Peningkatan efisiensi transformasi gen

TINJAUAN PUSTAKA
Botani Acacia mangium Willd
Acacia mangium Willd jenis legurn yang termasuk dalam famili
Leguminosae, sub-famili Mimosoideae. Acacia mangium Willd secara umum
dikenal sebagai brown salwood, black wattle, hickory wattle (di Australia).
Manggae hutan, tongke hutan, nak, laj, jerri (di Indonesia). Di Papua New
Guinea dikenal sebagai arr, di Malaysia dikenal sebagai nama mangium, kayu
sofada.
Di Thailand dikenal sebagai kra thin tepa.
Mangium mempunyai
beberapa nama lain, diantaranya adalah : Mangium montanum Rump dan Acasia
glaucescena, serta Rancosperma mangium (Willd) (Awang dan Taylor, 1993).
Buahnya berupa polong kering yang merekah dan melingkar ketika masak,
agak keras dengan panjang 7.8 cm dan lebar 3-5 rnrn. Biji berwarna hitam
mengkilat, lonjong, funicle berwarna oranye. Daun besar, panjangnya mencapai
25 cm, lebar 3-10 cm, berwarna hijau gelap dengan empat urat longitudinal (tiga
pada Acasia auriculiformis), daun majemuk.
Secara umum Acacia mangium
Willd mencapai tinggi 25-35 m dengan bebas cabang melebihi setengah dari total
tinggi. Diameternya dapat mencapai lebih dari 60 cm. Pada lahan yang miskin,
pohon biasanya lebih kecil, dengan rata-rata tinggi antara 7 dan 10 m. Pohon
yang masih muda berwarna hijau, kulit kasar dan beralur, berwma abu-abu atau
coklat (Awang dan Taylor, 1993).
Pada tempat tumbuh yang baik, pohon berumur 9 tahun tingginya mencapai
23 m, dengan mta-rata riap diameter 2-3 c d t h dan produksi kayunya 41.5 m3/ha.
Acacia mangium Willd tidak memerlukan persyaratan tumbuh yang tinggi. Jenis
ini dapat tumbuh pada tanah miskin hara, padang alang-alang, bekas tebangan,
tanah tererosi, tanah berbatu dan juga tanah aluvial. Acacia mangium Willd dapat
beradaptasi dengan tanah asam (pH 4.5-6.5) di dataran tropis yang lembab
(Awang dan Taylor, 1993).
Acacia mangium Willd termasuk jenis yang tumbuh cepat, tidak
memerlukan persyaratan tumbuh yang tinggi dan tidak begitu terpengaruh oleh
jenis tanahnya. Faktor lain yang mendorong pengembangan jenis ini adalah sifat
perturnbuhan yang cepat. Pada areal yang diturnbuhi alang-alang, umur 13 tahun
mencapai tinggi 25 meter dengan diameter rata-rata 27 cm serta hasil produksi
rata-rata 20 m3/ha/tahun. Acacia mangium Willd termasuk dalam kelas kuat IIIIV, berat 0,56-0,60 dengan nilai kalori rata-rata antara 4800-4900 k.cal/kg
(Dephut, 1994).
Kegunaan kayu Acacia mangium Willd
sebagai bahan
konstruksi ringan sampai berat, rangka pintu dan jendela, perabot rumah tangga
(a.1. lemari), lantai, papan dinding, tiang, tiang pancang, gerobak dan rodanya,
pemeras minyak, gagang alat, alat pertanian, kotak dan batang korek api, papan
partikel, papan serat, vinir dan kayu lapis, pulp dan kertas. Selain itu baik juga
untuk kayu bakar dan arang (Mandang dun Pandit, 1997).
Pemuliaan Tanaman secara Konvensional dan Peranan Bioteknologi
Pemuliaan tanaman merupakan kegiatan untuk mengubah susunan genetik
tanaman secara tetap, sehingga memiliki sifat atau penampilan sesuai dengan
tujuan yang diinginkan pelakunya. Pemuliaan tanaman umumnya mencakup
tindakan penangkaran, persilangan, dan seleksi. Produk pemuliaan tanaman
adalah kultivar dengan ciri-ciri yang khusus dan bermanfaat bagi penanamnya.
Dalam kerangka usaha pertanian (agribisnis), pemuliaan tanaman merupakan
bagian awalkulu dari mata rantai usaha tani dan memastikan tersedianya benih
atau bahan tanam yang baik dan bermutu tinggi (Anonim, 2007).
