BAB III METODE KERJA 3.1. LOKASI DAN WAKTU

15
BAB III
METODE KERJA
3.1. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari 2012 sampai Juli 2012 di
Laboratorium Bioteknologi Tanah Departemen Ilmu Tanah dan Sumber Daya
Lahan serta Lahan milik CV. Meori Agro Jl.Atang Sanjaya KM 4 Pasir Gauk,
Bogor.
3.2. ALAT DAN BAHAN PENELITIAN
3.2.1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : Laminar air
flow, autoclave, oven, Spectrophotometer, refrigerator, perangkat elektroforesis,
perangkat PCR, Scope UV, timbangan, cawan petri, batang penyebar, erlenmeyer,
tabung reaksi, pH meter, shaker, mikropipet, tip mikro, magnetik stirer, inkubator,
tabung ependoff, jarum ose, gelas ukur, alumunium foil, karet gelang, spidol,
polybag.
3.2.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terbagi menjadi empat
bagian antara lain :
1. Isolasi dan Perbanyakan Mikrob :
Isolat bakteri koleksi CV. Meori Agro dengan kode P2, J2, PS4, Media
Pikovskaya, larutan fisiologis 0.85%, Media NB, Media NA.
2. Pengujian Kualitatif dan Kuantitatif :
Larutan PB, Larutan PC, Modified Universal Buffer (MUB) 1x, 0.5 N NaOH,
0.115 M p-nitro phenyl phosphate (p-NPP), 1 mg/ml p-nitrophenol (p-NP) ,
akuades, alkohol 95%,
3. Identifikasi Molekuler :
Larutan SDS 10%, aquabidest steril, bufer TAE, bufer TE yang mengandung
lysozyme, agarosa, larutan loading buffer, NaCl, NaCl-CTAB,
16
Kloroform:Isoamil (24:1), isopropanol, etanol 70%, 16F27 (5’-AGA GTT
TGA TCM TGG CTC AG- 3’) dan 16R1492 (5’- TAC GGY TAC CTT GTT
ACG ACT T-3’), 10 mM dNTP (deoxynucleotide triphosphates), 10x bufer
Polymerase Chain Reaction (PCR), 50 mM MgSO4, enzim Taq DNA
polimerase, dan Etidium Bromida (EtBr)
4. Penanaman tanaman sawi sendok :
Bibit tanaman sawi sendok berumur 2 minggu, tanah latosol, pupuk kandang,
pupuk anorganik SP-36 dan KCl.
3.3. METODE PENELITIAN
Penelitian dilaksanakan dalam dua tahap yaitu secara in vitro dan in vivo.
3.3.1. Penelitian secara in vitro
Penelitian secara in vitro dilakukan dalam beberapa tahap yaitu :
a. Tahap Persiapan
Tahapan persiapan penelitian ini meliputi persiapan alat-alat, pembuatan
bahan-bahan dan sterilisasi alat serta media yang akan dipakai dalam penelitian.
b. Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah
Pengambilan sampel tanah dan pengisolasian bakteri pelarut fosfat asal tanah
latosol dilakukan sebagai pembanding terhadap isolat koleksi CV. Meori Agro.
Tahapan pengambilan tanah dilakukan dengan mengambil tanah di sekitar rizosfer
tanaman jagung kemudian tanah tersebut dikeringudarakan. Kemudian sebanyak
10 gram tanah dari bahan tanah dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer yang
berisi 90 ml larutan fisiologis kemudian dibuat serial pengenceran sampai 10-5.
Sebanyak 1 ml dari pengenceran 10-3,10-4 dan 10-5 dituang di cawan petri
kemudian media pikovskaya dituangkan secara merata secara steril dan diinkubasi
selama 2-3 hari pada suhu ruang. Koloni-koloni bakteri pelarut fosfat yang
diinginkan selanjutnya dimurnikan dan disimpan di dalam medium agar-miring
Pikovskaya.
