MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu

MATERI DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian
Pemuliaan dan Genetik Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan
pada bulan Oktober 2011 hingga bulan Februari 2012.
Materi
Ternak
Sampel darah yang digunakan berasal dari tiga spesies sapi yaitu Bos
javanicus (sapi Bali), Bos taurus (sapi Limousin, Simmental, Angus, dan FH), dan
Bos indicus (sapi Brahman dan PO) dari berbagai lokasi. Sampel tersebut merupakan
koleksi Laboratorium Genetika Molekuler Ternak dengan jumlah seperti yang tertera
pada Tabel 2.
Tabel 2. Jumlah Sampel yang Digunakan dalam Penelitian
No
1
Spesies
Bos javanicus
Bangsa
Bali (59)
2
Bos taurus
Limousin (57)
Simmental (50)
Angus (6)
FH (24)
3
Bos indicus
Brahman (9)
PO (2)
Total Keseluruhan Sampel
Asal
BPTU Bali
BIBD Bali
BET Cipelang
BIB Singosari
BIB Lembang
BET Cipelang
BIB Singosari
BIB Lembang
BET Cipelang
BIB Lembang
BET Cipelang
BIB Lembang
BET Cipelang
BIB Lembang
BIB Lembang
Jumlah Sampel
9
50
13
21
23
13
18
19
5
1
7
17
5
4
2
207
Keterangan : Angka di dalam kurung menunjukkan jumlah sampel setiap bangsa sapi
Pengambilan Sampel
Bahan yang digunakan untuk pengambilan sampel adalah alkohol 70%, es,
dan kapas. Alat yang digunakan adalah jarum venoject, tabung vacutainer 10 ml, dan
termos.
Ekstraksi DNA
Bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah sampel darah,
Destilation Water (DW), NaCl, Proteinase-K, 1 x STE (5M NaCl, 2M tris HCl, 0,2M
EDTA), SDS 10% (sodium dodesil sulfat), CIAA, etanol absolute, etanol 70%,
phenol, buffer TE 80% (tris EDTA). Peralatan yang digunakan adalah tabung
eppendorf 1,5 ml, satu set mikro pipet, tip, vortexmixer, mikrosentrifuge, inkubator,
dan freezer.
Primer
Primer yang digunakan dalam penelitian untuk mengamplifikasi gen
FSHR|Alu1 berdasarkan Houde et al. (1994) adalah forward : 5’-CTG CCT CCC
TCA AGG TGC CCC TC-3’; dan reverse : 5’-CCC CCT AAG ACA TTT AGC
CAA GAA CT -3’.
Amplifikasi Gen FSHR|Alu1
Bahan yang digunakan dalam amplifikasi metode analisa PCR-RFLP
(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght Polymorphism) adalah
sampel DNA, destilated water (DW), buffer, MgCl 2 , pasangan primer fragmen Gen
FSHR|AluI, enzim Taq polymerase, dan dNTP (deoxy Nukleotida Triposfat). Alat
yang digunakan adalah satu set pipet mikro, sentrifuge, mesin thermocycler, rak dan
tabung eppendorf, tip pipet dan vortex.
Elektroforesis
Bahan yang digunakan adalah produk PCR, agarose, loading dye, marker
100 pb, 0,5 x TBE, dan Ethidium Bromide. Alat yang digunakan adalah tip pipet,
mikropipet, gelas ukur, stirrer, microwave, gel tray, pencetak untuk sumur (comb),
power supply electrophoresis 100 volt, alat foto UV trans-iluminator, dan sarung
tangan.
Genotyping (Penentuan Genotipe)
Bahan yang digunakan untuk genotyping adalah produk PCR, agarose,
loading dye, marker 100pb, enzim restriksi AluI, DW, buffer tango, 0,5 x TBE, dan
Ethidium Bromide (EtBr). Alat yang digunakan adalah tip pipet, mikropipet 10 P
Gilson, gelas kimia, gelas ukur, stirrer, microwave, gel tray, pencetak untuk sumur
10
(comb), power supply electrophoresis 100 volt, alat foto UV trans iluminator, dan
sarung tangan.
Prosedur
Pengambilan Sampel
Sampel darah diambil melalui vena jugularis dengan menggunakan jarum
venoject. Sampel darah ditaruh pada tabung vaccutainer yang ditambahkan etanol
absolute dengan perbandingan 1:2 dan disimpan dalam lemari es hingga akan
digunakan lebih lanjut.
