Sitotoksisitas Ekstrak Dan Senyawa Flavonoid

7
Gambar 8 Analisis populasi siklus sel dengan
flow cytometry (Becton 2000).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian,
yaitu mikroskop inverted, inkubator CO2,
laminar air flow cabinet, microwadah reader,
pemanas, tabung conical steril, tissue culture
flask, pH meter, wadah 96-sumur, wadah 24sumur, kamera digital, bunsen, sentrifus, pipet
mikro, eppendorf, tip, tabung ependorf, botol
kaca, dan kantong plastik. Untuk analisis sel
yang diuji menggunakan flow cytometer.
Sampel yang digunakan merupakan stok
hasil ekstraksi bertingkat dari daun sukun
yang dimiliki oleh Pusat Penelitian Kimia,
Lembaga
Penelitian
Indonesia
(LIPI)
Bandung. sampel tersebut meliputi, ekstrak
etanol, ekstrak heksana, ekstrak etil asetat,
ekstrak butanol, senyawa AC-5-1, senyawa
AC-3-1, dan senyawa siklokomunol. Kontrol
positif adalah doxorubicin. Pelarut sampel
adalah DMSO. Bahan untuk kultur sel adalah
sel T47D yang diperoleh dari stok
Laboratorium Kimia LIPI Bandung. Bahan
kimia dan media yang digunakan diantaranya
adalah trypsin-EDTA (Gibco 25200), media
DMEM Gibco 12800-017, media yang
mengandung DMEM, 10% FBS Gibco 10099141, dan PSFG Gibco 15240-062, larutan
dapar Phosphat Buffer Saline (PBS) pH 7.4,
freezing solution, etanol 70%, larutan MTT
(3(4,5dimetiltiazol-2-il)
-2,5difeniltetrazolium
bromida)
(Sigma),
Propidium Iodida (PI) (Sigma P3566),
dimetilsulfoksida (DMSO) yang berperan
dalam melarutkan senyawa polar dan senyawa
nonpolar, dan kertas saring 0.2 µm.
Metode
Metode penelitiannya terdiri atas kultur
sel, perlakuan sampel, pengamatan morfologi
sel, uji sitotoksik, analisis induksi apoptosis,
dan analisis data. (lampiran 1).
Kultur Sel
Sel kanker payudara T47D yang
digunakan merupakan koleksi Pusat Penelitian
Kimia,
LIPI
Bandung.
Kultur
sel
ditumbuhkan dalam media penumbuh
Dulbecco‟s Modified Eagle‟s Medium
(DMEM) yang mengandung 10% FBS,
antibiotik penisilin-streptomisin 1 % dan
gentamisin 0.1%. Sel dipanen dari flask
setelah 90% terjadi kepadatan pertumbuhan,
dengan trypsin-EDTA dan diinkubasi pada
suhu 37oC dengan atmosfer 5% CO2.
Persiapan Sampel
Sampel yang diperoleh berasal dari stok
daun sukun yang diekstraksi bertingkat
menggunakan
pelarut
yang
berbeda
kepolarannya dari nonpolar sampai polar.
Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi daun
sukun adalah etanol, heksana, etil asetat, dan
butanol. Proses ekstraksi dan purifikasi
tersebut menghasilkan fraksi-fraksi sehingga
diperoleh senyawa turunan flavonoid jenis
dihidrokhalkon dan prenilflavon, salah
satunya adalah senyawa AC-5-1, senyawa
AC-3-1, dan senyawa siklokomunol. Isolasi
dan identifikasi senyawa tersebut pada
Lampiran 2, 3, dan 4.
Kemampuan
daun
sukun
dalam
menghambat sel T47D diujikan pada semua
hasil ekstraksi dan senyawa yang telah
diperoleh, dikarenakan belum ditemukannya
nilai IC50 yang berpotensi. Sampel-sampel
yang diperoleh dari stok memiliki konsentrasi
berbeda sehingga perlu diencerkan dengan
DMSO terlebih dahulu sebelum perlakuan.
Konsentrasi stok awal ekstrak etanol, ekstrak
heksana, ekstrak etil asetat, dan ekstrak
butanol daun sukun berturut-turut sama yaitu
100 mg/mL dan senyawa AC-5-1, senyawa
AC-3-1,
serta
senyawa
siklokomunol
mempunyai konsentrasi stok awal 50 mM.
Konsentrasi akhir yang diperlukan untuk uji
sel hidup dalam menentukan nilai IC50 dibuat
lima konsentrasi berseri, yaitu 500 µg/mL,
250 µg/mL, 125 µg/mL, 62.5 µg/mL, dan
31.25 µg/mL pada ekstrak daun sukun.
Begitupun, untuk senyawa dibuat lima
konsentrasi berseri, yaitu 500 µM, 250 µM,
125 µM, 62.5 µM, dan 31.25 µM.
Senyawa pembanding atau kontrol positif
menggunakan doxorubicin, dibuat dengan
konsentrasi berseri pula, yaitu 1 µM, 0.5 µM,
0.25 µM, 0.125 µM, dan 0.0625 µM.
Konsentrasi yang diperlukan untuk uji induksi
apoptosis dengan flow cytomtery adalah 100
µg/mL perlakuan ekstrak dan 100 µM
perlakuan senyawa flavonoid daun sukun,