17
c. Identifikasi Molekuler
Identifikasi molekuler ini dilakukan dalam beberapa tahapan sebagai berikut,
yaitu isolasi DNA genom bakteri, elektroforesis DNA, Polymerase Chain
Reaction (PCR), dan sekuensing DNA.
Isolasi DNA Genom Bakteri. Sebanyak 2 ml kultur sel BPF yang
ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu ruang di dalam medium NB disentrifugasi
(8049,6 x g, 15 menit) untuk memisahkan koloni bakteri dari medium. Supernatan
hasil sentrifugasi dibuang dan pelet dicuci dengan 250 µl bufer TE kemudian pelet
diresuspensi menggunakan mikropipet. Hasil resuspensi diinkubasi pada suhu
370C selama 30 menit kemudian ditambahkan 50 μl larutan SDS 10% dan dibolak
balik. Selanjutnya suspensi kembali diinkubasi pada suhu 370C selama 60 menit
kemudian ditambahkan 65 μl NaCl dan 80 µl CTAB-NaCl dan diinkubasi dalam
waterbath (65ºC, 20 menit). Pada campuran tersebut kemudian ditambahkan 450
μl kloroform: isoamil (24:1), kemudian tabung Eppendoff yang berisi campuran
DNA dibolak-balik secara halus. Suspensi yang telah teremulsi disentrifugasi
(6763,9 x g, 15 menit). Supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke dalam
tabung Eppendoff steril dan ditambahkan isopropanol yang dingin (-20ºC). DNA
diendapkan dengan sentrifugasi pada suhu 40C dengan kecepatan 8049,6 x g
selama
20
menit.
Supernatan
dibuang
kemudian
dilakukan
pencucian
menggunakan etanol 70% dingin dan disentrifugasi (8049,6 x g, 2 menit).
Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan pelet DNA dikeringudarakan. DNA
yang telah didapatkan siap digunakan untuk elektroforesis atau disimpan sebagai
stock pada suhu -20ºC.
Proses Elektroforesis DNA. Larutan 50x bufer TAE diencerkan menjadi
2x bufer TAE. Kemudian dibuat gel agarosa 1%, yaitu 0,2 gram agarosa dalam 20
ml 2x bufer TAE dan ditambahkan 2 µl Et-Br yang selanjutnya dituang ke dalam
cetakan gel agarosa. Setelah gel membeku diletakkan ke dalam tangki
elektroforesis yang telah diisi 1x bufer TAE sehingga gel terendam. Sebanyak 3 μl
dari masing-masing DNA dicampur dengan 1,2 μl loading buffer sebagai
pemberat. Suspensi larutan DNA dengan loading buffer diinjeksikan ke dalam
18
sumur-sumur pada gel elektroforesis. Setelah semua sumur terisi, power supply
perangkat elektroforesis dinyalakan dengan voltase sebesar 75 V selama ± 45
menit. Selanjutnya DNA dapat dilihat dan difoto menggunakan perangkat UV
Transilluminator.
Proses Polymerase Chain Reaction (PCR). Proses PCR diawali dengan
pembuatan campuran komponen reaksi untuk PCR sebanyak 50 μl dengan
komposisi sebagai berikut : primer 10 μl 16F27 (5’-AGA GTT TGA TCM TGG
CTC AG- 3’), primer 10 μl 16R1492 (5’- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT
T-3’), 2 μl temp late DNA, PCR mix 2 5 µl d an 19 μl aquabidest steril. Running
PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan kondisi sebagai berikut, denaturasi
siklus awal atau pra-denaturasi 95ºC selama 5 menit, diikuti denaturasi untuk
siklus selanjutnya pada suhu 95ºC selama 1 menit. Penempelan primer
(annealing) dilakukan selama 1 menit pada suhu 55ºC. Polimerisasi dilakukan
selama 2 menit pada suhu 72ºC dan pada siklus terakhir, yaitu siklus ke-35
dilakukan perpanjangan waktu polimerisasi selama 10 menit. Produk hasil PCR
divisualisasi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1.0% dalam 2x bufer
TAE dengan voltase 75 volt selama ± 30 menit.
