IDENTIFIKASI KEBERADAAN GEN NITRILASE DALAM SAMPEL

7
Tabel 1 Primer spesifik fragmen gen nitrilase
Primer
H1F
H1R
Sekuen 5’-3’
CGT ACC ACA TCT
GGG TGG ACA GC
TCC GTC TCG TCG
GAA TGT GTG GA
Tm
(ºC)
%
GC
74
60.9
72
56.5
600
500
400
Konsentrasi (mM)
Hasil Perancangan Primer
Isolasi gen nitrilase dilakukan dengan
teknik PCR. Teknik ini digunakan untuk
identifikasi suatu gen atau DNA yang spesifik.
Identifikasi keberadaan suatu gen dapat
dilakukan dengan mudah jika daerah pengapit
(flanking region) telah diketahui. Daerah
pengapit yang spesifik ini digunakan sebagai
primer. Primer gen nitrilase dirancang
berdasarkan
sekuen
Rhodococcus
rhodochrous strain tg1-A6 yang diperoleh
dari http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Kemudian
dicari homologinya dengan menggunakan
program Blast. Daerah terkonservasi gen
ditentukan dengan program ClustalW2.
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalw2/).
Pasangan primer nitrilase H1F dan H1R
yang dirancang untuk mengamplifikasi gen
sepanjang 1101 pb dapat dilihat pada Tabel 1.
Primer H1F memiliki sekuens 5’- CGT ACC
ACA TCT GGG TGG ACA GC-3’. Primer ini
memiliki nilai melting time (Tm) sebesar 74oC
dan %GC sebesar 60.9%. Berdasarkan analisis
dengan program Gen Runner, primer H1F
terdapat kemungkinan dimer sekitar 4 pb dan
hairpin loop 4 pb. Primer H1R memiliki
sekuens 5’- TCC GTC TCG TCG GAA TGT
GTG GA-3’ dengan nilai Tm 72oC dan %GC
sebesar 56.5%. Berdasarkan analisis dengan
program Gen Runner, primer H1R terdapat
kemungkinan dimer sekitar 4 pb dan hairpin
loop 4 pb. Berdasarkan analisis dengan
menggunakan program Geneious tidak
terdapat kemungkinana dimer antara pasangan
primer H1 forward dan H1 reverse hasil
rancangan.
300
200
100
0
0
5
15
Waktu (menit)
30
(a)
600
Konsentrasi (mM)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengujian Kemampuan Tiga Isolat
Bakteri (TPIK, GLB5, LP3) Sebagai
Penghasil Enzim Nitrilase
Pengujian kemampuan biotransformasi
senyawa nitril terhadap tiga isolat bakteri
yaitu TPIK, GLB5, dan LP3 dilakukan untuk
mengetahui adanya aktivitas enzim nitrilase
dalam tiga isolat bakteri tersebut. Keberadaan
aktivitas enzim ini dapat diketahui melalui
terbentuknya asam karboksilat sebagai produk
hasil degradasi senyawa nitril. Berdasarkan
hasil analisis kromatografi gas menunjukkan
bahwa ketiga isolat bakteri (TPIK, GLB5, dan
LP3)
memiliki
kemampuan
dalam
menghidrolisis asetonitril menjadi asam
asetat.
500
400
300
200
100
0
0
5
15
Waktu (menit)
30
(b)
600
Konsentrasi (mM)
dengan kecepatan 10.000 g selama 1 menit.
Sebanyak 300 μL larutan S4 ditambahkan ke
dalam kolom dan disentrifugasi kembali
dengan kecepatan 10.000 g selama 30 detik.
Selanjutnya kolom diletakkan ke dalam
tabung yang baru dan ditambah 50 µL larutan
S5, lalu disentrifugasi kembali pada kecepatan
10.000 g, suhu 4oC selama 30 detik.
500
400
300
200
100
0
0
5
15
Waktu (menit)
45
(c)
Gambar
4
Hidrolisis asetonitril (
)
menjadi asam asetat (
) oleh
(a) LP3, (b) GLB5, (c) TPIK
8
Bakteri LP3 dapat menghasilkan produk
asam asetat sebesar 15.68 mM setelah
diinkubasi selama 30 menit dan asetonitril
mengalami penurunan menjadi 165.79 mM
(Gambar
4a).
Bakteri GLB5 dapat
menghasilkan produk asam asetat sebesar
24.91 mM selama inkubasi 30 menit dan
asetonitril menurun hingga 317.31 mM
(Gambar 4b). Bakteri TPIK juga memiliki
aktivitas enzim nitrilase seperti kedua isolat
bakteri lainnya, bakteri ini mampu
menurunkan konsentrasi asetonitril sampai
0.43 mM dan produk asam asetat yang
dihasilkan yaitu sebesar 486.42 mM setelah
inkubasi selama 45 menit (Gambar 4c).
