Mengetahui pengaruh getah pepaya, papain, dan

3
- Mengetahui pengaruh getah pepaya, papain, dan ekstrak etanol getah pepaya
terhadap membran S. aureus yang ditentukan dari jumlah material sitoplasma
yang dilepaskan menggunakan spektrofotometer UV-VIS.
- Mengetahui pengaruh getah pepaya, papain, dan ekstrak etanol getah pepaya
terhadap membran S. aureus menggunakan DNA probe staining yaitu SYBR
Green dan Propidium Iodida (PI).
Hipotesis
Getah pepaya diketahui memiliki efek antimikroba yang mampu
menghambat pertumbuhan beberapa bakteri. Getah pepaya diperkirakan dapat
menghambat pertumbuhan S. aureus pada produk pangan. Selain itu, juga
diperkirakan mampu mengakibatkan kebocoran pada membran sel bakteri yang
dapat dideteksi dengan menentukan jumlah material sel yang keluar akibat
kebocoran dengan cara mengukur absorbansi supernatan pada panjang gelombang
260 nm menggunakan spektrofotometer UV-VIS serta dengan menggunakan
pewarna DNA yang diamati menggunakan mikroskop fluoresens.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat menjadi sumber informasi mengenai
alternatif bahan antibakteri yang bersifat alami dan dapat diterapkan pada proses
pengolahan pangan. Selain itu, diharapkan pula penelitian ini menjadi sumber
informasi mengenai salah satu metode untuk menguji mekanisme penghambatan
oleh bahan antibakteri.
2 TINJAUAN PUSTAKA
Dangke
Dangke merupakan produk olahan susu sapi atau susu kerbau yang dibuat
dengan cara memanaskan susu. Selama proses pemasakan, ditambahkan senyawa
koagulan yaitu berupa getah pepaya hingga susu menggumpal. Gumpalan
kemudian dimasukkan ke dalam cetakan yang terbuat dari tempurung kelapa
sambil ditekan hingga cairan terpisah (Permanasari 2008). Komposisi gizi dangke
yang terbuat dari susu sapi dan susu kerbau dapat dilihat pada Tabel 1
Tabel 1 Komposisi gizi dangke dari susu sapi dan susu kerbau
Karakteristik
Dangke susu sapi Dangke susu kerbau
Kadar air (%)
55
62.8
Kadar abu (%)
2.1
2.3
Kadar lemak (%)
14.8
15.9
Kadar protein (%)
23.8
21.3
pH
6.4
6.4
Sumber : Hatta 2013
4
Teknologi pengolahan dangke merupakan teknologi pengolahan susu
menjadi produk sejenis keju yang diproduksi dengan sistem pasteurisasi dengan
bantuan enzim papain dari getah pepaya. Enzim papain yang ditambahkan
berfungsi untuk menhidrolisis protein susu sehingga dapat terpisah dan
menggumpal, yang kemudian dapat dijadikan dangke. Tahap pasteurisasi atau
pemasakan memegang peranan penting pada proses penyimpanan, sebab produk
ini sangat mudah terkontaminasi mikroorganisme sehingga proses ini penting
untuk memperpanjang masa simpan produk (LIPI 2006).
Proses penggumpalan yang optimal terjadi apabila aktivitas enzim dalam
proses penggumpalan susu cukup baik, hal ini terjadi apabila jumlah enzim
memadai untuk reaksi dan ketersediaan substrat untuk aktivitas enzim jumlahnya
sebanding. Akan tetapi penambahan enzim yang terlalu banyak akan
menimbulkan cita rasa yang kurang disukai konsumen (pahit). Oleh karena itu,
beberapa produsen menambahkan garam sebagai bahan untuk mengurangi rasa
pahit yang ditimbulkan akibat penambahan getah pepaya. Penambahan getah
pepaya sebagai sumber papain pada pembuatan dangke umumnya dilakukan pada
suhu sekitar 60 . Perlakuan ini memberikan hasil dengan jumlah protein yang
lebih tinggi dibanding penggunaan suhu yang lebih rendah (Yuniwati et al. 2008).
Getah Pepaya
Pepaya menghasilkan cairan putih seperti susu yang biasa disebut getah
yang terdiri dari beberapa kompleks senyawa kimia. Menurut El Muossaoui et al.