Pemuliaan bertujuan untuk memanfaatkan perbedaan genetika antar
individu dalam populasi, dengan maksud merubah rata-rata ekspresi sifat-sifat
yang penting secara ekonomi sehingga meningkatkan hasil. Kebanyakan dari sifat
yang dimuliakan dipengaruhi oleh faktor genetika dan faktor lingkungan
(Finkeldey, 2005). Strategi dalam pemuliaan tanaman masa kini adalah dengan
melakukan peningkatan variasi genetik yang diikuti kemudian dengan seleksi
pada keturunannya. Peningkatan variasi genetik dapat dilakukan melalui berbagai
cara: Introduksi, persilangan, manipulasi genom, manipulasi gen atau bagian
kromosom, dan transfer gen (Anonim, 2007).
Uji genetik
genotype
Materi
genetik
Hibridisasi
I
Pembiakan
vegetatif
Rekayasa genetika
Gambar 1 Diagram integrasi bioteknologi
Pertumbuhan dan Perkembangan Kayu
Kayu adalah bahan organik dengan susunan unsur 50% C, 6% H, 44% 0
(berdasar bobot), dan sedikit saja unsur lain. Kayu dapat juga disebut polimer
alami, mengingat 97-99% bobotnya berupa polimer (sekitar 90% pada kayu
tropis). Dari jumlah itu, sebesar 65-75% adalah golongan polisakarida. Dari
persfektif kimia, jaringan kayu (termasuk bahan sel dan zat antarsel) merupakan
bahan komposit yang dibangun dari berbagai polimer organik, yakni molekul
yang terbuat dari ribuan subunit atau monomer.
Struktur dasar atau materi
kerangka dari semua dinding sel kayu ialah selulosa, yaitu molekul gula linear
berantai panjang, termasuk dalam keluarga polisakarida (karbohidrat) yang
tersusun dari monomer glukosa. Untuk mengisi struktur selulosa ini, ada bahan
polisakarida lain yang berbobot molekul rendah dan memiliki rantai samping yang
pendek. Karbohidrat yang dimaksud umufnnya merupakan kombinasi-kombinasi
dari gula berkarbon 5 (xilosa dan arabinosa) dan gula berkarbon 6 (glukosa,
manosa, dan galaktosa). Kombinasi gula tersebut arnat berbeda dengan selulosa
(terutama dalam konformasi dan bobot molekul), dikenal dengan istilah
hemiselulosa (Achmadi, 1990).
Pertumbuhan kayu dalam dimensi memanjang dan melebar adalah berkat
aktivitas sel khusus yang disebut meristem. Meristem apikal terletak di bagian
ujung batang atau cabang, juga di ujung akar, dan berperan dalam pertumbuhan
memanjang (pertumbuhan primer) dari kayu. Setelah melewati tahun pertama,
mulailah kegiatan meristem lateral, atau lazim disebut kambium vaskuler. Semua
sel di dalam zone kambium adalah hidup. Pada waktu pembentukan xylem,
mulailah serangkaian transformasi yang mengubahnya menjadi unsur kayu
dewasa.
Sebagian dari turunan xylem dapat mengalami perusakan diri dan
modifikasi dinding sel, sehingga terbentuklah lumen. Selama fase pembelahan
dan pembesaran sel, dinding sel merupakan kantong yang tipis, lentur, dan dapat
melar, yang disebut dinding primer.
Menjelang akhir proses pembesaran,
mulailah pembentukan dinding sekunder ke arah lumen dari dinding primer. Serat
kayu, pembuluh, dan unsur xylem dan phloem tertentu yang tidak berfungsi
sebagai penyalur d d a t a u pendukung, biasanya membentuk dinding sekunder
(Haygreen et al., 2002).
Gen xyloglucanase
Xyloglucanase merupakan sejenis enzim yang mengkatalisis reaksi
hidrolisis xyloglucan (Irwin et al., 2003). Xyloglucan adalah penyusun utama
hemiselulosa polisakarida pada dinding sel tanaman dikotil termasuk di dalamnya
sel kayu, yang dapat membentuk ikatan hidrogen dengan mikrofibril selulosa dan
secara potensial membentuk ikatan silang dengan mikrofibril (Campbell dun
Braam, 1998; Valls et al., 2006). Xyloglucan terdapat pada 20 % berat kering
dinding sel primer (York dan Eberhard, 2003).
Overekspresi xyloglucanase pada tanaman poplar (Populus tremula)
berhasil menunjukkan perubahan fenotip yang berarti, yaitu tanaman lebih tinggi,
dam lebih lebar, pertambahan diameter batang, indeks volume kayu, berat kering
dan persentase selulosa dan hemiselulosa lebih tinggi. Hal ini disebabkan oleh
adanya keterlibatan xyloglucanase pada proses pemutusan ikatan xyloglucan
yang terjadi saat elongasi (pemanjangan) sel, menyebabkan melemahnya dinding
sel dan mempercepat proses elongasi serta meningkatkan deposisi selulosa pada
xylem sekunder sehingga kualitas kayu yang dihasilkan semakin baik (Park et al.,
2004). Aktivitas pemutusan ikatan rantai xyloglukan juga memberi kontribusi
untuk merperkuat hubungan antara dinding sel primer dan dinding sel sekunder
pada jaringan yang akan membentuk kayu (Kallas et al., 2005).
