada semua jaringan, terutama pada saluran cerna dan ginjal, yang mempertahankan fungsi fisiologi normal jaringan (Akmal dkk., 2007). COX-2 adalah enzim dalam bentuk indusibel, dan tidak terdeteksi dalam semua sel dan jaringan normal,akan tetapi COX-2 akan cepat terinduksi apabila sel menerima stimulus inflamasi (Widiastuti, 2011). Migrasi sel darah putih (leukosit) pada daerah cedera jaringan atau infeksi merupakan respon imun tubuh selama proses inflamasi. Karakteristik utama pada inflamasi akut adalah migrasi leukosit (terutama neutrofil). Sel neutrofil mendominasi infiltrat peradangan selama 6 sampai 24 jam pertama sehingga enzim COX-2 pada penelitian ini di ekspresikan oleh sel neutrofil. Sel yang mengekspresi COX-2 akan menunjukan warna coklat atau gelap, sedangkan yang tidak mengekspresikan COX-2 menunjukan warna biru (Kimet al., 2004). Ekspresi COX-2 dapat dilihat pada gambar 9. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 49 1 2 Gambar 9. Mikrofotografi pengecatan immunositokimia terhadap COX-2 pada sel neutrofil (tanda lingkaran kuning) di daerah subkutan jaringan kulit mencit di bawah mikroskop binokuler pada perbesaran 100 kali (1) dan 400 kali (2). Tanda panah kuning menunjukkan hasil positif COX-2, tanda panah merah menunjukkan hasil negatif COX-2. Pada penelitian efek antiinflamasi ekstrak Milk Thistle menunjukkan adanya ekspresi COX-2 pada daerah sub kutan. Kemudian ditentukan persen (%) penghambatan ekspresi COX-2 dengan menghitung pada masing-masing kelompok perlakuan menggunakan uji statistik Shapiro-wilk untuk melihat data pada penelitian ini menunjukkan hasil yang terdistribusi normal atau tidak. Dari hasil yang diperoleh dari uji Shapiro-wilk menunjukkan bahwa data yang sudah diolah tidak terdistribusi secara normal. Dengan hasil p = 0,015 hal ini menunjukkan bahwa kontrol negatif < 0,05 (Sig 0,005) walaupun data kelompok PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 50 lain > 0,05. Kemudian dilakukan pengujian homogenitas dengan hasil data tidak homogen yaitu p=0,049 (p<0,05). Hasil uji normalitas dan homogenitas data yang sudah diolah menunjukan bahwa data tidak normal dan tidak homogen makan dilakukan analisis data dengan analisis statistik non-parameter. Dengan melakukan uji Kruskal wallis yang bertujuan untuk melihat data yang dianalisis apakah ada yang berbeda atau tidak. Hasil uji tersebut didapatkan hasil p = 0,000 (p<0,05). Karena nilainya kurang dari dari 0,05 (sig 0,05) maka disimpulkan terdapat perbedaan antara kelompok data diatas sekurangnya ada 2 kelompok yang berbeda. Untuk menguji perbedaan antara kelompok analisis dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney untuk melihat perbedaan masing-masing kelompok perlakuan satu per satu apakah bermakna atau tidak bermakna. Hasil dari uji ini menunjukkan bahwa % penghambatan ekspresi COX-2 antar tiap kelompok perlakuan terdapat perbedaan yang bermakna. Hasil pengecatan immunohistokimia dengan antibodi anti COX-2 masing-masing perlakuan beserta kontrol dapat dilihat pada gambar 10 dan tabel 3. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 51 1 2 3 4 5 6 Gambar 10.Mikrofotografi pengecatan Immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 kulit normal, perlakuan Milk Thistle konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit (tanda lingkaran kuning) Keterangan : 1. Kulit normal dengan perbesaran 100 kali 2. Kulit normal dengan perbesaran 400 kali 3. Kulit kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali 4. Kulit kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 400 kali 5. Kulit Milk Thistle 2,5% dengan perbesaran 100 kali 6. Kulit ekstrak Milk Thistle 2,5% dengan perbesaran 400 kali PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 52 Tabel 3.Rerata persen penghambatan ekspresi COX-2 pada kelompok perlakunan beserta kontrol. I I II III IV V VI Rerata % PI ± SE BTB BB BB BB BB 1,44 ± 0,37 BB BB BB BB 2,01 ± 0,22 BB BB BB 76,60 ± 0,88 BTB BTB 11,56 ± 1,24 BB 13,96± 1,03 II BTB III BB BB IV BB BB BB V BB BB BB BTB BB BB BTB VI BB BB 8,48 ± 0,87 Keterangan: I II III IV V VI BB BTB SE %PI : Kontrol negatif (Karagenin 3%) : Kontrol Biocream ® : Kontrol positif (Hidrokortison asetat 2,5%) : Ekstrak Milk Thistle 1,67% : Ekstrak Milk Thistle 2,5% : Ekstrak Milk Thistle 3,75% : Berbeda bermakna (p < 0,05 ) : Berbeda tidak bermakna (p > 0,05) : Standart error : Persen penghambatan inflamasi Tabel 3 memperlihatkan bahwa masing-masing konsentrasi ekstrak Milk Thistle mempunyai efek antiinflamasi dalam menghambat COX-2 yang dapat dilihat dari hasil rerata pada tabel diatas.Berdasarkan data tersebut rerata kontrol negatif (karagenin) dan biocream menunjukan nilai yang paling kecil jika di bandingkan dengan perlakuan yang lain. Secara statistik kontrol negatif (karagenin) dan biocream berbeda tidak bermakna, dapat diartikan keduanya PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 53 mempunyai aktifitas yang sama yaitu belum mampu memberikan aktifitas penghambatan ekspresi COX-2. Jika dilihat dari rerata persen (%) penghambatan ekspresi COX-2 ketiga konsentrasi mempunyai persen penghambatan yang lebih besar dibandingkan dengan kontrol negatif dan biocream. Serta secara statistik mempunyai hubungan yang berbeda bermakna. Hal ini menunjukan bahwa ketiga konsentrasi tidak memiliki aktifitas yang sama dengan kontrol negatif dan biocream. Ketiga konsentrasi secara statistik memiliki aktivitas antiinflamasi. Untuk persen penghambatan kontrol positif mempunyai nilai yang paling besar jika dibandingkan dengan kontrol negatif dan biocream. Secara statistik mempunyai hubungan berbeda bermakna. Dapat diartikan secara statistik kontrol positif