(2001), getah pepaya mengandung air sekitar 85% dan beberapa komponen
terlarut yang terdiri dari karohidrat (~10%), garam (~10%), lemak (~5%), dan
beberapa biomolekul seperti glutation, sistein protease (~30%), serta beberapa
protein lainnya (~5%). Getah pepaya mengandung beberapa macam enzim, di
antaranya adalah papain, kimopapain dan lisosim. Secara umum yang dimaksud
dengan papain adalah papain yang dimurnikan maupun papain yang masih kasar.
Enzim papain adalah enzim proteolitik yang terdapat pada getah tanaman papaya
(Carica papaya L). Semua bagian papaya seperti buah, daun, tangkai daun, dan
batang mengandung enzim papain dalam getahnya, tetapi bagian yang paling
banyak mengandung enzim papain adalah buahnya (Yuniwati et al. 2008).
Papain dan kimopapain dikenal memiliki kemampuan untuk memperbaiki
jaringan yang mengalami nekrosis dan mencegah infeksi. Kemampuan kedua
enzim ini sebagai antimikroba dan antioksidan berhubungan dengan pengikatan
gugus hidroksil dan kemampuan mengkelat besi (Anuar et al. 2008). Lebih lanjut,
kedua enzim ini mampu menurunkan resiko kerusakan oksidatif pada jaringan,
sehingga pada masyarakat tradisional, getah pepaya sering dimanfaatkan sebagai
penyembuh luka karena kemampuannya dalam memperpendek waktu epitalisasi
dan percepatan kontraksi luka (Gurung et al. 2009).
Pepaya digunakan sebagai bahan untuk pengobatan karena adanya enzim
proteolitik yang merupakan komponen aktif dari pepaya, yaitu papain dan
kimopapain (Namita et al. 2012). Ekstrak pepaya memiliki aktivitas sebagai
antimikroba, anti-inflamasi, antifertilitas, agen antihipertensi, terapi bisul kronik
pada kulit dan efek diuretik. Pepaya hijau mengandung dua enzim utama yang
memiliki aktivitas pencernaan cukup tinggi, yaitu papain dan kimopapain. Papain
5
dan kimopapain terdapat di dalam getah pepaya. Papain merupakan enzim yang
digunakan sebagai pengempuk daging, memiliki kemampuan melarutkan jaringan
yang telah mati dan merusak sel hidup. Batang, daun dan buah pepaya
mengandung getah dalam jumlah yang hampir sama (Mahmood et al. 2005).
Proses penyadapan getah pepaya sebaiknya dilakukan pada buah yang
berumur 2.5 sampai 3 bulan untuk mendapatkan aktivitas proteolitik yang tinggi.
Pengambilan getah dilakukan saat buah masih melekat di pohon dan ditoreh
dengan kedalaman kurang lebih 2 mm dengan menggunakan pisau stainless steel.
Penorehan dilakukan pada pukul 5 hingga 6.30 pagi atau sebelum terkena sinar
matahari. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan kondisi kelembaban lingkungan
yang tinggi agar kecepatan aliran getah pepaya menjadi lebih tinggi (Iswanto et
al. 2009).
Papain merupakan salah satu protein yang memiliki fungsi sebagai enzim
golongan protease. Papain memiliki berat molekul sebesar 23406 DA dan
tersusun atas 212 asam amino dengan empat jembatan disulfida dan residu yang
berperan pada proses katalitiknya adalah Gln19, Cys25, His158, dan His159.
Papain merupakan jenis sistein hidrolase yang stabil dan aktif dalam rentang
kondisi yang luas, bahkan pada suhu yang cukup tinggi. pH optimum untuk
aktivitas papain berkisar antara 3.0-9.0 yang berbeda untuk tiap substrat (Amri et
al. 2012). Aktivitas proteolitik enzim pada getah pepaya yang diuji dengan
menggunakan substrat kasein menunjukkan hasil optimum pada pH 8 dan suhu
75 (Chaiwut et al. 2007).
Selain komponen proteolitik, beberapa komponen bioaktif yang dikandung
getah pepaya juga memiliki peranan terhadap aktivitas antibakteri getah pepaya.