Transformasi Genetik Tanaman
Teknik transformasi genetik merupakan salah satu metode penting dalam
biologi tanaman.
Teknik transformasi genetik dapat dipergunakan untuk
mempelajari regulasi gen, identifikasi fhgsi gen, pengujian metabolisme,
mempelajari fisiologi serta perkembangan tanaman (Knight, 1992; Walkerpeach
dan Velten, 1994).
Keberhasilan dalam melakukan rekayasa genetika
memerlukan beberapa faktor yaitu : tersedianya gen yang diinginkan, tersedianya
cara untuk mentransfer dan mengintegrasikan gen tersebut ke dalam sel tanaman
dan cara untuk meregenerasikan tanaman transgenik, dan kemampuan tanaman
untuk mengekspresikan gen yang telah diintroduksikan. Metode transformasi
genetik untuk mengintroduksikan gen
terpilih ke dalam sel tanaman dapat
dilakukan dengan beberapa cara antara lain menggunakan Agrobacterium
(Sudarsono, 1994).
Terdapat dua spesies Agrobacterium yang bersifat pathogen, yaitu
Agrobacterium tumefaciens sebagai penyebab penyakit tumor (crown gall) dan
Agrobacterium rhizogenes sebagai penyebab penyakit akar rambut (hairy root)
pada berbagai tanaman dikotil (Armitage et al., 1987).
Agrobacterium
tumefaciens merupakan bakteri aerob obligat gram negatif yang hidup alami di
tanah, secara genetik dapat mentransformasi sel inang dan secara agronomi
merupakan penyakit yang penting menyerang tanaman dikotil. Interaksi antara
Agrobacterium dan sel tanaman adalah contoh alami yang diketahui dapat
mentransfer DNA (Deoxiribosa Nucleic Acid) antar kingdom. Pada proses ini,
DNA dipindahkan dari Agrobacterium ke dalam inti sel tanaman. Ekspresi dari
DNA yang ditransfer (T-DNA) mengakibatkan pertumbuhan tumor pada tanaman
inang. Gen yang dibawa T-DNA membawa gen-gen yang terlibat dalam sintesis
hormon pertumbuhan tanaman dan produksi opin (Sheng dan Citovsky, 1996).
Kemampuan bakteri mentransformasi sel tanaman berhubungan dengan
adanya plasmid penginduksi tumor (Ti) atau penginduksi akar (Ri) dalam
Agrobacterium. Dua daerah dalam Ti dan Ri yang penting untuk transformasi
yaitu T-DNA dan daerah vir. T-DNA merupakan bagian dari DNA yang terletak
dalam plasmid Ti yang berukuran 200 kb. Sedangkan daerah vir yang berukuran
35 kb terdiri dari tujuh lokus utarna (vir A, vir B, vir C, vir D, vir E, vir G, dan vir
H). Gen-gen vir mensintesis protein virulens yang berperan untuk menginduksi
terjadinya transfer T-DNA dan integrasi T-DNA ke tanaman. Gen vir berekspresi
jika terdapat inducer yang antara lain berupa senyawa monosiklik fenolik seperti
acetosyringone dan monosakarida seperti glukosa dan galaktosa. Disamping itu,
kondisi pH juga mempengaruhi ekspresi gen vir. Nilai pH yang sesuai berkisar
5,O-5,s. Senyawa fenolik dan monosakarida terbentuk pada saat tanaman dikotil
mengalami
luka
dan
proses
ini
jarang
terjadi
pada
monokotil
(Sheng dun Citovsky, 1996).
Interakasi antara Agrobacterium dengan sel tanaman didahului dengan
penginderaan (sensing) Agrobacterium terhadap sel rentan yang luka. Mekanisme
penginderaan ini terjadi secara kimiawi dimana sel tanaman yang luka
menghasilkan suatu metabolit yang berperan sebagai isyarat bagi Agrobacterium.
Metabolit tersebut dapat berupa senyawa gula, asam amino, atau senyawa fenol.
Dengan adanya isyarat tersebut maka Agrobacterium akan bergerak aktif menuju
sel tanaman target. Gerakan yang bersifat kemotaksis dipandu oleh senyawa yang
disekresikan oleh sel tanaman rentan yang luka (Schaad, 1988).
Interaksi
dilanjutkan dengan terjadinya kontak antara Agrobacterium dengan sel tanaman
target.