mempunyai aktifitas yang berbeda dengan kontrol negatif dan biocream yakni kontrol positif mampu menghambat ekspresi COX-2. Data tersebut diperoleh persen penghambatan ekspresi COX-2 pada kontrol positif (hidrokosrtison asetat 2,5%) sebesar 76,60%. Sedangkan pada kelompok perlakuan ekstrak Milk Thistle masing-masing konsentrasi yaitu 1,67; 2,5 dan 3,75% menunjukkan penghambatan sebesar11,56;13,95; dan 8,48%. Dapat dilihat bahwa pada pemberian ekstrak Milk Thistle konsentrasi 3,75% terdapat penurunan persen penghambatan ekspresi COX-2. Hal ini menunjukkan ketiga konsentrasi tidak ada kekerabatan antar konsentrasi. Berdasarkan hasil persen penghambatan ekspresi COX-2 pada masingmasing konsentrasi ekstrak Milk Thistle tersebut, terlihat pada konsentrasi 2,5% menunjukan nilai yang paling besar yaitu 13,95% dibandingkan dengan kontrol Biocream® dan ekstrak Milk Thistle konsentrasi 1,67% dan 3,75%, namun secara PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 54 statistik ketiga konsentrasi tersebut dengan kontrol positif memiliki hubungan berbeda bemakna (p < 0,05) yang artinya ketiga konsentrasi tersebut dalam menghambat ekspresi COX-2 aktifitasnya tidak sebanding atau lebih kecil dari kontrol positif. Konsentrasi ekstrak 1,67% dan 2,5% menunjukkan perbedaan yang tidak bermakna, artinya kedua ekstrak tersebut berdasarkan statistik memiliki aktifitas yang sama, sehingga dapat dikatakan memiliki efek penghambatan ekspresi COX-2 yang sebanding. Sedangkan ekstrak konsentrasi 2,5% dan 3,75% memiliki persen penghambatan ekspresi COX-2 yang lebih kecil dibandingkan dengan ekstrak konsentrasi 2,5%. Secara statistik memiliki hubungan yang berbeda bermakna, hal ini menunjukan bahwa aktifitas keduanya tidak sama. Pada penelitian ini kontrol positif yang dipakai adalah hidrokortison asetat 2,5% yang merupakan golongan kostikosteroid yang bekerja pada jalur posfolipase A2, namun pengujian ini menunjukkan bahwa kontrol positif dapat juga menekan ekspresi COX-2. Berdasarkan Rang et al., (2007) golongan kortikosteroid dapat menghambat transkripsi gen pada siklooksigenase-2 (COX2), yang diinduksi dalam sel inflamasi oleh mediator inflamasi. Profil rerata ekspresi protein COX-2 pada daerah subkutan pada pengukuran 24 jam setelah injeksi karagenin 3% dapat dilihat pada gambar 11. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 55 Gambar 11.Diagram % penghambatan ekspresi COX-2 antar tiap kelompok perlakuan dan kontrol. Berdasarkan diagram diatas, hasil uji statistik menunjukkan bahwa pada kontrol positif menunjukan hasil yang paling tinggi secara statistik dalam menghambat ekspresi COX-2 yaitu 76,60%. Dari ketiga konsentrasi yaitu 1,67; 2,5 dan 3,75% menunjukkan bahwa konsentrasi 2,5% hasilnya paling tinggi jika dibandingkan dengan konsentrasi ekstrak Milk Thistle yang lain yaitu sebesar 13,96%. Sedangkan pada kelompok perlakuan dengan konsentrasi 1,67% dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 56 konsentrasi 3,75% memiliki persen penekanan COX-2 sebesar 11,56% dan 8,48%. Dari hasil persen penekanan tersebut menunjukkan bahwa masing-masing kelompok perlakuan ekstrak Milk Thistle memiliki efek penekanan ekspresi COX2, namun secara statistik efek penekanannya tidak setinggi pada kelompok kontrol. Perhitungan sel yang mengekspresikan COX-2 ini dilakukan dengan perhitungan langsung (direct counting) dengan mikroskopcahaya (Olympus®) untuk setiap lima bidang pandang berbeda dengan perbesaran 400 kali. Senyawa flavonoid yang terkandung dalam Milk Thistle menunjukkan adanya aktivitas antiinflamsi. Flavonoid dapat menghambat eicosanoid yang menghasilkan enzim mediator inflamasi. Sehinga, flavonoid dapat menghambat ekspresi dari COX-2 yang banyak diekspresikan pada jenis sel-sel peradangan yang terkait termasuk makrofag dan sel mast (Kim et al.,2004). Mekanisme flavonoid dalam penghambatan jalur arachidonic acid dengan menghambat ekspresi dari mediator inflamasi yaitu COX-2. Penghambatan ini mengakibatkan terjadinya pengurangan jumlah prostaglandin khususnya mediator pro-inflamasi seperti PGE2. Sehingga respon inflamasi tersebut akan berkurang (Gomes et al., 2008). Sifat anti-inflamasi yang dilakukan oleh flavonoid dibuktikan melalui berbagai tes pada molekul yang beragam dari kelas flavonoid yang berbeda, untuk mengeksplorasi efek mereka pada berbagai jalur yang terlibat dalam proses inflamasi. Peran flavonoid dalam memodulasi ekspresi enzim COX-2 dan iNOS ditunjukan pada gambar 12. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 57 Gambar 12. Target flavonoid dalam memodulasi respon inflamasi melalui jalur asam arakidonat dan protein kinase yang mengatur faktor-faktor transkripsi seperti CREB, AP-1, NF-κB, dan C/EBP yang memodulasi ekspresi penanda pro-inflamasi seperti COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β, dan IL-6 (Gomes, 2008). Mekanisme aktivitas antiinflamasi senyawa flavonoid dengan cara menggangu aktivitas NF-κB aktivator sehingga menghambat pengekspresian enzim COX-2. NF-κB adalah salah satu faktor transkripsi dari empat faktor transkripsi yang telah diidentifikasi untuk mengikat cis-acting elemen di wilayah promotor dan mengatur transkripsi enzim COX-2 (Gomes, 2008). Hasil uji HE dan immunohistokimia penelitian tidak ada pengaruh peningkatan konsentrasi ekstrak dengan efek antiinflamasi. Dapat dilihat dari hasil rerata penekanan ekspresi COX-2 konsentrasi 2,5% dan 3,75% justru mengalami penurunan dan diantara ketiga konsentrasi ekstrak Milk Thistle secara statistik berbeda tidak bermakana. Hal tersebut menunjukan bahwa pada penelitian ini tidak adanya pengaruh peningkatan konsentrasi ekstrak dengan efek antiinflamasi. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 58 Range konsentrasi yang dipakai diduga terlalu kecil sehingga tidak memperlihatkan pengaruh peningkatan efek antinflamasi dengan penekanan migrasi sel neutrofil dan ekspresi COX-2 seiring dengan meningkatnya konsentrasi. Aktivitas antiinflamasi dari ekstrak Milk Thistle didukung melalui uji antiinflamasi topikal ekstrak Milk Thistle yang dilakukan secara makroskopik menggunakan metode Inflammation-assosiated. Pada penelitian tersebut menggunakan parameter efek antiinflamasi berupa penurunan edema yang terbentuk setiap 1 jam selama 6 jam yang diukur dengan jangka sorong digital (Efariyanti, 2015). Hasil ekstrak Milk Thistle tidak menggunakan senyawa aktif tunggal sehingga senyawa aktif lain yang terkandung di dalamnya dapat mempengaruhi hasil penelitian. Penelitian ini merupakan skrining awal untuk menunjukan bahwatanaman Milk Thistle mempunyai efek antiinflamasi secara topikal. Hal tersebut membuktikan bahwa tanaman Milk Thistle adalah salah satu alternatif yang dapat digunakan dalam pengobatan inflamasi baik oral maupun topikal. Maka diharapkan adanya penelitian lebih lanjut yang berkaitan untuk memastikan senyawa aktif yang bertanggung jawab memberikan efek antiinflamasi ekstrak Milk Thistle. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Berdasarkan penelitian yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa : 1. EkstrakMilk Thistle mempunyai efek antiinflamasi topikal terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi COX-2 pada mencit betina galur Swiss. 2. Besar rerata jumlah sel neutrofil ekstrak Milk Thistle pada mencit betina terinduksi karagenin 3% dengan konsentrasi 1,67; 2,5; 3,75% berturut-turut yaitu 77,84; 61,64; 42,32. 3. Persen penghambatan ekspresi COX-2 ekstrak Milk Thistle pada mencit betina yang diinduksi karagenin 3%konsentrasi 1,67; 2,5; 3,75% berturut-turut yaitu 11,56; 13,96; 8,48%. B. Saran Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, perlu adanya penelitian lebih lanjut untuk mengetahui: 1. Senyawa yang bertanggung jawab dalam ekstrakMilk Thistleyang menunjukkan adanya efek antiinflamasi topikal. 2. Kesalahan penelitian dalam mempengaruhi hasil. 59 melakukan ekstraksi yang dapat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Daftar Pustaka Akmal, M., Aulanni’am, danriawan, Wibi, 2007, Ekpresi Cyxlooxygenase2 (COX-2) pada jaringanTestis Tikus (Ratus norvegicus) Akibat Paparan Ekstrak Biji Pinang (Areca catechu), Jurnal Kedokteran Brawijaya, Vol.XXIII, No.3,pp.121-124. Anief, M., 1996,IlmuMeracikObat,Edisi 6,Gajah Mada University Press, Yogyakarta,p.32. Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, Deparemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Edisi III, Anonim, 1985, Cara Pembuatan Simplisia, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 2008, Kumpulan Kuliah Farmakologi, Edisi 2, EGC, Jakarta, pp.500509. Badan POM, 2010, Acuan Sediaan Herbal, Edisi 5, Badan POM RI, Jakarta, p.6 Balian S., Ahmad S., Zafar R.,2006, Antiinflammtory Activity of Leaf and Leaf Callus of Silybum marianum (L.) Gaertn. In Albino Rats, Indian Journal Pharmacology,Vol. 38, pp.213-214. Bisset, N., 1994, Herbal Drugs and Pharmaceuticals, CRC Press Boca Ratan, London, pp.121-123. Brunton, L., Parker, K., Blumenthal, D., and Buxton, I., 2008, Good man and Gilamn’s Manual of Pharmacology and Therapeutic , The McGraw-Hill Companies, Inc., United States of America. Chakraborty, A., R.K.B., Devi, S., Rita, K.H., Sharatchandra, and Singh, T.H. I., 2004, Preliminary Studies on Anti-inflammatory and Analgesic Activities of Spilanthes Acmella in Experimental Animal Models, Indian Journal Pharmacology, Vol. 36 (3), pp.148-150. Chaplin, M., 2005,Carrageenan https://www.lsbu.ac.uk/water/hycar.html, diakses tanggal 15 September 2015/ 15:00 WIB Dehmlow, C., Erhard, J., De Groot, H., 1996, Inhibition of Kupffer Cell Functions as an Explanation For the Hepatoprotective Properties of Silibinin, Hepatology, Vol. 23, pp.749-754. Dipiro, J. T., ea al, 2008, Pharmacotherapy : A Phatophysiologic Approach, 7th edition, Mc-Graw Hill, USA, pp. 1544-1545. 60 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 61 Djuanda A., 1994, Pengobatan Topikal dalam Bidang Dermatologi, Yayasan Penerbitan IDI, Jakarta, pp.105-107. Djuanda, Adhi, 2007, Ilmu Penyakit Kulit dan Kelamin, Edisi kelima, Balai Penerbit FK UI, Jakarta, pp. 50-53. Dorland, W.A.N., 2002, Kamus Kedokteran Dorland, Edisi 29, EGC, Jakarta, pp. 68-556. Efariyanti, F.A., 2015, Uji Antiinflamasi Topikal Ekstrak Etanol Buah Milk Thistle Silybum marianum (L.) Gaertn. Pada Edema Punggung Mencit Betina Terinduksi Karagenin, Tugas Akhir , Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Gamse, T., 2002, Liquid-Liquid Extraction and Solid-Liquid Extraction, Institute of Thermal Process and Environmental Engineering, Graz University of Technology, pp. 2-24. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J.L.F.C., Mira, L., Corvo, M.L., 2008, Molecular Mechanisms of Anti-inflammatory Activity Mediated by Flavonoids, Current Medicinal Chemistry, pp. 1586-1605. Hadaruga, D.I., Hadaruga N.G., 2009, Antioxidant Activity of Hepatoprotective Silymarin and Silybum marianum(L.) Extract, Chemical Bulletin of Politehnica University of Timisoara, Romania, vol. 54, pp.104-105. Harmita, Radji, M., Biomed, M., 2006, Buku Ajar Analisis Hayati, Edisi 3, EGC, Jakarta, p.59. Ikawati, Z., Nugroho, A.E., Werdhinindah, W., 2006, Efek Ekstrak Etanol Daun Erythrina fusca Lour (cangkring) terhadap Penekanan Ekspresi Enzim Siklooksigenase–2 pada Kultur Sel Raji, Majalah Farmasi Indonesia,Vol. 17, 85-90. Kumar, V.,Abbas, A.K., and Fausto, N., 2005, Pathologic Basic of Disease, 7th ed, Elsevier Saunders, Philadelphia, pp.48,70-73. Katzung B. G., 2002, Farmakologi Dasardan Klinik, Edisi 2, Salemba Merdeka, Jakarta, pp.48-49. Kirtikar, K.R., Basu, B.D., 2006,Indian Medicinal Plants, Vol. 2, International Book Distributors, Dehradun, pp.1417-1418. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 62 Kim, H.P., Son, K.H., Chang, H.W., and Kang, S.S., 2014, Anti-inflammatory Plant Flavonoids and Cellular Action Mechanisms, Pharmacol Rev, Korea, pp.230-232 Peschlow,L.E., 1996, Properties and MedicalUse of Flavonolignans (Silymarin) from Silybum marianum,Phytotherapy Research, pp.25-26. Priyanto,2008,The Complete Drugs Reference, 35th Edition, Pharmaceutical Press, London, p.124. Mycek, M.J., 2001,Farmakologi Ulasan Bergambar, Widya Medika Jakarta, pp. 280-409. Nogrady, T., 1992,Kimia Medicinal: Pendekatan Secara Biokimia, ITB, Bandung, pp.412-429. Olson, James, 2003,Belajar Mudah Farmakologi, EGC, Jakarta, pp.166-167. Peirce, A., 1999,The American Pharmaceutical Association Practical Guide to Natural Medicines, William Morrow and Company, Inc., New York, pp.1002-1008. Robbins, 2004, Buku Ajar Patologi Robbins, Edisi 7, Volume 1, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Sabir, S., Arshad, M., Saira, Asif.,Chaudhari, S.K., 2014, An Insight Into Medicinal and Therapeutic Potential of Silybum marianum (L.) Gaertn, Inernational jurnal of Biosciences. Sampurno, 2007, Kebijakan Pengembangan Obat Bahan Alam Indonesia. Strategic Management, Universitas Pancasila, Jakarta, p.10 Sartono,1996,Obat-obat Bebas Dan Bebas Terbatas, PT.Gramedia PustakaUtama, Jakarta, pp.6, 8. Schmeltzer, Linda E., and Norsworthy, Gary D., 2012, Nursing The Feline Patient, John Wiley and Sons, UK, pp. 104-108. Sonnenbichler, J., Scalera, F., Sonnenbichler, I., 1999, Stimulatory Effects of Silibinin and Silicristin from The Milk Thistle Silybum marianumon Kidney Cells, Journal Pharmacology,UK, pp. 290, 1375. Strober, B.E., Washenik, K., Shupack, J.L.,2008, Principles of TopicalT herapy In: Dermatology In General Medicine, 7th ed., McGraw-Hill, New York, pp.2090-2096. Tambayong, Jan, 2000, Patofisiologi untuk Keperawatan, Penerbit Buku Kedokteran EGC, jakarta, pp. 50. Tjay, T. H., dan Raharja, K., 2002, Obat-Obat Penting, Edisi 5, Gramedia, Jakarta. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 63 Wade, C. L., Koob, G.F., and Vendruscolo, L.F., 2014, Drug Addiction and Chronic Pain: A Review of Animal Models, Neurobiological Studies of Addiction in Chronic Pain States, Springer, New York, Chapter 5, pp. 6166. Widiastuti, dkk., 2011, Ekspresi Protein pada Karsinoma Nasofaring Respons Tinggi dan Respon Rendah Pasca-Radioterapi, JBP, Vol.13, pp. 105-114. Cox-2 Wilmana, P. F.,1995., Farmakologi danTerapi,Edisi ke-4, Penerbit Gaya Baru, Jakarta,p.259. Wasitaatmadja, Sjarif, M., 2010,Faal Kulit, Dalam: Djuanda, A., Hamzah, M., Aisah,S. Ilmu Penyakit Kulit dan Kelamin, Edisi Keenam, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta,pp.7-8. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 64 LAMPIRAN PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 65 Lampiran 1. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian Gambar 13. Hidrocortisone (hidrokortison asestat 2,5%) sebagai kontrol positif Gambar 14. Biocream® (Kontrol Biocream®) dan basis ekstrak PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 66 Gambar 15. Serbuk karagenin yang digunakan dalam penelitian Gambar 16. Spuit injeksi yang digunakan dalam penelitian PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 67 Gambar 17. Ekstrak yang sudah dilarutkan dalam basis Biocream® Lampiran 2. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian Gambar 18.Mencit betina galur Swiss PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 68 Gambar 19. Kulit punggung mencit sesudah dicukur Gambar 20. Kulit punggung mencit yang terinduksi karagenin PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 69 Gambar 21. Kulit punggung mencit yang dioleskan ekstrakMilk Thistle Lampiran 3. Pemotongan kulit untuk histopatologi Gambar 22. Pemotongan kulit punggung mencit PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 70 Gambar 23. Kulit mencit yang diawetkan dengan formalin 10% PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 71 Lampiran 4. Ekstrak Biji Milk Thistle ® PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 72 Lampiran 5. Surat Ethical Clearence PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 73 Lampiran 6. Data tebal lipat kulit dalam uji pendahuluan karagenin Jam ke- Karagenin 1,5% Karagenin 2% 0 0.35 1.27 Karagenin 3% 0.75 1 0.41 2.94 3.39 2 1.46 1.98 2.89 3 1.52 1.76 2.5 4 1.56 1.64 2.4 5 1.54 1.52 2.07 6 1.33 1.41 2.03 Lampiran 7. Data rata-rata perhitungan jumlah neutrofil Kontrol Negatif 3% KETERANGAN K-1 K-2 K-3 K-4 K-5 RATA-RATA Rerata Jumlah sel neutrofil ± SE KULIT 1 84 125 94 138 128 113,8 KULIT 2 103 129 108 118 79 107,4 KULIT 3 78 86 72 111 92 87,8 KULIT 4 164 133 111 142 102 130,4 KULIT 5 93 105 107 127 155 117,4 111,36 ± 6,98 Kontrol Biocream® KETERANGAN B-1 B-2 B-3 B-4 B-5 RATA-RATA Rerata Jumlah sel neutrofil ± SE KULIT 1 185 187 109 204 98 156,6 KULIT 2 183 144 89 103 84 120,6 KULIT 3 100 103 85 75 101 92,8 KULIT KULIT 4 5 108 70 90 93 72 84 88 102 80 96 87,6 89 109,32 ± 13,26 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 74 Kontrol Positif KETERANGAN H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 RATA-RATA Rerata Jumlah sel neutrofil ± SE KULIT KULIT KULIT KULIT KULIT 1 2 3 4 5 77 68 41 94 61 43 79 30 96 77 38 54 73 92 84 49 50 61 89 90 62 51 63 83 87 53,8 60,4 53,6 90,8 79,8 67,68 ± 7,50 Perlakuan ekstrak biji Milk Thistle konsentrasi 