Sekuensing DNA. Produk hasil PCR dikirimkan pada PT. Genetika
Science untuk disekuen di Malaysia. Sekuen DNA yang diperoleh dibandingkan
dengan sekuen pada database European Bioinformatics Institute (EBI)
menggunakan piranti FASTA pada situs http://www.ebi.ac.uk.
d. Peremajaan Tiga Isolat Bakteri Koleksi
Ketiga isolat bakteri koleksi CV. Meori Agro yang akan dipergunakan
digoreskan pada media pikovskaya menggunakan jarum ose untuk peremajaan.
Perlakuan ini dilakukan di dalam Laminar Air Flow agar tidak terjadi
kontaminasi.
19
e. Pengujian Kualitatif Isolat Bakteri asal Tanah dan Isolat Bakteri
Isolat terpilih dan isolat koleksi yang telah diremajakan kemudian dilakukan
pengujian pelarutan P secara kualitatif. Isolat diujikan pada media pikovskaya
padat kemudian pengamatan dilakukan sampai terbentuknya zona bening di
sekitar bakteri. Koloni yang dikelilingi zona bening menunjukkan adanya
pelarutan fosfat. Pengujian secara kualitatif dilakukan dengan cara menghitung
besarnya zona bening berbanding besarnya koloni bakteri. Perhitungan pelarutan
fosfat pada media menggunakan Indeks pelarutan (IP).
IP :
B
A
A
B
Keterangan :
A : Lebar Zona bening
B : Lebar Koloni Bakteri
Gambar 4. Penghitungan Indeks Pelarutan
Satu bakteri pelarut fosfat yang unggul selanjutnya disimpan di dalam medium
agar-miring Pikovskaya untuk pengujian selanjutnya.
f. Pengujian Kuantitatif Isolat Bakteri
Pengujian Kemampuan Bakteri Koleksi dan Asal Tanah dalam
Pikovskaya cair
Mikrob terpilih diuji kemampuannya dalam melarutkan senyawa P sukar larut
(Ca 3 (PO 4 ) 2 ) di medium pikovskaya cair. Mikrob yang akan diuji diremajakan
terlebih dahulu kemudian diambil 1 ose mikrob tersebut diinokulasikan pada
pikovskaya cair dan diinkubasi selama 5 hari. Kultur diinkubasi diatas shaker
secara periodik. Pada akhir inkubasi kultur disentrifugasi dengan kecepatan
1048,12 x g selama 20 menit. Filtrat jernih yang diperoleh ditentukaan P larutnya
dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang (α) 660 nm
dan dibandingkan dengan kontrol.
20
Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase
Sebanyak 50 ml kultur sel BPF yang ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu
ruang di dalam medium Pikovskaya cair. Sebanyak 1 ml kultur, kemudian
ditambahkan 1 ml Buffer fosfat, dan 1 ml 0.115 M p-nitro phenyl phosphate (pNPP), kemudian diinkubasi selama 2 jam di dalam waterbath pada suhu 38ºC.
Setelah diinkubasi selama 2 jam, ditambahkan 1 ml CaCl 0,5 M dan 4 ml 0.5 M
NaOH kemudian dikocok dan disentrifuse. Larutan akan berubah menjadi warna
kuning, hal ini menandakan bahwa bakteri menghasilkan enzim fosfatase.
Semakin pekat warna kuning yang terbentuk, maka semakin tinggi enzim
fosfatase yang dihasilkan. Kemudian dilakukan pengenceran 10x dengan
mengambil 1 ml filtrat ditambahkan dengan 9 ml aquadest. Pengukuran
absorbansi dilakukan pada panjang gelombang (α) = 400 nm menggunakan
Spectrophotometer.
g. Pengukuran Kurva Standar Bakteri
Kurva standar populasi mikrob terpilih ditentukan untuk menyamakan jumlah
sel mikrob dalam percobaan selanjutnya. Kurva ini menyatakan hubungan antara
nilai rapat optis suspensi mikrob dengan satuan pembentuk koloni (SPK) yang
ditentukan dengan metode cawan hitung. Sehingga, inokulasi pada percobaan
selanjutnya dapat menggunakan populasi mikrob yang seragam.