Untuk memperkuat kontak ini Agrobacterium mengeluarkan suatu
metabolit, yaitu
P- 1,2-glukan. Beberapa gen dalam kromosom Agrobacterium
diketahui merupakan penyandi enzim yang berperan dalam sintesis berbagai
senyawa glukan, yaitu chvA, chvB dan exoC. Gen lain pada kromosom yang
peranannya seperti ketiga gen tersebut adalah cel, yang berperan dalam sintesis
senyawa selulosa fibril (Douglas et al., 1985).
Proses transfer T-DNA dari Agrobacterium ke genom tanaman memerlukan
adanya sekuen DNA yang berupa dua T-DNA border dan trans acting factor
virulensi. Satu atau beberapa molekul T-DNA dapat ditransfer dan terintegrasi
dalam genom tanaman, sehingga dalam kromosom tanaman akan terdapat satu
atau beberapa utas T-DNA yang terintegrasi pada satu situs yang sama atau
terpisah-pisah pada situs yang berbeda. Situs integrasi T-DNA di dalam DNA
tanaman tampaknya bersifat acak (Armitage et al., 1987).
Dengan menggunakan satu plasmid Ti dari Agrobacterium, maka beberapa
transgen dapat digabung dan ditempatkan di antara T-DNA dan selanjutnya
diintegrasikan ke dalam genom tanaman. Hal penting dalam proses transformasi
melalui Agrobacterium tumefaciens ini adalah transfer T-DNA ke inti tanaman
target, integrasi T-DNA tersebut ke dalam genom tanaman target yang diinduksi
oleh ekspresi gen-gen vir serta ekspresi gen-gen yang tertransformasi
(Cheng et al., 1998). Selain itu integrasi T-DNA yang membawa transgen ke
dalam genom resipien, akan mengalami sedikit pengaturan kembali secara intra
dan intermolekul, untuk memulihkan sistem iranskripsi dan translasi genom
tanaman resipien.
Transformasi melalui Agrobacterium lebih menjamin
kestabilan genom tanaman resipien (Sheng dan Citovsky, 1996).
Seleksi Tanaman Transgenik
Tanaman transgenik yang terseleksi dapat diamati dengan adanya
pembentukan tumor pada sel-sel tanaman yang mengalami transformasi atau dapat
juga diamati melalui adanya pertumbuhan dalam kultur yang bebas hormon.
Selain itu dapat juga digunakan penanda seleksi yang disisipkan pada T-DNA
pada sel-sel yang mengalami transformasi (Nakas dan Hagedors, 1990).
Salah satu contoh penanda seleksi adalah gen ketahanan terhadap
antibiotik yaitu gen resisten terhadap kanamisin yang telah berhasil digunakan
sebagai penanda seleksi yang dapat terekspresi pada fenotipe untuk transformasi
pada beberapa spesies tanaman. Resistensi terhadap kanamisin telah berhasil
digunakan sebagai penanda seleksi pada beberapa tanaman. Resistensi terhadap
kanamisin ini disebabkan adanya gen nptII yang diperoleh dari transposon Tn5.
Gen ini menyandi enzim neomisin fosfotransferase dan cara pewarisannya pada
tanaman transgenik mengikuti pewarisan hukum Mendel untuk gen-gen dominan
(Nakas dan Hagedors, 1990).
Regenerasi In vitro
Regenerasi tanaman rnerupakan suatu proses perkembangan yang sangat
kompleks. Regenerasi kultur in vitro terjadi melalui pembentukan organ langsung
dari eksplan, pembentukan embrioid langsung dari eksplan, pembentukan organ
melalui kalus serta pembentukan embrioid melalui kalus.
Upaya untuk
memperoleh regenerasi yang efisien sebagian besar dipusatkan pada pemilihan
bagian tanaman yang paling responsif serta penentuan jenis dan konsentrasi zat
pengatur tumbuh yang efektif. Perlakuan lain yang kadang-kadang perlu diuji
adalah cahaya, panjang penyinaran serta reaksi dalam sub kultur (Bhaskaran dan
Smith, 1990).
Kultur Jaringan
Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari
tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan, dan organ serta
menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat
memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali (Gunawan,
1992). Selain untuk perbanyakan tanaman, teknik ini juga dapat digunakan untuk
memperbaiki tanaman, menghasilkan tanaman bebas virus, produksi metabolit
sekunder dan preservasi tanaman (Hartmann et al., 1990).
Teori yang mendasari teknik ini adalah konsep totipotensi yaitu sel yang
hidup memiliki kemampuan untuk berproduksi, membentuk organ dan
berkembang menjadi individu sempurna jika ditempatkan pada media dan
lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan (Pierik, 1987). Keberhasilan
menggunakan metode kultur jaringan dalam mempengaruhi pertumbuhan dan
morfogenesis, sangat tergantung pada jenis dan fisiologi eksplan yang dikulturkan
(seperti organ yang digunakan, umur fisiologi, umur saat diambil, dari tanaman
asal, ulcuran dan kualitas tanaman asal), media yang digunakan, dan kondisi fisik
kultur. Faktor-faktor tersebut dapat berinteraksi satu dengan yang lainnya.