1,67% KETERANGAN EESM-1 EESM-2 EESM-3 EESM-4 EESM-5 RATA-RATA Rerata Jumlah sel neutrofil ± SE KULIT 1 120 73 105 63 84 89 KULIT 2 78 60 70 45 70 64,6 KULIT 3 57 56 67 70 105 71 KULIT 4 94 88 79 78 84 84,6 KULIT 5 71 88 91 66 84 80 77,84 ± 4,45 Perlakuan ekstrak biji Milk Thistle konsentrasi 2,5% KULIT KULIT KULIT KULIT KULIT KETERANGAN 1 2 3 4 5 EESM-1 110 66 69 45 61 EESM-2 65 85 62 48 52 EESM-3 69 67 64 37 39 EESM-4 74 69 78 45 42 EESM-5 77 65 78 42 32 RATA-RATA 79 70,4 78 43,4 45,2 Rerata Jumlah sel 61,64 ± 7,26 neutrofil ± SE PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 75 Perlakuan ekstrak biji Milk Thistle konsentrasi 3,75% KULIT KULIT KULIT KULIT KULIT KETERANGAN 1 2 3 4 5 EESM-1 60 57 54 35 33 EESM-2 56 48 46 50 26 EESM-3 37 42 45 33 32 EESM-4 35 43 36 48 32 EESM-5 67 39 38 38 28 RATA-RATA 51 45,8 43,8 40,8 30,2 Rerata Jumlah sel 42,32 ± 3,45 neutrofil ± SE Lampiran 8. Data rerata persen penghambatan ekspresi COX-2. Preparat Kulit Repe tisi 1 I II Karagenin III IV Sel Rerata Sel % COXMEAN % PI ± Hitung Penekanan 2 SE 126 125 0,79 2 3 136 134 1,47 122 121 0,82 4 136 135 0,74 5 156 155 0,64 1 217 216 0,46 2 3 161 158 1,86 165 163 1,21 4 182 180 1,10 5 184 183 0,54 1 257 246 4,28 2 3 274 267 2,55 260 254 2,31 4 229 222 3,06 5 167 163 2,40 1 179 178 0,56 2 159 157 1,26 0,89 1,04 1,44 ± 0,37 2,92 1,06 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 76 V Preparat Kulit 3 186 185 0,54 4 143 141 1,40 5 192 189 1,56 1 241 237 1,66 2 3 258 255 1,16 257 254 1,17 4 271 268 1,11 5 258 254 1,55 Repe Tisi 1 I II Biocream® III IV 1,33 Sel Rerata Sel % COXMEAN % PI Hitung Penekanan 2 ± SE 228 222 2,63 2 3 249 211 245 206 1,61 4 195 189 3,08 5 1 178 221 171 217 3,93 1,81 2 3 261 255 2,30 247 243 1,62 4 239 237 0,84 5 1 268 222 265 217 1,12 2,25 2 3 210 205 2,38 184 182 1,09 4 220 215 2,27 5 1 203 239 199 234 1,97 2,09 2 3 242 238 1,65 165 164 0,61 4 285 280 1,75 2,72 2,37 1,54 2,01 ± 0,22 1,99 1,58 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 77 V Preparat 5 1 220 207 216 203 1,82 1,93 2 3 210 204 2,86 208 203 2,40 4 204 200 1,96 5 140 137 2,14 Kulit Repetisi I II Kontrol positif III IV Sel Hitung 2,26 Sel Rerata % COXMEAN % PI Penekanan 2 ± SE 40 79,70 1 197 2 3 206 36 82,52 218 47 78,44 4 208 58 72,12 5 1 223 230 58 55 73,99 76,09 2 3 218 48 77,98 195 48 75,38 4 230 44 80,87 5 1 218 228 56 55 74,31 75,88 2 3 228 49 78,51 198 48 75,76 4 256 61 76,17 5 1 250 225 53 58 78,80 74,22 2 3 209 51 75,60 131 22 83,21 4 192 42 78,13 5 144 27 81,25 77,35 76,93 76,60 ± 0,88 77,02 78,48 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 78 V 1 211 58 72,51 2 3 179 40 77,65 164 44 73,17 4 154 45 70,78 5 154 43 72,08 73,24 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 79 Preparat Kulit Repetisi 1 I II Sylibum marianum L. 1,67% III IV V Sel Rerata Sel % COXMEAN % PI Hitung Penekanan 2 ± SE 118 104 11,86 2 3 127 107 15,75 116 101 12,93 4 135 120 11,11 5 1 116 100 100 83 13,79 17,00 2 3 113 91 19,47 122 106 13,11 4 116 101 12,93 5 1 124 122 108 112 12,90 8,20 2 3 117 101 13,68 111 97 12,61 4 103 91 11,65 5 1 117 108 102 97 12,82 10,19 2 3 109 99 9,17 107 95 11,21 4 105 94 10,48 5 1 100 94 91 88 9,00 6,38 2 3 99 91 8,08 96 89 7,29 4 100 90 10,00 5 94 87 7,45 13,09 15,08 11,79 10,01 7,84 11,56 ± 1,24 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 80 Preparat Kulit Repetisi 1 I II Sylibum marianum L. L. 2,5% III IV V Sel Rerata Sel % COXMEAN % PI Hitung Penekanan 2 ± SE 84 71 15,48 2 3 88 74 15,91 77 65 15,58 4 83 70 15,66 5 1 88 82 75 69 14,77 15,85 2 3 82 66 19,51 86 71 17,44 4 84 70 16,67 5 1 86 84 72 69 16,28 17,86 2 3 81 70 13,58 93 83 10,75 4 83 72 13,25 5 1 79 76 70 65 11,39 14,47 2 3 80 71 11,25 79 85 11,24 4 89 93 5 1 83 90 72 78 13,25 13,33 2 3 88 78 11,36 82 70 14,63 4 80 72 10,00 5 83 74 10,84 15,48 17,15 13,37 11,76 8,60 12,03 13,95 ± 1,03 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 81 Preparat Kuli t I II Sylibum marianumL . 3,75% III IV V Repetis i Sel Hitun g Sel COX -2 % Penekana n 1 49 45 8,16 2 3 66 60 9,09 62 58 6,45 4 63 56 11,11 5 1 57 64 51 57 10,53 10,94 2 3 64 59 7,81 52 46 11,54 4 52 46 9,80 5 1 59 57 53 53 10,17 7,02 2 3 59 54 8,47 53 48 9,43 4 53 46 13,21 5 1 58 54 50 51 13,79 5,56 2 3 59 55 6,78 51 48 5,88 4 63 59 6,35 5 1 58 54 52 51 10,34 5,56 2 3 53 49 7,55 50 47 6,00 4 58 55 5,17 5 56 53 5,36 MEA N Rerat a% PI ± SE 9,07 10,05 10,39 6,98 5,93 8,48 ± 0,87 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 82 Lampiran 9. Hasil analisi statistik perhitungan rata-rata jumlah selselneutrofil pada masing-masing kelompok. Descriptives Perlakuan neutrofil Kontrol Negatif Statistic Mean 111,3600 95% Confidence Interval for Lower Bound 91,9675 Mean Upper Bound 130,7525 5% Trimmed Mean 111,6111 Median 113,8000 Variance 243,928 Std. Deviation Std. Error 6,98467 15,61819 Minimum 87,80 Maximum 130,40 Range 42,60 Interquartile Range 26,30 Skewness -,656 ,913 Kurtosis 1,268 2,000 109,3200 13,26689 Kontrol Mean Biocrea 95% Confidence Interval for Mean m Lower 72,4852 Bound Upper 146,1548 Bound 5% Trimmed Mean 107,9000 Median 92,8000 Variance 880,052 Std. Deviation 29,66567 Minimum 87,60 Maximum 156,60 Range 69,00 Interquartile Range 50,30 Skewness 1,340 ,913 Kurtosis ,846 2,000 67,6800 7,50109 Kontrol Mean Positif 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound 46,8536 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 83 Upper 88,5064 Bound 5% Trimmed Mean 67,1778 Median 60,4000 Variance 281,332 Std. Deviation 16,77295 Minimum 53,60 Maximum 90,80 Range 37,20 Interquartile Range 31,60 Skewness Kurtosis SM Mean Konsent 95% Confidence Interval for Mean rasi Lower 1,67% Upper ,732 ,913 -1,895 2,000 77,8400 4,45529 65,4701 