Isolat bakteri yang mampu hidup dalam
asetonitril diasumsikan memiliki enzim
nitrilase dan dapat mendegradasi asetonitril
menjadi asam karboksilat dan amonia.
Pertumbuhan bakteri dalam media yang
mengandung senyawa nitril membuktikan
bahwa bakteri mampu menghidrolisis
senyawa nitril sebagai sumber karbon dan
nitrogen untuk pertumbuhannya (Kakeya et
al. 1991). Selanjutnya ketiga isolat bakteri
yang telah diketahui memiliki aktivitas enzim
nitrilase ini diisolasi untuk memperoleh DNA
genom yang akan digunakan sebagai DNA
cetakan untuk menerapkan pasangan primer
H1F-H1R
yang
dirancang
untuk
mengamplifikasi gen nitrilase. Kemudian pita
DNA yang berhasil teramplifikasi dari ketiga
isolat bakteri tersebut digunakasn sebagai
kontrol positif untuk membuktikan bahwa
pasangan primer yang dirancang mampu
mengisolasi gen nitrilase.
DNA Isolat Bakteri
Langkah awal untuk menggandakan
jumlah molekul asam nukleat secara in vitro,
DNA genom diekstraksi dari tiga isolat
bakteri, yaitu TPIK, GLB5, dan LP3. Isolasi
DNA dilakukan dengan menggunakan metode
Guanidium Tiosianat (GES) (Pitcher et al.
1989). Pengujian terhadap DNA secara
kuantitatif bertujuan mengetahui kemurnian
dan menentukan konsentrasi DNA. Kuantitas
DNA
diukur
dengan
menggunakan
Spektrofotometer UV-VIS. Banyaknya radiasi
ultraviolet yang diserap oleh larutan DNA
berbanding lurus dengan banyaknya DNA
dalam sampel. Nilai absorban sebesar 1.0
setara dengan 50 µg/mL DNA untai ganda
(Brown 2003). Absorbansi DNA diukur pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Absorbansi 260 dapat mengukur asam
nukleat, sementara absorbansi 280 dapat
mengukur protein (Clark & Cristopher 2001).
Tabel 2 Data hasil pengukuran absorban DNA
Sampel
A260
[DNA]
µg/mL
A260/280
TPIK
1.668
834
1.913
GLB5
0.682
341
1.837
LP3
1.730
865
1.832
Berdasarkan Tabel 2, konsentrasi DNA
yang telah diisolasi berkisar antara 341 hingga
865 µg/mL. Tingkat kemurnian DNA dapat
dilihat dari A260/A280 yang merupakan
indikator adanya kontaminasi protein pada
DNA. Kemurnian DNA yang baik berada
pada kisaran 1.8 – 2.0 (Asif et al. 2000;
Sambrook & Russel 2001). Nilai A260/A280
yang diperoleh yaitu berkisar antara 1.832 –
1.913. Berdasarkan nilai tersebut dapat
diketahui bahwa sampel yang telah diisolasi
memiliki kemurnian yang cukup tinggi
terhadap kontaminasi protein, polisakarida,
ataupun pengotor lain. Sementara pengujian
DNA secara kualitatif dilakukan melalui
elektroforesis gel agarosa 1.5%. Hasil
elektroforesis menunjukkan bahwa pita DNA
telah berhasil diisolasi dengan intensitas
kemurnian yang cukup tinggi, sehingga DNA
dapat digunakan dalam tahapan selanjutnya
(Gambar 5).
M
1
2
3
1500 pb
1000 pb
500 pb
Gambar 5 Elektroforegram DNA hasil isolasi.
(M) Marker 1Kbp, (1) GLB5, (2)
LP3, (3) TPIK
Amplikon Gen Nitrilase
Amplifikasi gen nitrilase dilakukan
terhadap DNA dari isolat TPIK, GLB5, dan
LP3 sebagai DNA cetakan. Hasil pengamatan
secara kuantitatif dan kualitatif (Gambar 5)
menunjukkan bahwa ketiga isolat memiliki
pita DNA dengan intensitas yang baik dan
kemurnian yang tinggi. Fragmen gen nitrilase
diamplifikasi dengan primer yang telah
dirancang, yaitu H1 forward-H1 reverse.