Eksplan
Pada dasarnya setiap bagian tanaman dapat digunakan sebagai eksplan.
Pernilihan material eksplan yang tepat akan mempengaruhi kesuksesan kultur
jaringan, baik dari segi organ, ukuran, umur, dan cara mengkulturkannya
(George dan Sherrington, 1984).
Surnber eksplan dapat mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenetiknya.
Eksplan yang berasal dari satu organ memiliki keragarnan kemampuan
regenerasinya.
eksplan.
Selain itu, morfogenetik juga dapat dipengaruhi oleh ukuran
Ukuran yang terlampau kecil, baik berupa pucuk tunas maupun
meristem, fiagmen atau keseluruhan bagian tanaman, atau bagian kalus h a n g
daya hidupnya bila dikulturkan, sementara jika terlalu besar akan mempersulit
untuk mendapatkan eksplan yang steril dan dalam proses manipulasinya
(George dan Sherrington, 1984).
Kepadatan eksplan yang ditanam dalam tiap botol juga mempengaruhi
diferensiasi sel.
Semakin banyak jumlah eksplan tiap botol, maka semakin
banyak jumlah sel yang tidak berdiferensiasi. Volume media kultur diduga ada
interaksinya dengan kepadatan eksplan dalam mempengaruhi pertumbuhan dan
perkembangan kultur.
Interaksi ini diduga berhubungan dengan menurunnya
senyawa inhibitor dalam media (George dun Sherrington, 1984).
Media
Media kultur jaringan pada prinsipnya harus bisa menyediakan unsur-unsur
hara yang diperlukan untuk pertumbuhan seperti tanamm dilapang. Keberhasilan
dalam penggunaan metode kultur jaringan sangat tergantung pada media yang
digunakan. Pemilihan komposisi media dan jenis media tergantung pada jenis
tanaman yang dikulturkan, faktor aerasi, dan bentuk pertumbuhan dari
deferensiasi yang diinginkan (Pierik, 1987).
Media kultur jaringan tanaman tidak hanya menyediakan unsur-unsur hara
makro (N,P, K, Ca, Mg, dan S) dan mikro (Fe, Mn,B, Cu,dan Mo), tetapi juga
karbohidrat yang pada umumnya berupa gula untuk menggantikan karbon yang
biasanya didapat dari atrnosfer melalui fotosintesis. Hasil yang lebih baik juga
akan diperoleh, bila ke dalam media tersebut ditambahkan vitarnin-vitamin, asam
amino, dan zat pengatur tumbuh. Pada keadaan tertentu media kultur jaringan
juga dilengkapi dengan arang aktif (Gunawan, 1992).
Interaksi dan keseirnbangan zat pengatur tumbuh yang diberikan ke dalam
media (eksogen) dengan yang dihasilkan oleh sel secara endogen, menentukan
arah pertumbuhan dan perkembangan suatu kultur.
Pemilihan jenis dan
konsentrasi zat pengatur tumbuh tergantung pada : (1) tipe pertumbuhan dan
perkembangan yang dikehendaki (kalus, akar, tunas, regenerasi dinding sel), (2)
taraf zat pengatur endogen, (3) kemampuan jaringan mensintesis zat pengatur
turnbuh, dan (4) interaksi antara zat pengatur tumbuh endogen dan eksogen
(Gunawan, 1992).
Dalam kultur jaringan terdapat dua zat pengatur tumbuh tanaman yang
penting yaitu auksin dan sitokinin.
Auksin berperan dalam merangsang
pembentukan kalus, pemanjangan sel, pembesaran
dan pembentukan akar.
Beberapa eksplan secara alamiah memproduksi cukup auksin. Pengaruh sitokinin
adalah merangsang pembelahan sel dan multiplikasi tunas (George dan
Sherrington, 1984). Keseirnbangan auksin dan sitokinin pada media tumbuh juga
akan menentukan arah perkembangan eksplan.
Tunas akan terbentuk bila
perbandingan konsentrasi auksin lebih tinggi dari sitokinin (Gunawan, 1992).
Kondisi fsik kultur
Kondisi fisik atau kepadatan media berpengaruh terhadap potensial air dan
tekanan osmotik, serta penyerapan hara tanaman. Kepadatan media ditentukan
oleh konsentrasi agar, pH media dan penambahan arang aktif. Konsentrasi agar
semakin tinggi dapat mengurangi difusi persenyawaan dari dan ke eksplan,
sehingga pengambilan hara dan zat pengatur tumbuh berkurang, sedangkan zat
penghambat dari eksplan tetap berkumpul di sekitar eksplan. Selain agar, ada
juga zat pemadat yang lain, yaitu gelrite yang dapat membentuk gel yang lebih
bening, pada konsentrasi 0,l-0,2% sudah dapat memadatkan media.