Bound 90,2099 Bound 5% Trimmed Mean 77,9556 Median 80,0000 Variance 99,248 Std. Deviation SM 9,96233 Minimum 64,60 Maximum 89,00 Range 24,40 Interquartile Range 19,00 Skewness -,393 ,913 Kurtosis -1,586 2,000 61,6400 7,26069 Mean Konsent 95% Confidence Interval for Mean rasi Lower 2,5% Upper 41,4811 Bound 81,7989 Bound 5% Trimmed Mean 61,6889 Median 70,2000 Variance 263,588 Std. Deviation 16,23539 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 84 SM Minimum 43,40 Maximum 79,00 Range 35,60 Interquartile Range 30,40 Skewness -,388 ,913 Kurtosis -2,858 2,000 42,3200 3,45578 Mean Konsent 95% Confidence Interval for Mean rasi Low 3,75% Bou 32,7252 er nd Upp 51,9148 er Bou nd 5% Trimmed Mean 42,5111 Median 43,8000 Variance 59,712 Std. Deviation *SM 7,72735 Minimum 30,20 Maximum 51,00 Range 20,80 Interquartile Range 12,90 Skewness -,979 ,913 Kurtosis 1,610 2,000 : Ekstrak Silybum marianum L. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 85 Lampiran 10. Hasil analisis statistik uji normalitas dengan uji Shapiro-Wilk Tests of Normality a Kolmogorov-Smirnov Statistic neutrofil ,115 df Shapiro-Wilk Sig. 30 Statistic ,200 * df ,959 Sig. 30 ,296 a. Lilliefors Significance Correction Tests of Normality Perlakuan a Kolmogorov-Smirnov Statistic neutrofil df Shapiro-Wilk Sig. Statistic df Sig. * ,968 5 ,860 Kontrol Negatif ,200 5 ,200 Kontrol Biocream ,311 5 ,128 ,813 5 ,102 ,854 5 ,207 Kontrol Positif ,268 5 ,200 * SM Konsentrasi ,186 5 ,200 * ,958 5 ,793 ,301 5 ,157 ,839 5 ,162 ,222 5 ,200 * ,946 5 ,708 1,67% SM Konsentrasi 2,5% SM Konsentrasi 3,75% a. Lilliefors Significance Correction *SM : EkstrakSilybum marianum L. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 86 Perlakuan Case Processing Summary Perlakuan Cases Valid N Neutrofil Kontrol Negatif Missing Percent N Percent Total N Percent 5 100,0% 0 ,0% 5 100,0% Kontrol Biocream 5 100,0% 0 ,0% 5 100,0% Kontrol Positif 5 100,0% 0 ,0% 5 100,0% SM Konsentrasi 5 100,0% 0 ,0% 5 100,0% 5 100,0% 0 ,0% 5 100,0% 5 100,0% 0 ,0% 5 100,0% 1,67% SM Konsentrasi 2,5% SM Konsentrasi 3,75% *SM : Ekstrak Etanol Buah Silybum marianum L. Lampiran 11. Hasil pengujian ANOVA Oneway Test of Homogeneity of Variances Neutrofil Levene Statistic 3,056 df1 df2 5 Sig. 24 ,028 ANOVA Neutrofil Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square 18701,472 5 3740,294 7311,440 24 304,643 26012,912 29 F 12,278 Sig. ,000 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 87 Lampiran 12. Hasil pengujian uji Post-Hoct dengan uji Scheffe Multiple Comparisons neutrofil Scheffe (I) (J) Perlakuan Perlakuan 95% Confidence Interval Mean Difference (I-J) Std. Error Kontrol Kontrol Biocream Negatif Kontrol Positif 43,68000 Konsentrasi Sig. Lower Upper Bound Bound 2,04000 11,03890 1,000 -37,9191 41,9991 * 11,03890 ,026 3,7209 83,6391 33,52000 11,03890 ,142 -6,4391 73,4791 49,72000 * 11,03890 ,008 9,7609 89,6791 69,04000 * 11,03890 ,000 29,0809 108,9991 -2,04000 11,03890 1,000 -41,9991 37,9191 Kontrol Positif 41,64000 * 11,03890 ,037 1,6809 81,5991 Konsentrasi 31,48000 11,03890 ,191 -8,4791 71,4391 47,68000 * 11,03890 ,012 7,7209 87,6391 67,00000 * 11,03890 ,000 27,0409 106,9591 - 11,03890 ,026 -83,6391 -3,7209 11,03890 ,037 -81,5991 -1,6809 -10,16000 11,03890 ,971 -50,1191 29,7991 6,04000 11,03890 ,997 -33,9191 45,9991 25,36000 11,03890 ,409 -14,5991 65,3191 Konsentra Kontrol Negatif -33,52000 11,03890 ,142 -73,4791 6,4391 si 1,67% -31,48000 11,03890 ,191 -71,4391 8,4791 Kontrol Positif 10,16000 11,03890 ,971 -29,7991 50,1191 Konsentrasi 2,5% 16,20000 11,03890 ,823 -23,7591 56,1591 Konsentrasi 35,52000 11,03890 ,104 75,4791 1,67% Konsentrasi 2,5% Konsentrasi 3,75% Kontrol Biocream Kontrol Negatif 1,67% Konsentrasi 2,5% Konsentrasi 3,75% Kontrol Kontrol Negatif Positif 43,68000 Kontrol Biocream 41,64000 Konsentrasi * * 1,67% Konsentrasi 2,5% Konsentrasi 3,75% Kontrol Biocream 3,75% -4,4391 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 88 Konsentra Kontrol Negatif - si 2,5% * 11,03890 ,008 -89,6791 -9,7609 11,03890 ,012 -87,6391 -7,7209 -6,04000 11,03890 ,997 -45,9991 33,9191 -16,20000 11,03890 ,823 -56,1591 23,7591 19,32000 11,03890 ,691 -20,6391 59,2791 Konsentra Kontrol Negatif - 11,03890 ,000 si 3,75% * 49,72000 Kontrol Biocream 47,68000 Kontrol Positif Konsentrasi * 1,67% Konsentrasi 3,75% 69,04000 - -29,0809 108,999 1 Kontrol Biocream 67,00000 11,03890 * ,000 - -27,0409 106,959 1 Kontrol Positif -25,36000 11,03890 ,409 -65,3191 14,5991 Konsentrasi -35,52000 11,03890 ,104 -75,4791 4,4391 -19,32000 11,03890 ,691 -59,2791 20,6391 1,67% Konsentrasi 2,5% *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets neutrofil Scheffe a Perlakuan Subset for alpha = 0.05 N 1 2 Konsentrasi 3,75% 5 42,3200 Konsentrasi 2,5% 5 61,6400 Kontrol Positif 5 67,6800 Konsentrasi 1,67% 5 77,8400 Kontrol Biocream 5 109,3200 Kontrol Negatif 5 111,3600 Sig. ,104 77,8400 ,142 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5,000. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 89 Lampiran 13. Perhitungan persen penghambatan inflamasi ekspresi COX-2 Case Processing Summary Cases Valid N PersenPI Missing Percent 30 N 100,0% Total Percent 0 N Percent ,0% 30 100,0% Perlakuan Case Processing Summary Cases Valid Kelompok Perlakuan Persen N Percent Missing N Percent Total N Percent Kontrol Negatif Penekanan 5 100.0% 0 .0% 5 100.0% 5 100.0% 0 .0% 5 100.0% 5 100.0% 0 .0% 5 100.0% 5 100.0% 0 .0% 5 100.0% 5 100.0% 0 .0% 5 100.0% 5 100.0% 0 .0% 5 100.0% Ekspresi COX-2 Kontrol Biocream Kontrol Positif Ekstrak SM 1,65% Ekstrak SM 2,5% Ekstrak SM 3,75% PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 90 Lampiran 14. Hasil uji normalitas dengan Shapiro-Wilk Tests of Normality a Kolmogorov-Smirnov Kelompok Perlakuan Persen Penekanan Statistic df Shapiro-Wilk Sig. Statistic df Sig. Kontrol Negatif .356 5 .037 .717 5 .014 Kontrol Biocream .211 5 .200 * .928 5 .581 Kontrol Positif .365 5 .028 .820 5 .117 Ekstrak SM 1,65% .133 5 .200 * .995 5 .993 Ekstrak SM 2,5% .201 5 .200 * .911 5 .472 Ekstrak SM 3,75% .218 5 .200 * .902 5 .422 Ekspresi COX-2 a. Lilliefors Significance Correction *. This is a lower bound of the true significance. Lampiran 15. Hasil perhitungan rata-rata persen penghambatan inflamasi penekanan ekspresi COX-2 pada masing-masing perlakuan Descriptives Kelompok Perlakuan Statistic Persen Kontrol Mean Penekanan Negatif 95% Confidence Interval Lower Bound Ekspresi for Mean COX-2 Kontrol Std. Error 1.4478 .37449 .4081 Upper Bound 2.4876 5% Trimmed Mean 1.3970 Median 1.0631 Variance .701 Std. Deviation .83739 Minimum .89 Maximum 2.92 Range 2.03 Interquartile Range 1.16 Skewness 2.046 .913 Kurtosis 4.277 Mean 2.000 2.0194 .22087 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 91 Biocrea 95% Confidence Lower Bound 1.4062 m Interval for Mean Upper Bound 2.6327 5% Trimmed Mean 2.0071 Median 1.9927 Variance .244 Std. Deviation .49389 Minimum 1.54 Maximum 2.72 Range 1.19 Interquartile Range .93 Skewness .582 Kurtosis .913 -.881 Kontrol Mean Positif 95% Confidence Lower Bound 74.1455 Interval for Mean Upper Bound 79.0634 76.6045 .88564 5% Trimmed Mean 76.6872 Median 77.0231 Variance 3.922 Std. Deviation 1.98035 Minimum 73.24 Maximum 78.48 Range 5.24 Interquartile Range 2.83 Skewness -1.663 .913 Kurtosis Ekstrak Mean SM 95% Confidence Interval Lower 1,65% for Mean Bound Upper Bound 3.465 2.000 11.5630 1.24590 8.1038 15.0221 5% Trimmed Mean 11.5742 Median 11.7911 Variance Std. Deviation Minimum 2.000 7.761 2.78592 7.84 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 92 Maximum Ekstrak 15.08 Range 7.24 Interquartile Range 5.16 Skewness -.156 .913 Kurtosis -.594 2.000 13.9593 1.03388 Mean SM 2,5% 95% Confidence Interval Lower Bound for Mean Upper Bound 11.0888 16.8299 5% Trimmed Mean 13.9041 Median 13.3671 Variance 5.345 Std. Deviation 2.31184 Minimum 11.76 Maximum 17.15 Range 5.39 Interquartile Range 4.42 Skewness .610 .913 Kurtosis -1.602 Ekstrak Mean 8.4830 .87214 SM 95% Confidence Interval Lower Bound 6.0616 3,75% for Mean Upper Bound 10.9045 5% Trimmed Mean 8.5194 Median 9.0686 Variance Std. Deviation 3.803 1.95016 Minimum 5.93 Maximum 10.39 Range 4.46 Interquartile Range 3.76 Skewness Kurtosis 2.000 -.513 .913 -2.204 2.000 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 93 Lampiran 16. Hasil pengujian Kruskal-Wallis Descriptive Statistics Std. N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean 30 19.0128 30 3.5000 Deviation Minimum Maximum 26.66341 .89 78.48 1.73702 1.00 6.00 Kruskal-Wallis Test Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Persen Penekanan Kontrol Negatif 5 4.00 Ekspresi COX-2 Kontrol Biocream 5 7.00 Kontrol Positif 5 28.00 Ekstrak SM 1,65% 5 18.20 Ekstrak SM 2,5% 5 21.80 Ekstrak SM 3,75% 5 14.00 Total 30 a,b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX2 Chi-Square 26.450 Df Asymp. Sig. a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan 5 .000 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 94 Lampiran 17. Hasil pengujian Mann-Whitney Test Descriptive Statistics Std. N Mean Deviation Minimum Maximum Persen Penekanan 30 19.0128 30 3.5000 26.66341 .89 78.48 Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan 1.73702 1.00 6.00 Mann-Whitney Test Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Kontrol Negatif 5 4.00 20.00 Penekanan Kontrol Biocream 5 7.00 35.00 Ekspresi COX- Total 10 2 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 95 Descriptive Statistics Std. N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean Deviation 30 19.0128 30 3.5000 Minimum Maximum 26.66341 .89 1.73702 78.48 1.00 6.00 Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol Negatif 5 4.00 20.00 Ekspresi COX-2 5 7.00 35.00 Kontrol Biocream Total 10 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U 5.000 Wilcoxon W 20.000 Z -1.567 Asymp. Sig. (2-tailed) .117 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .151 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean 30 19.0128 30 3.5000 Std. Deviation Minimum 26.66341 .89 1.73702 Maximum 78.48 1.00 6.00 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 96 Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Kontrol Negatif 5 3.00 15.00 Penekanan Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Ekspresi Total 10 COX-2 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics Std. N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean 30 19.0128 30 3.5000 Deviation Minimum Maximum 26.66341 .89 78.48 1.73702 1.00 6.00 Ranks Kelompok Perlakuan Sum of N Mean Rank Ranks Persen Penekanan Kontrol Negatif 5 3.00 15.00 Ekspresi COX-2 Ekstrak SM 1,65% 5 8.00 40.00 Total 10 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 97 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics Std. N Mean Deviation Minimum 30 19.0128 26.66341 .89 30 3.5000 Maximum Persen Penekanan 78.48 Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan 1.73702 1.00 6.00 Ranks Kelompok Perlakuan Persen Penekanan Kontrol Negatif Ekspresi COX-2 Ekstrak SM 2,5% Total Mean N Rank Sum of Ranks 5 3.00 15.00 5 8.00 40.00 10 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 98 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics Maximu N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean 30 19.0128 30 3.5000 Std. Deviation Minimum 26.66341 .89 1.73702 m 78.48 1.00 6.00 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol Negatif 