Isolat-isolat yang telah didapatkan diambil menggunakan ose kemudian
ditumbuhkan pada media NB. Setelah 2 hari diinkubasi di atas shaker suspensi
bakteri di dalam medium NB diencerkan berurut 2,3,4,8,dan 10 kali dan diukur
nilai rapat optisnya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang (α) 620nm. Pada waktu yang bersamaan setiap tingkat pengenceran
tersebut diatas, populasi mikrob ditentukan dengan metode hitungan cawan.
Populasi mikrob dan nilai rapat optisnya dihubungkan dengan persamaan regresi
linier, yang digunakan sebagai kurva baku populasi mikrob di dalam medium
tersebut.
21
h. Uji Antagonis Empat Isolat Bakteri
Bakteri-bakteri yang digunakan untuk uji antagonis dapat dilihat pada Tabel 2.
Satu koloni bakteri yang tumbuh terpisah di cawan petri, diambil menggunakan
jarum ose dan digoreskan pada media NA yang telah disiapkan. Pengujian
antagonis empat isolat bakteri tersebut dilakukan pada media agar (Gambar 5,6
dan 7). Pengamatan dilakukan setiap hari terhadap koloni bakteri dengan cara
melihat pertumbuhan empat bakteri bersama-sama.
Isolat
Bakteri 2
Isolat
Bakteri 1
Cawan petri
Gambar 5. Metode Uji Antagonis 2 isolat bakteri
Isolat
Bakteri 3
Isolat
Bakteri 2
Cawan petri
Isolat
Bakteri 1
Gambar 6. Metode Uji Antagonis 3 isolat bakteri
22
Isolat
Bakteri 4
Isolat
Bakteri 1
Cawan Petri
Isolat
Bakteri 3
Isolat
Bakteri 2
Gambar 7. Metode Uji Antagonis 4 isolat bakteri
Tabel 2. Bakteri-Bakteri yang Digunakan Dalam Uji Antagonis serta Asalnya
Kode Bakteri
PS4
P2
J2
T9
Asal Isolat
Rizosfer Tanaman Nilam
Rizosfer Tanaman Kacang Tanah
Rizosfer Tanaman Jagung
Rizosfer Tanaman Jagung
3.3.2. Penelitian secara in vivo
a. Analisis Kandungan Unsur Hara Pada Tanah
Tanah yang akan dipakai untuk menanam tanaman sawi sendok diambil secara
komposit dari lima titik pada kedalaman 0-20 cm dan dicampur hingga merata,
kemudian dianalisis kandungan haranya menggunakan Metoda Bray I. Analisis
kandungan fosfor dilakukan sebelum dan sesudah perlakuan.
b. Analisis Fosfor Pada Tanah menggunakan Metode Bray I
Tanah yang akan dipakai untuk analisis ditimbang sebanyak 3 gram kemudian
ditambahkan pengekstrak Bray dan Kurt I sebanyak 30 ml lalu dikocok selama 5
menit. Kemudian larutan disaring hingga jernih. Dari larutan tersebut dipipet 1 ml
ke tabung reaksi dan ditambahkan pereaksi pewarna fosfat sebanyak 10 ml,
23
dikocok dan dibiarkan selama 10 menit. Diukur absorbansinya dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 693nm.
c. Persiapan Inokulan
Isolat-isolat yang terpilih masing-masing dipindahkan ke dalam 100 ml media
NB dengan jarum ose lalu dibiakkan di atas mesin pengocok selama 3 hari. Pada
hari yang ketiga diukur nilai rapat optis suspensi tersebut dengan spektrofotometer
dengan panjang gelombang (α) 620 nm untuk memperoleh jumlah populasi sel per
milimeter supensi. Penentuan populasi sel ini gunakan untuk menghitung jumlah
isolat yang akan diinukolasikan.