Derajat keasaman (pH) merupakan ha1 penting yang hams diperhatikan
dalam penyiapan media kultur jaringan tanaman. Karena pH dapat mempengaruhi
perturnbuhan dan perkembangan eksplan yaitu dapat mempengaruhi tersedianya
nutrisi dan hormon pada jaringan tanaman serta mempengaruhi fhgsi membran
sel dan pH sitoplasma.
Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan
fisiologi sel, juga hams memperhatikan : (1) kelarutan garam-garam penyusun
media, (2) pangaturan pengambilan zat-zat pengahu tumbuh dan gararn-garam
lainnya, dan (3) efisiensi pembekuan agar media (George & Sherrington, 1984).
Keasaman media pada umumnya berkisar antara 5,5-5,8 sebelum disterilisasi
(Gunawan, 1992).
Kondisi lingkungan kultur
Faktor lingkungan yang paling utarna mempengaruhi perturnbuhan dan
perkembangan kultur adalah cahaya dan suhu.
mempengaruhi
morfogenesis,
diferensiasi
dm
Cahaya diperlukan karena
embriogenesis
aseksual.
Kebutuhan cahaya dalam kultur meliputi kualitas cahaya, lama penyinaran, dan
intensitas cahaya (George dun Sherrington, 1984). Kualitas cahaya yang paling
baik untuk pertumbuhan kultur adalah putih. Banyak penelitian menunjukkan
bahwa penggunaan panjang penyinaran selama (14-16) jam memberikan hasil
yang baik. Intensitas cahaya dari lampu flourescent adalah antara (1000-4000)
lux dan ditempatkan dengan jumlah lampu dan kekuatan tertentu pada jarak
(40-50) cm dari tabung kultur, untuk luas area tertentu. Suhu di dalam ruang
kultur oleh banyak peneliti dilaporkan pada kisaran (25-28) OC memberikan
pengaruh yang baik untuk pertumbuhan tanaman in vitro. Suhu optimum untuk
pertumbuhan kultur jaringan tergantung dari jenis tanaman dan tempat turnbuh
alami dari tanaman tersebut (Gunawan, 1992).
Induksi Embrio somatik
Embriogenesis somatik yaitu suatu proses perkembangan nonseksual yang
menghasilkan suatu sel embrio bipolar yang berasal dari jaringan somatik. Tahaptahap perkembangannya serupa dengan embriogenesis normal dan menghasilkan
embrio tanpa hubungan vaskular dengan jaringan asalnya (Haccius, 1978).
Embriogenesis sornatik memiliki dua pola perkembangan yaitu embriogenesis
langsung (direct embriogenesis), yaitu embrio langsung terbentuk pada eksplan
tanpa melalui proses pengkalusan, dan embriogenesis tak langsung (indirect
embriogenesis), yaitu sebelum terbentuk embrio, eksplan membentuk kalus
terlebih dahulu. Embriogenesis langsung secara in vitro umurnnya terjadi pada
sel-sel eksplan yang masih muda Quvenil) sedangkan embriogenesis tak langsung
terjadi pada sel-sel yang telah mengalami diferensiasi, pembelahan sel,
transformasi menjadi sel embriogenik.
Embrio somatik dapat dicirikan dari strukturnya yang bipolar, yaitu
mempunyai dua calon meristem, yaitu meristem akar dan meristem tunas.
Dengan memiliki struktur tersebut maka perbanyakan melalui embrio somatik
lebih menguntungkan daripada pembentukan tunas adventif yang unipolar.
Disarnping stdturnya, tahap perkembangan embrio somatik menyerupai embrio
zigotik. Secara spesifik tahap perkembangan tersebut dimulai dari fase globular,
fase hati, fase torpedo, dan planlet (Henry et.al., 1998 dalam Gaj, 2001).
Lingkungan kimia dan lingkungan fisik mempunyai pengaruh yang sangat
besar terhadap embrio somatik. Faktor kimia terpenting yang terlibat dalam
proses munculnya embrio somatik adalah kandungan auksin pada media,
campuran nitrogen yang ditambahkan sebagai nutrisi.
Faktor fisik seperti
temperatur, intensitas cahaya, fotoperiode, udara, keadaan media dan kecepatan
pengocokan juga telah dilaporkan mempengaruhi embrio somatik. Temperatur
optimum adalah spesifik untuk setiap spesies clan tahap perkembangan. Perlakuan
panas atau dingin pada tahap tertentu dapat meningkatkan embriogenesis dan
perkecambahan dari embrio somatik dan propagul lain untuk perkembangan yang
lebih lengkap (Vajrabhaya, 1988).