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan metode yang dikemukakan
oleh Sambrook et al. (1989). Ekstraksi DNA dimulai dengan preparasi sampel.
Sampel darah sebanyak 200 µl dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml dan ditambahkan
1000 µl DW (destilation water). Campuran sampel darah dan DW tersebut
selanjutnya dikocok atau di vortex dan didiamkan selama lima menit, setelah itu
disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama lima menit. Bagian supernatannya
dibuang selanjutnya diulangi seperti proses sebelumnya. Tahap selanjutnya dari
ekstraksi DNA adalah degradasi protein. Proteinase-K sebanyak 10 µl,
1xSTE (sodium tris-EDTA) serta 40 µl 10% SDS
350 µl
(sodium dodesil sulfat)
ditambahkan. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 55oC selama 2 jam
sambil dikocok perlahan menggunakan alat pemutar (nutator).
Degradasi bahan organik dilakukan dengan menambahkan 40 µl 5M NaCl,
400 µl larutan fenol, dan 400 µl CIAA (chloroform iso amil alcohol), lalu dikocok
pelan pada suhu ruang selama satu jam. Tahap terakhir dari ekstraksi DNA adalah
presipitasi DNA yakni dengan larutan hasil degradasi bahan organik disentrifugasi
dengan kecepatan 12.000 selama lima menit sehingga terbentuk fase DNA. Fase
DNA tersebut selanjutnya diambil sebanyak 40 µl dan dipindahkan ke tabung baru
1,5 ml. NaCl 5M sebanyak 40 µl dan etanol absolut sebanyak 800 µl ditambahkan,
kemudian dihomogenkan, dan didiamkan over night pada suhu -20oC. Molekul DNA
kemudian dipisahkan daru etanol absolute dengan cara disentrifugasi pada kecepatan
12.000 rpm selama lima menit.Supernatan yang terbentuk dibuang sehingga
didapatkan endapan molekul DNA. Endapan tersebut didiamkan sampai kering dan
11
disuspensikan dalam 100 µl 80% buffer TE (tris EDTA) lalu di spin down. Sampel
selanjutnya dielektroforesis untuk mengetahui ada atau tidaknya DNA menggunakan
agar 1,5%.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi gen FSHR dilakukan dengan menggunakan metode PCR-RFLP.
Pereaksi yang dicampurkan untuk melakukan amplifikasi terdiri dari 1 µl sampel
DNA, 10,85 µl DW, 0,3 µl primer, 0,05 µl taq polymerase, 1,5 µl buffer, 0,3 µl
dNTP, dan 1 µl MgCl 2 . Amplifikasi invitro ini menggunakan mesin thermocycler.
Kondisi suhu yang terjadi pada setiap tahapan PCR yaitu pra-denaturasi 95oC
selama lima menit dalam satu siklus, 35 siklus untuk tahapan denaturasi 95oC selama
45 detik, annealing pada suhu 60oC selama 45 detik, dan elongasi pada suhu 72oC
selama satu menit. Tahap selanjutnya adalah elongasi akhir 72oC selama lima menit
dalam satu siklus.
Elektroforesis
Elektroforesis produk PCR dilakukan dengan terlebih dahulu membuat gel
agarose 1,5% dengan cara agarose 0,45 g dilarutkan dalam larutan 0,5 x TBE
sebanyak 30 ml lalu dipanaskan dalam microwave selama lima menit dan distirer
dengan menambahkan 2,5 µl EtBr. Larutan yang masih cair dituangkan ke dalam
pencetak gel serta sisir ditempatkan di dekat tepian gel dan dibiarkan mengeras. Sisir
dicabut setelah gel mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur. Gel selanjutnya
ditempatkan ke dalam gel tray elektroforesis yang sudah berisi larutan buffer. Produk
PCR sebanyak 5 µl dicampur dengan loading dye (bromothymol blue 0,01%, xylene
cyanol 0,01%, dan gliserol 50%) sebanyak 1 µl dengan menggunakan mikropipet
dimasukkan dalam sumur-sumur gel. Marker sebanyak 2 µl ditaruh dalam sumur
paling kiri sebagai penanda. Gel tray selanjutnya dialiri listrik 100 volt selama 30
menit, molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak
(bermigrasi) ke arah positif. Setelah elektroforesis selesai, gel agarose diambil untuk
dilihat panjang pita DNA dengan menggunakan sinar ultraviolet dalam mesin UVtransiluminator. Pembacaan fragmen DNA dilakukan dengan menarik garis lurus
antara posisi pita dari masing-masing sampel DNA dengan posisi pita DNA marker.