Primer yang digunakan perlu dioptimasi
terlebih dahulu untuk mengamplifikasi
9
fragmen gen nitrilase. Kondisi penempelan
primer sangat mempengaruhi keberhasilan
proses PCR. Suhu annealing merupakan
bagian kritis dan sangat menentukan
keberhasilan PCR. Perkiraan suhu annealing
yang digunakan ditentukan berdasarkan nilai
Tm, yaitu 5ºC di bawah nilai Tm (McPherson
& Moller 2006). Optimasi terhadap suhu
annealing dilakukan dengan PCR gradien
dengan variasi suhu antara 50 ºC hingga 70ºC.
Visualisasi hasil PCR dilakukan pada gel
agarosa 1.5%.
Pita DNA tunggal diharapkan dapat
terbentuk dalam tahap optimasi suhu
annealing. jika suhu annealing terlalu tinggi,
maka primer tidak dapat menempel secara
efesien atau bahkan tidak menempel pada
DNA cetakan. Sebaliknya, jika suhu annealing
terlalu rendah kemungkinan akan terjadi
penempelan primer yang bersifat tidak
spesifik sehingga mengakibatkan adanya
amplifikasi pada bagian DNA yang tidak
diinginkan (Chakrabarti 2004; Yuwono 2006).
Hasil visualisasi elektroforesis DNA
memperlihatkan bahwa PCR dengan pasangan
primer H1F dan H1R pada variasi suhu
annealing 58 ºC hingga 66 ºC menghasilkan
pita tunggal dengan intensitas yang tinggi,
yaitu pada kisaran 960 pb. Berdasarkan hasil
pengamatan, pada semua variasi suhu 58 ºC
hingga 66 ºC dapat digunakan sebagai suhu
annealing optimum dalam tahap PCR. Pada
elektroforegram (Gambar 6), produk PCR
tidak memperlihatkan pita dengan ukuran
yang diinginkan (1101 pb). Hasil amplifikasi
ini menunjukkan bahwa primer H1F dan H1R
yang dirancang berdasarkan sekuen gen
nitrilase Rhodococcus rhodochrous strain tg1A6
tidak
berhasil
mengamplifikasi
keselurahan gen (full lenght gene) nitrilase
pada bakteri.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1500 pb
1000 pb
500 pb
Gambar 6 Elektroforegram produk PCR hasil
optimasi suhu annealing. (M)
Marker 1Kbp, (1-2) 58 ºC, (3-4)
61 ºC, (5-6) 62 ºC, (7-8) 64 ºC,
(9-10) 66ºC
Hasil Ekstraksi dan Pemurnian Fragmen
Gen Nitrilase
Gen
nitrilase
diharapkan
dapat
teramplifikasi secara penuh (full lenght gene)
dengan pasangan primer H1F dan H1R.
Namun, berdasarkan pengamatan visualisasi
hasil amplifikasi pada elektroforegram
(Gambar 7), dihasilkan pita berukuran sekitar
960 pb dengan intensitas yang sangat tinggi.
Produk PCR berukuran 960 pb ini diduga
merupakan gen nitrilase parsial (partial gene).
Oleh karena itu, sekuensing terhadap produk
PCR dilakukan untuk mengetahui sekuen dari
fragmen gen tersebut.
Amplikon berukuran 960 pb tersebut
diekstraksi dan dipurifikasi menggunakan Gel
Extraction Kit (Qiagen) untuk menghilangkan
berbagai pengotor seperti primer, nukleotida,
komponen bufer, enzim, protein, maupun
RNA yang dapat menganggu proses
sekuensing. Selanjutnya hasil ekstraksi dan
purifikasi gel dikonfirmasi pada gel agarose
1,5% dengan mengunakan elektroforesis.
Hasil ekstraksi dan purifikasi DNA dapat
dilihat dari terbentuknya pita tunggal.
Visualisasi hasil ekstraksi dan purifikasi dapat
diamati pada Gambar 8 yang memperlihatkan
bahwa terdapat pita DNA tunggal berukuran
sekitar 960 pb yang terhindar dari kontaminasi
protein maupun RNA.
Gambar 7 Elektroforegram hasil ekstraksi dan
pemurnian fragmen gen nitrilase.
(1) Marker 1 Kbp, (2-3) TPIK, (45) GLB5, (6-7) LP3
Hasil Urutan Basa Gen Nitrilase
Gen nitrilase hasil amplifikasi disekuen
dengan menggunakan primer H1F-H1R. Hasil
sekuensing berupa urutan basa sebesar 969 pb
(Lampiran 5) dianalisis dengan program
BLASTN untuk membandingkan suatu
sekuen nukleotida (query sequence) yang kita
miliki dengan database sekuen nukleotida
sehingga output yang didapat berupa identitas
nukleotida tersebut, antara lain nama gen dan
spesies penghasil dari sekuen lengkapnya.