Beberapa komponen fitokimia yang dikandung oleh getah pepaya antara lain,
campuran terpenoid, asam organik, dan alkaloid yang mampu menghambat
pertumbuhan beberapa jenis bakteri (Cowan 1999). Selain itu, ekstrak getah
pepaya juga mengandung flavonoid, glikosida, saponin, dan steroid yang memiliki
peranan terhadap aktivitas antibakteri getah pepaya (Aravind et al. 2013).
Getah Pepaya sebagai Antimikroba
Getah pepaya mengandung beberapa macam komponen yang diduga
memiliki peranan terhadap aktivitasnya. Salah satu yang paling utama adalah
papain yang dikenal sebagai enzim proteolitik. Selain itu, getah pepaya juga
mengandung alkaloid, terpenoid, dan carpain. Terpenoid inilah yang mungkin
berkontribusi pada sifat antimikroba getah pepaya. Getah pepaya juga dapat
dimanfaatkan pada pembuatan pakan ternak karena aktivitas antihelmintiknya
(Adu et al. 2009). Getah pepaya memiliki aktivitas bakteriostatik terhadap
Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Salmonella Typhi,
Staphylococcus aureus, dan Proteus vulgaris. Papain yang merupakan senyawa
yang dikandung oleh getah pepaya juga memiliki aktivitas sebagai antimikroba
yang mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Papain dapat
menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus pada media agar.
Penghambatan ini dikarenakan papain mampu merusak protein
mikroorganisme yaitu dengan mengkatalisis ikatan peptida pada protein menjadi
senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti dipeptida dan asam amino. Enzim
ini memiliki gugus sulfihidril pada sisi aktifnya yang bekerja pada dinding sel dan
6
membran sitoplasma bakteri. Besar kecilnya daya hambat dapat dipengaruhi oleh
konsentrasi senyawa antimikroba, jenis mikroba, suhu, waktu, jumlah mikroba,
pH, dan zat atau bahan organik tertentu (Pakki et al. 2009).
Mekanisme aksi antibakteri papain diperkirakan terjadi akibat interaksi
dan perusakan dinding sel dan membran dari bakteri. Pada bakteri gram positif
membran sel dilindungi oleh dinding sel yang tersusun dari 30-40 lapisan
peptidoglikan yang mengandung GlcNAc, N-acetyl murmeric acid dan juga asam
amino. Hal ini mengakibatkan asam amino yang bermuatan positif dapat terikat
pada membran sel, yang akan mengakibatkan terjadinya osmotic shock dan
kebocoran isi sitoplasma. Di sisi lain, bakteri Gram negatif memiliki membran
luar dan tersusun atas lipopolisakarida yang berikatan dengan protein melalui
interaksi elektrostatik, dimana sitooligomer dengan massa molekul yang lebih
kecil dan lebih elektronegatif mampu memfasilitasi ikatan yang lebih efektif
(Seenivasan et al. 2010).
Kerusakan Membran Sel Bakteri
Membran sel merupakan bagian yang bersentuhan langsung dengan
lingkungan. Membran sel memisahkan komponen intraseluler dan lingkungan di
luar sel. Fungsi utama membran sel adalah membentuk penghalang yang bersifat
permeabel yang mengatur lintasan solut antara bagian dalam sel dengan
lingkungan luar. Banyak faktor eksternal yang mempengaruhi sifat fisikokimia
serta fungsi membran seperti suhu, tekanan, pH, aktivitas air, nutrien, ion,
aktivitas enzim, fase pertumbuhan mikroba, dan xenobiotik. Perubahan yang
dapat terjadi di antaranya adalah keseimbangan antara lapisan lipid bilayer dan
nonbilayer, stabilitas dan fluiditas membran yang akan mengubah interaksi lipidprotein (Mrozik et al. 2004).
Komponen bioaktif yang dikandung getah pepaya yang dianggap memiliki
kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri adalah senyawa fitokima
yang terdiri atas beberapa komponen dan masing-masing memiliki mekanisme
penghambatan yang berbeda (Cowan 1999). Komponen flavonoid mampu
menghambat pertumbuhan bakteri melalui beberapa mekanisme, di antaranya
adalah dengan mengganggu sintesis asam nukleat, menganggu fungsi membran
sitoplasma, dan mengganggu metabolisme energi (Hendra et al. 2011). Zakaria et
al. (2006) memperoleh hasil penghambatan ekstrak etanol daun pepaya lebih
tinggi pada bakteri Gram positif dibanding Gram negatif, hal ini dikarenakan
komponen aktif yang terdapat pada ekstrak seperti flavonoid, alkaloid, dan
saponin tidak mampu berinteraksi dengan senyawa lipopolisakarida yang terdapat
pada membran bakteri Gram negatif sehingga penghambatan ekstrak menjadi
lebih kecil dibandingkan dengan bakteri Gram positif yang membrannya lebih
tipis.