5 3.00 15.00 Ekspresi COX-2 Ekstrak SM 3,75% 5 8.00 40.00 Total 10 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 99 Descriptive Statistics N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean 30 19.0128 30 3.5000 Std. Deviation Minimum Maximum 26.66341 .89 78.48 1.73702 1.00 6.00 Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol Biocream 5 3.00 15.00 Ekspresi COX-2 Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Total 10 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics Std. N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean 30 19.0128 30 3.5000 Deviation Minimum 26.66341 .89 1.73702 Maximum 78.48 1.00 6.00 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 100 Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Kontrol Biocream 5 3.00 15.00 Penekanan Ekstrak SM 1,65% 5 8.00 40.00 Ekspresi COX- Total 10 2 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics N Mean Std. Deviation Minimum Maximum Persen Penekanan 30 19.0128 30 3.5000 26.66341 .89 78.48 Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan 1.73702 1.00 6.00 Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol Biocream 5 3.00 15.00 Ekspresi COX-2 Ekstrak SM 2,5% 5 8.00 40.00 Total 10 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 101 Descriptive Statistics Std. N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean 30 19.0128 30 3.5000 Deviation Minimum Maximum 26.66341 .89 1.73702 78.48 1.00 6.00 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics Std. N Mean Deviation Minimum 30 19.0128 26.66341 .89 30 3.5000 Maximum Persen Penekanan 78.48 Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan 1.73702 1.00 6.00 Mean Rank Sum of Ranks Ranks Kelompok Perlakuan N Persen Penekanan Kontrol Biocream 5 3.00 15.00 Ekspresi COX-2 Ekstrak SM 3,75% 5 8.00 40.00 Total 10 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 102 Descriptive Statistics N Mean Std. Deviation Minimum Maximum Persen Penekanan Ekspresi 30 19.0128 30 3.5000 26.66341 .89 78.48 COX-2 Kelompok Perlakuan 1.73702 1.00 6.00 Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Penekanan Ekstrak SM 1,65% 5 3.00 15.00 Ekspresi COX-2 Total 10 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean 30 19.0128 30 3.5000 Std. Deviation Minimum 26.66341 .89 1.73702 Maximum 78.48 1.00 6.00 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 103 Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Penekanan Ekstrak SM 2,5% 5 3.00 15.00 Ekspresi COX- Total 10 2 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean Std. Deviation 30 19.0128 30 3.5000 Minimum 26.66341 .89 1.73702 Maximum 78.48 1.00 6.00 Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Penekanan Ekstrak SM 3,75% 5 3.00 15.00 Ekspresi COX-2 Total 10 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 104 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean Std. Deviation 30 19.0128 30 3.5000 Minimum Maximum 26.66341 .89 1.73702 78.48 1.00 6.00 Ranks Kelompok Perlakuan Persen Penekanan Ekstrak SM Ekspresi COX-2 1,65% Ekstrak SM 2,5% Total N Mean Rank Sum of Ranks 5 4.20 21.00 5 6.80 34.00 10 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 105 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U 6.000 Wilcoxon W 21.000 Z -1.358 Ranks Kelompok Perlakuan Persen Penekanan Ekspresi N Ekstrak SM 1,65% .175 Ekstrak SM 3,75% COX-2 Total .222 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics N Mean Std. Deviation Minimum Maximum Persen Penekanan 30 19.0128 30 3.5000 26.66341 .89 78.48 Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan 1.73702 1.00 6.00 Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Ekstrak SM 1,65% 5 7.00 35.00 Ekspresi COX-2 5 4.00 20.00 Ekstrak SM 3,75% Total 10 5 7.00 5 4.00 10 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] Mean Rank PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 106 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U 5.000 Wilcoxon W 20.000 Z -1.567 Asymp. Sig. (2-tailed) .117 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .151 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan Descriptive Statistics N Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Kelompok Perlakuan Mean 30 19.0128 30 3.5000 Std. Deviation Minimum Maximum 26.66341 .89 1.73702 78.48 1.00 6.00 Ranks Kelompok Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Ekstrak SM 2,5% 5 8.00 40.00 Penekanan Ekstrak SM 3,75% 5 3.00 15.00 Ekspresi COX- Total 10 2 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a. Not corrected for ties. a PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 107 b Test Statistics Persen Penekanan Ekspresi COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok Perlakuan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi dengan judul : “Uji Efek ® Antiinflamasi Topikal Ekstrak Milk Thistle pada Jumlah Neutrofil dan Ekspresi COX-2 Mencit Betina Terinduksi Karagenin” bernama lengkap Sinta Atmi Utami, dilahirkan di Jepara pada tanggal 3 Mei 1995 sebagai anak kedua dari dua bersaudara dari pasangan Ngadiran dan Sudiyem. Penulis menempuh pendidikan di SD hingga SMA di Jepara, Jawa Tengah, yaitu SD N 1 Keling (2001-2007), SMP N 1 Keling (2007-2010), SMA N 1 Jepara (2010-2012), kemudian melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta (2012-2016). Semasa kuliah, penulis aktif dalam kepanitiaan, baik dalam fakultas maupun di luar fakultas. Penulis pernah menjadi sekretaris Desa Mitra 2012, sekretaris Donor Darah Farmasi Islam Sanata Dharma (FISTARA) 2014, Divisi keamanan Inisiasi Sanata Dharma 2013, dan anggota kelompok Program Kreativitas Mahasiswa bidang Pengabdian Masyarakat yang lolos dibiayai DIKTI pada tahun 2015. 108