12
Genotyping
Tahapan RFLP dilakukan dengan memindahkan 5 µl produk PCR kedalam
tabung 0,5 ml dan ditambahkan 0,3 µl enzim restriksi AluI, buffer tango 0,7 µl, dan
DW 1 µl. Campuran tersebut kemudian diinkubator pada suhu 37oC selama 16 jam.
Sampel DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi ditambahkan
loading dye sebanyak 1 µl, dielektroforesis pada gel agarose 2% (0,6 agarose dalam
30 ml 0,5 x TBE) dengan tegangan 100 volt selama 45 menit. Setelah
dielektroforesis, gel agarose diambil untuk dilihat panjang pita DNA dengan
menggunakan sinar ultraviolet dan dibandingkan dengan marker untuk mengetahui
panjangnya. Gambar 3 merupakan posisi penempelan primer gen FSHR dan posisi
pemotongan oleh enzim AluI.
forward
1
61
121
181
241
301
ctgcctccct caaggtgccc ctcatcactg tgtccaagtc aaagatcctc ctggtcctgt
tctaccccat caactcctgt gccaacccct tcctctatgc catcttcacc aagaacttcc
gcagggattt cttcattctg ctgagcaagt ttggctgcta tgaagtgcaa gcccagacct
ataggtcaga aACCTcatcc actgcccaca actttcatcc aaggaatggc cactgccccc
cAG|CTcccag ggttactaat ggttccaatt acacccttat ccccctaaga catttagcca
agaact
reverse
Keterangan
Alel C : 5’-----tcagaaACCTcatcc-----3’
Alel G : 5’-----tcagaaAGCTcatcc-----3’
: Alel C mempunyai basa C pada posisi basa ke 193
Alel G mempunyai basa G pada posisi basa ke 193
Gambar 3. Fragmen gen Follicle Stimulating Hormone Reseptor (FSHR|AluI)
berdasakan sekuens gen FSHR di genbank (kode akses: L22319.1)
Analisis Data
Frekuensi Alel dan Genotipe
Frekuensi genotipe adalah rasio dari jumlah suatu genotipe terhadap suatu
populasi dengan menghitung perbandingan antara jumlah genotipe tertentu pada
setiap populasi. Rumus menghitung frekuensi genotipe menurut Nei dan Kumar
(2000) adalah sebagai berikut :
𝒙ii =
Keterangan :
𝑥ii
= frekuensi genotipe ke-ii
n ii
= jumlah individu bergenotipe ii
N
= jumlah individu sampel
𝒏𝒊𝒊
𝑵
13
Frekuensi alel adalah rasio suatu alel terhadap keseluruhan alel pada satu
lokus dalam populasi. Frekuensi alel (𝑥 i ) gen FSHR dapat dihitung berdasarkan
rumus Nei dan Kumar (2000) seperti di bawah ini :
𝒙i =
Keterangan :
𝑥i
n ii
n ij
N
𝟐𝒏𝒊𝒊 +∑𝒏𝒊𝒋
𝟐𝑵
= frekuensi alel ke-i
= jumlah individu bergenotipe ii
= jumlah individu bergenotipe ij
= jumlah individu sampel
Heterozigositas
Keragaman genetik dapat diketahui melalui estimasi frekuensi heterozigositas
pengamatan yang diperoleh dari masing-masing populasi dengan menggunakan
rumus Weir (1996) sebagai berikut :
𝑯𝒐 = �
𝒊≠𝒋
𝒏𝒊𝒋
𝑵
Keterangan :
Ho
= heterozigositas pengamatan (populasi)
= jumlah individu heterozigot
n ij
N
= jumlah individu yang diamati
Heterozigositas harapan (He) berdasarkan frekuensi alel dihitung dengan
menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000) :
𝒒
𝑯𝒆 = 𝟏 − � 𝒙𝟐𝒊
Keterangan :
He
= nilai heterozigositas harapan
𝑥i
= frekuensi alel
q
= jumlah alel
𝒊=𝟏
14