d. Penanaman dan perlakuan bibit tanaman sawi sendok
Benih sawi sendok ditumbuhkan pada media tumbuh berupa tanah dan pupuk
kandang hingga berumur 2 minggu. Kemudian bibit tanaman sawi sendok
dipindahkan ke polybag dengan media yang sama dan diberi perlakuan bakteri
dengan kepadatan bakteri 107 sel/ml dengan cara menuangkan suspensi dekat
dengan rhizosfer tanaman sawi sendok pada saat tanam kemudian diletakkan di
dalam rumah kaca dan diamati pertumbuhannya. Pupuk SP-36 dan KCl diberikan
1 minggu sebelum penanaman. Penyiraman dilakukan setiap hari dengan
mempertahankan kadar air tanah pada keadaan 80% kapasitas lapang.
Pertumbuhan tanaman sawi sendok di rumah kaca diamati setiap minggu selama ±
5 minggu.
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak
Lengkap Faktorial dengan faktor pertama yaitu perlakuan empat isolat bakteri
baik secara tunggal maupun kombinasi sebanyak 16 taraf (Tabel 3) dan faktor
kedua yaitu perlakuan dosis SP-36 sebanyak 3 taraf 50 kg/ha; 75 kg/ha; 100
kg/ha. Percoban dilakukan dengan 3 ulangan sehingga terdapat 144 satuan unit
percobaan.
24
Kombinasi perlakuan di rumah kaca :
Tabel 3. Kombinasi Perlakuan Bakteri Di Rumah Kaca
Kombinasi
Perlakuan
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
SP36
(kg/ha)
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
P2
J2
PS4
T9
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
Keterangan :
P2
: Isolat koleksi 1
PS4 : Isolat koleksi 3
J2
: Isolat koleksi 2
T9
: Isolat dari tanah
SP-36 : Pupuk anorganik
Dosis pupuk SP-36 diberikan dalam 3 dosis yaitu 50kg/ha; 75 kg/ha; 100 kg/ha
e. Peubah Yang Diamati
Jumlah daun, tinggi tanaman dan lebar daun diamati setiap minggu selama 5
minggu. Setelah tanaman sawi sendok mencapai masa akhir vegetatif (5 minggu
setelah tanam), tanaman diambil untuk menghitung biomassa segar dan kering
serta kandungan P di dalam jaringan tanaman. Tanah di dalam pot kemudian
dikering anginkan, diaduk merata untuk dianalisis P tersedianya dengan Metode
Bray I.
25
3.4.
RANCANGAN PENELITIAN
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak
Lengkap Faktorial dengan faktor pertama yaitu perlakuan empat isolat bakteri
baik secara tunggal maupun kombinasi sebanyak 16 taraf (Tabel 3) dan faktor
kedua yaitu perlakuan dosis SP-36 sebanyak 3 taraf 50 kg/ha; 75 kg/ha; 100
kg/ha. Percoban dilakukan dengan 3 ulangan sehingga terdapat 144 satuan unit
percobaan.
Menurut Gaspersz (1991), model statistik untuk percobaan dengan
menggunakan rancangan acak (RAL) Faktorial adalah sebagai berikut :
Y ijk = µ + α i + β j + (αβ) ij + E ijk
Dimana : µ
: Rata-rata (nilai tengah) respon
αi
: Pengaruh dari faktor pertama
βj
: Pengaruh dari faktor kedua
(αβ) ij : Interaksi antara faktor pertama dan kedua
E ij
: Pengaruh faktor random yang mendapat perlakuan
pertama taraf ke-i dan faktor kedua taraf ke-j dengan
ulangan ke-k
Y ij
: Nilai pengamatan pada perlakuan faktor pertama taraf ke-i
dan faktor kedua taraf ke-j dengan ulangan ke-k
Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan pengujian sidik ragam pada
selang kepercayaan 95%. Apabila hasil sidik ragam berpengaruh nyata, maka
dilakukan pengujian beda nilai tengah antar perlakuan dengan menggunakan Uji
Wilayah Berganda Duncan (DMRT) pada taraf 5%.