10
Tingkat homologi yang baik, dapat dilihat dari
parameter nilai skor (bits) yang lebih dari 150
dan E value kurang dari 10-4 (Claverie &
Notredam 2003).
Hasil analisis BLASTN dari sekuen
fragmen gen nitrilase yang diamplifikasi
dengan menggunakan pasangan primer H1FH1R dapat dilihat pada Tabel 3. Berdasarkan
hasil tersebut diketahui bahwa urutan basa
yang diperoleh memiliki homologi yang tinggi
yaitu
sebesar
98%
dengan
sekuen
Rhodococcus rhodochrous strain tg1-A6
nitrilase gene. Selanjutnya dilakukan analisis
penyejajaran (alignment) dengan program
Geneious1 terhadap hasil sekuen fragmen gen
forward dan reverse yang diperoleh
(Lampiran 5). Tujuan dari analisis alignment
yaitu mengetahui urutan basa yang sama
(overlap)
dari
hasil
sekuen
yang
menggunakan primer forward dan reverse.
Berdasarkan hasil analisis fragmen hasil
sekuen dengan primer H1 forward dan reverse
complement H1 reverse, dapat dinyatakan
bahwa terdapat daerah yang overlap sebesar
714 pb (Lampiran 7). Data dalam
www.uniprot.org memperlihatkan bahwa situs
aktif dari enzim nitrilase Rhodococcus
rhodochrous berupa residu asam amino sistein
terkonservasi yang berada pada asam amino
urutan 165 (Lampiran 8). Berdasarkan hasil
sekuensing dan penyejajaran, fragmen gen
dengan ukuran 960 pb yang berhasil
diamplifikasi tersebut masih menunjukkan
adanya residu sistein terkonservasi yang
penting untuk aktivitas katalitik. Fungsi dari
sistein terkonservasi tersebut berperan sebagai
nukleofil.
Mekanisme
nitrilase
kemungkinanmelibatkan serangan nukleofilik
pada atom karbon nitril oleh gugus sulfihidril
(tiol) yang terdapat pada residu sistein dengan
protonasi yang sesuai terhadap nitrogen untuk
membentuk senyawa antara tetrahedral
tiomidat yang kovalen dan protonasi atom
nitrogen kemudian terjadi, dan nitrogen ini
dibuang sebagai amonia (Gambar 8)
Terjadinya mutasi pada asam amino sistein
menjadi alanin atau serin akan mengakibatkan
enzim nitrilase kehilangan aktivitasnya
(Frederick 2006).
Tabel 3 Hasil analisis BLASTN fragmen gen
nitrilase menggunakan primer H1F-R
Sekuen yang bersesuaian
Rhodococcus
rhodochrous strain tg1A6 nitrilase gene...
Rhodococcus
rhodochrous DNA for
nitrilase and nitrilase...
Rhodococcus
rhodochrous gene for
nitrilase, complete cds
Rhodococcus
rhodochrous aliphatic
nitrilase gene, complete
cds
Score (bits)
Max
ident
1564
98%
1447
95%
1447
95%
141
65%
*hanya
ditampilkan sebagian,
ditampilkan pada Lampiran 6
secara
lengkap
Hasil Identifikasi Keberadan Gen Nitrilase
dalam Sampel Tanah melalui Pendekatan
Metagenomik
Sampel yang dipilih adalah tanah yang
diduga mengandung gen nitrilase. Isolasi
DNA dilakukan dengan strategi lisis secara
langsung dan tidak memerlukan isolasi dari
mikroorganisme terlebih dahulu sebelumnya.
Tahap awal dalam metode isolasi lisis
langsung yaitu penghancuran matriks tanah
dan pelisisan sel bakteri. Metode lisis mekanis
menggunakan bead mill homogenization.
Selain itu, penghancuran secara fisik
dilakukan untuk mengefektifkan proses
pemisahan mikroorganisme dari matriks
tanah, sehingga dapat memudahkan terjadinya
proses lisis. Sementara lisis secara kimiawi
dengan detergen SDS digunakan untuk melisis
membran sel (Berthelet et al. 1996).
Selanjutnya presipitasi dengan isopropanol
dapat menghasilkan jumlah DNA yang cukup
banyak tanpa merusak kemurniannya (Meyer
2006).
Pengujian DNA secara kuantitatif
memperlihatkan konsentrasi DNA yang telah
diisolasi yaitu sebesar 25 µg/mL dan nilai
A260/A280 yang diperoleh sebesar 0.6377. Nilai
tersebut menunjukkan bahwa DNA hasil
isolasi masih mengandung pengotor seperti
Gambar 8 Mekanisme reaksi untuk reaksi nitrilase (Frederick 2006)