Analisis Tanaman Transgenik
Analisis tanaman transgenik dalam proses transformasi genetik tanaman
dapat dilakukan pada berbagai tahapan, yaitu : introduksi gen, transkripsi,
translasi, dan pengujian efektifitas protein yang dihasilkan. Dewasa ini telah
dikenal berbagai teknik analisis tanaman transgenik seperti : Uji histokirnia
P-
glucuronidase (uji Gus), analisis Polymerase Chain Reaction (PCR), analisis
Sothern Blot, Northern, Western, ELISA dan lain-lain. Untuk gen ketahanan
terhadap serangga, pengujian efektifitas protein yang dihasilkan terhadap serangga
target dapat d i l w a n melalui uji hayati, uji pakan dan sebagainya.
Uji GUS
Uji histokimia P-glucuronidase (uji GUS) dapat dilakukan pada tahap awal
segera setelah ko-kultivasi maupun setelah gen terintegrasi dengan stabil di
kromosom. Warna biru yang muncul pada sel atau jaringan menunjukkan hasil
transformasi positif. Warna biru disebabkan oleh reaksi substrat X-gluc (5-bromo4-chrorno-3-irtdoZyZ-~-D-glucuronide)
dengan enzim P-glucuronidase menjadi
suatu senyawa perantara yang kemudian melalui reaksi dimerisasi oksidatif
membentuk senyawa dichloro-dibromoindigo (CIBr-Indigo) yang berwarna biru
(Stomp, 1992). Warna biru tersebut menunjukkan telah terekspresinya gen gus-A.
Pemakaian gen gus-A sebagai gen penanda pada proses transformasi genetik
sangat menguntungkan, karena produk gen ini dapat diarnati secara in vivo pada
irisan jaringan dengan menggunakan teknik histokirnia, sehingga gen gus-A sering
dipergunakan sebagai penanda dalam kondisi dimana pemakaian antibiotik tidak
memunglunkan bagi regenerasi tanaman (Lal dan Lal, 1993). Gen gus banyak
dipergunakan sebagai penanda pada sistem transformasi tanaman dan seringkali
digunakan untuk mempelajari fimgsi promoter (Jefferson, 1987).
Analisis Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR merupakan teknik analisis tingkat DNA, yang menggunakan
penggandaan urutan basa DNA spesifik secara in vitro, seperti pada cara replikasi
DNA, dengan bantuan enzirn polimerase dan pemanfaatan perubahan sifat fisik
DNA terhadap suhu (Davis et al., 1994). Keuntungan teknik PCR diantamnya
adalah analisisnya cepat, tidak diperlukan DNA dalam jumlah banyak, dapat
dilakukan pada fase awal pertumbuhan dan metode ekstraksi DNAnya relatif
sederhana. Dalam transformasi genetik, teknik PCR dapat dipergunakan untuk
mengamplifikasikan gen yang telah diintroduksi ke sel tanaman target untuk
membuktikan keberadaannya.
Dengan reaksi PCR, DNA dapat diperbanyak dengan menggunakan enzim
polymerase yang dihasilkan oleh bakteri termofilik melalui serangkaian
pengaturan suhu yang berbeda selama waktu tertentu pada satu siklus
perbanyakan. Dalam satu siklus perbanyakan, terjadi penggandaan urutan basa
cetakan. Masing-masing siklus terdiri dari tiga tahap yaitu tahap denaturasi DNA,
penempelan (annealing) dan sintesis DNA (Krawetz, 1989). Pada tahap pertama
DNA didenaturasi dengan meningkatkan suhu sehingga 95 O C selama 60-90 detik.
Tahap berikutnya suhu diturunkan hingga 55 "C atau antara 40-60 "C tergantung
panjang primer selama 30-60 detik untuk penempelan primer ke DNA target
secara spesifik. Pada tahap terakhir suhu dinaikkan kembali sekitar 72 OC untuk
sintesis DNA yang dimulai dari ujung 3' hidroksil pada masing-masing primer
(Krawetz, 1989; Cha dun Thilly, 1993). PCR merupakan metode yang sangat
sensitif sehingga dengan hanya satu molekul DNA dapat memperbanyak DNA
jutaan kali, sehingga sangat bermanfaat baik pada penelitian maupun penggunaan
komersial (Promega, 1996).
Southern Blot
Keuntungan analisis Southern blot selain dapat menunjukkan integrasi gen,
juga dapat mengetahui jumlah salinan DNA yang terintegrasi, serta galur
independent transgenik.