Membran sitoplasma bakteri merupakan komponen struktural yang dapat
mengalami kerusakan dan gangguan sifat fungsional bila dipaparkan pada
antimikroba. Ion K+ dan PO43- dapat keluar dari membran bila membran
mengalami kerusakan, setelah itu beberapa molekul besar seperti DNA dan RNA
juga dapat keluar dari sel. Keluarnya materi sel ini dapat dianalisis menggunkan
spektrofotometer UV-VIS. S. aureus yang merupakan bakteri Gram positif dapat
7
mengeluarkan material sel yang lebih banyak dibanding bakteri Gram negatif
seperti E. coli. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh komposisi dan struktur
dinding sel kedua bakteri ini berbeda. E. coli memiliki dinding sel yang tersusun
dari lapisan tipis peptidoglikan dan membran luar yang terbuat dari
lipopolisakarida, lipoprotein, dan fosfolipid. Sedangkan lapisan peptidoglikan S.
aureus tersusun dari sambungan yang berpori sehingga molekul asing dapat
dengan mudah masuk ke dalam sel. S. aureus tidak memiliki membran luar yang
mampu mencegah masuknya molekul asing sehingga bakteri ini lebih sensitif
terhadap antimikroba dibanding bakteri Gram negatif seperti E. coli (Xing et al.
2009).
Pengujian Aktivitas Antimikroba Berdasarkan Kerusakan Membran Sel
Antimikroba yang berupa protein dan peptida sebagian besar targetnya
pada sel adalah bagian lipid bilayer dimana peptida dapat memicu depolarisasi
dan/atau masuk ke dalam sitosol dan berinteraksi dengan bagian dalam sel target.
Banyak metode biofisika yang dapat digunakan untuk memperlajari mekanisme
interaksi pepetida-membran. Salah satu teknik yang dapat digunakan adalah
dengan menggunakan mikroskop fluoresens. Pendeteksian menggunakan
mikroskop ini dapat dilakukan dengan bantuan pewarna fluoresens. Pewarna
fluoresens yang paling umum digunakan untuk menguji viabilitas sel adalah
SYTO9 dan PI. SYTO9 mewarnai DNA dari semua bakteri, baik dengan
membran yang utuh atau rusak, sementara itu PI hanya mewarnai bakteri yang
rusak dan mampu memindahkan SYTO9 bila kedua pewarna tersebut ada.
Penggunaan kedua pewarna dengan jumlah yang tepat pada bakteri dengan
membran yang utuh akan menghasilkan warna hijau, sementara bakteri dengan
membran yang rusak akan menghasilkan warna merah (Torrent et al. 2010).
Pemeriksaan sel dengan mikroskop fluoresens juga dapat dilakukan
dengan menggunakan pewarna DNA seperti SYBR Green dan Sytox Green,
prinsip yang digunakan sama dengan yang berlaku pada pengujian menggunakan
SYTO9 dan PI (Klauth et al. 2004). PI merupakan pewarna DNA yang banyak
digunakan untuk menguji viabilitas suatu sel serta pengujian kerusakan membran
akibat aktivitas antibakteri. Pengujian dapat dilakukan dengan menggunakan flow
cytometry ataupun pengamatan menggunakan mikroskop fluoresens (Cho et al.
2009). Pengaruh antimikroba terhadap membran sel bakteri dapat dilihat dari
jumlah materi sel seperti asam nukleat metabolit dan ion yang dikeluarkan akibat
kebocoran membran. Material sel yang dikeluarkan dari dalam sel dapat
ditentukan dengan melihat Optical Density (OD) dari suspensi bakteri dan
antimikroba. Nilai OD260 ditentukan dengan menggunakan spektofotometer UVVIS pada panjang gelombang 260 nm. Semakin banyak material sel yang
dilepaskan maka nilai OD260 yang diperoleh akan semakin tinggi (Oonmetta-aree
et al, 2006).