Analisis Southern blot dapat dipergunakan untuk
mengetahui jumlah salinan gen dan kejadian transformasi yang berbeda setelah
pemotongan DNA tanaman transgenik dengan enzim restriksi tertentu yang
memotong pada situs tunggal dalam DNA plasmid. Produk hibridisasi berasal
dari gen yang diintroduksikan dari hasil pemotongan DNA genomik sehingga
polimorfisme yang terbentuk menunjukkan sisi integrasi yang berbeda (Casas et
al., 1995).
Selain dipergunakan untuk membedakan kejadian transformasi,
analisis Southern blot dapat membedakan integrasi ekstra kromosomal dan
kromosomal (Davis et al., 1994). Kelemahan penerapan metode Southern blot
adalah memerlukan sejumlah DNA yang relatif banyak dengan kemurnian tinggi
dan waktu pelaksanaan relatif lama (Sambrook et al., 1989).
Northern Blot
Hibridisasi Northern merupakan suatu prosedur yang dipergunakan untuk
identifikasi dan analisis transkip RNA (Kafatos et al., 1979). RNA tidak dapat
berikatan secara efisien pada membran, sehingga dalam analisis northern
dipergunakan suatu membran spesifik dimana RNA dapat berikatan secara
kovalen. Ikatan RNA tersebut dapat dihibridisasi dengan menggunakan probe
RNA radioaktif atau DNA utas tunggal (Freifelder, 1995).
Dalam analisis Northern, sekuen RNA spesifik dideteksi menggunakan
teknik bloting yaitu RNA ditransfer dari agarose ke membran. Hasil bloting
dianalisis melalui proses hibridisasi dengan probe RNA. RNA merupakan bentuk
utas tunggal, sehingga dapat membentuk struktur sekunder melalui pasangan basa
intramolekul, sehingga hams dielektroforasi di bawah kondisi denaturasi.
Denaturasi dilakukan dengan penambahan formaldehid ke gel maupun loading
buHer, atau perlakuan glyoxal dan dimethyl sulfoxide (DMSO) pada loading
bufler. Berbagai bahan untuk denaturasi gel RNA telah dipergunakan termasuk
formaldehid, glyoxal dan methilmercuri klorida yang sangat toksik. Total RNA
dapat dipergunakan untuk proses hibridisasi northern, akan tetapi total RNA
biasanya memberikan hasil yang kurang memuaskan sebab terjadi hibridisasi
nonspesifik.
Meskipun sedikit, molekul rRNA akan menghasilkan signal
hibridisasi yang lebih kuat (Ausubel, 1995).
Western Blot
Western blot merupakan suatu metode yang dipergunakan untuk
mendeteksi DNA-binding protein. Dalarn metode ini protein dipisahkan dengan
elektroforesis dan ditransfer ke suatu membran sehingga protein akan berikatan
secara kovalen. Sebagai probe dipergunakan utas ganda DNA radioaktif dengan
cara penggabungan dari radioaktivitas dengan pita-pita protein yang menunjukkan
bahwa protein tertentu merupakan DNA binding protein (Dale 1995;
Freifelder, 1995).
Prinsip dasar Western blot adalah identifikasi pemisahan protein yang tidak
terlabel dengan SDS gel elektroforesis polyacrilamide (PAGE) yang didasarkan
pada immunoradioaktivitasnya dengan menggunakan antibodi monoklonal.
Kemudian protein ditransfer ke membran dan diberi
perlakuan awal untuk
mereduksi ikatan nonspesifik dari antiserum ke membran. Inkubasi membran
dilakukan dengan antiserum spesifik, kemudian diinkubasi dengan antibodi yang
berkonjugasi dengan reagen pendeteksi dan berikatan pada antiserum primer.
Setelah itu diikuti deteksi dari immunoreaksi diantara antiserum primer dan target
protein spesifik (Davis et al., 1994).
Park et. al. (2004) telah melakukan uji ekspresi pada tanaman poplar yang
telah ditransformasi dengan menggunakan teknik Western blot.
Analisis
Polymerase Chain Reaction (PCR) juga telah dilakukan sebelum Western blot.
Hasil uji ekspresi memberikan nilai positif dengan munculnya pita-pita. Western
blot adalah teknik yang paling tepat untuk uji ekspresi protein pada tanaman yang
telah ditransformasi.
Uji Hayati
Untuk pengujian resistensi tanarnan terhadap serangga tersedia berbagai
teknik uji hayati baik yang dilakukan pada skala rumah kaca, laboratorium
maupun lapang.
Tahap perkembangan serangga yang diinfestasikan sangat
bervariasi baik dalam bentuk telur, larva maupun nirnfa, dan bagian tanaman yang
diinfestasikan juga beragam baik berupa daun, batang, bagian tanaman lain
maupun tanaman utuh.
Di samping itu, dikenal berbagai teknik untuk
menentukan mekanisme resistensi seperti uji antisenosis, uji antibiosis, dan uji
toleransi (Panda dan Khush, 1995).