Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri Nitrat

TINJAUAN PUSTAKA
Muara sungai
Muara sungai termasuk ke dalam ekosistem estuari, dimana air tawar dan air
laut bercampur. Bahan-bahan organik dan anorganik yang terdapat di muara
sungai sebagian diendapkan, terlarut dan terbawa oleh arus ke laut. Salah satu
proses yang mempengaruhi konsentrasi bahan-bahan organik dan anorganik pada
muara sungai adalah proses biologi (Chester 1990).
Menurut Dahuri et al. (1996) kualitas air suatu perairan pesisir seperti
muara dicirikan oleh karakteristik kimianya yang mudah dipengaruhi oleh
masukan air yang berasal dari daratan (melalui sungai) dan lautan sekitarnya.
Proses pembuangan limbah dari daratan melalui aliran sungai atau dari lautan
yang berlangsung secara terus menerus akan mengakibatkan turunnya kualitas air
muara sungai. Pencemaran muara sungai oleh senyawa nitrogen lebih dominan
berasal dari daratan.
Pada muara sungai terjadi daur biogeokimia nitrogen, yaitu terjadinya
perubahan-perubahan senyawa atau unsur nitrogen dalam medium dan peristiwa
yang berbeda. Beberapa
proses transformasi senyawa nitrogen melibatkan
berbagai jenis bakteri yaitu bakteri yang berperan dalam amonifikasi, asimilasi,
fiksasi, nitrifikasi dan reduksi nitrat disimilatif.
Amonifikasi adalah proses pembentukan amonia dari materi organik
dilakukan oleh bakteri dan cendawan safrofit. Asimilasi adalah proses
pemanfaatan senyawa nitrogen anorganik untuk pembentukan asam amino dalam
protoplasma. Fiksasi nitrogen yaitu peristiwa pengikatan gas nitrogen (N2)
umumnya terjadi di daratan, simbiosis alga di perairan dan percampuran nitrogen
dari atmosfer. Nitrifikasi merupakan reaksi oksidasi pembentukan nitrat yang
berasal dari amonia. Reduksi nitrat disimilatif merupakan reaksi reduksi terhadap
nitrat dimana nitrat direduksi melalui tahap-tahap tertentu dengan hasil akhir
amonium atau gas nitrogen. Reduksi nitrat disimilatif yang dominan terjadi di
atas sedimen muara sungai adalah denitrifikasi (Dong et al. 2002). Denitrifikasi
yaitu reaksi reduksi yang mengubah nitrat menjadi nitrit, nitrit oksida, nitrous
oksida dan terakhir gas nitrogen. Reduksi nitrat disimilatif yang dominan pada
bagian sedimen muara sungai adalah nitrat amonifikasi disimilatif (Rusmana
2003a).
Madigan et al. (2006) menyatakan proses penghilangan senyawa nitrogen
di tanah dan perairan melalui proses denitrifikasi dan anaerob ammonia oxidation
(anammox). Kedua proses tersebut menghasilkan gas nitrogen dan nitrous oksida
(denitrifikasi) sebagai produk akhir. Proses ini jika terjadi di areal pertanian dapat
menurunkan produktivitas hasil pertanian.
Senyawa-senyawa nitrogen yang terdapat di muara sungai secara umum
terlibat dalam daur biogeokimia seperti yang dijelaskan oleh Kennish (1994)
seperti terlihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Daur biogeokimia nitrogen di perairan
Muara Sungai Cimandiri dan Cisadane
Muara Sungai Cimandiri kabupaten Sukabumi Jawa Barat, merupakan
muara sungai yang telah tercemar. Berbagai sampah rumah tangga / pemukiman,
limbah areal pertanian (sawah, perkebunan) dan bahan-bahan lain sepanjang
Daerah Aliran Sungai (DAS) Sungai Cimandiri terakumulasi di muara. Kualitas
air pada muara sungai Cimandiri sudah mengalami penurunan (Marnis 2008).
Selain limbah yang masuk ke perairan sungai, aktivitas penambangan pasir
sepanjang DAS menyebabkan warna perairan di sekitar muara menjadi coklat
sampai jarak yang cukup jauh dari pantai (Marnis 2008). Pada kondisi kimia dan
fisik perairan seperti itu
akan memicu
pertumbuhan mikroorganisma-
mikroorganisma aerob fakultatif dan anaerob disamping bakteri aerob, termasuk
mikroorganisme yang memanfaatkan senyawa nitrogen baik organik (protein,
asam amino) atau senyawa anorganik (nitrat, nitrit, dan amonium).
Muara
Sungai
Cisadane
merupakan
muara
sungai
yang
tingkat
pencemarannya lebih tinggi dari muara Sungai Cimandiri. Sungai Cisadane selain
sebagai sumber air yang dimanfaatkan penduduk untuk keperluan sehari-hari,
juga merupakan sumber perairan pertanian. Disamping itu berfungsi sebagai
tempat penampungan limbah yang berasal dari limbah rumah tangga, industri,
pertanian dan perternakan (Brahmana & Suriati 2001).
Beberapa parameter kualitas air yang menunjukkan muara Sungai Cisadane
tercemar adalah rendahnya kandungan oksigen terlarut, tingginya konsentrasi
nitrit dan amonia serta suhu perairan yang tinggi. Kandungan oksigen terlarut
berkisar antara 0,39-2,33 mg/l, dan suhu 32,0-32,60C. Kandungan senyawa nitrit
0,03-0,14 mg/l dan amonia 0,09-1,19 mg/l (Syahputra 2007). Tingkat pencemaran
muara Sungai Cisadane pada musim hujan akan lebih rendah karena faktor
pengenceran oleh air hujan, termasuk air hujan dari hulu melalui aliran sungai.
Muara sungai yang banyak mengandung limbah organik dan anorganik yang
mengandung senyawa nitrogen diduga menghasilkan emisi Nitrous Oksida (N2O)
yang lebih besar. Emisi N2O dari perairan dan muara kurang lebih 66%, produksi
gas ini berkorelasi positif dengan konsentrasi nitrat atau nitrit perairan (Seitzinger
& Kroezen 1998; Rusmana 2003c).
Pada kedua muara sungai diatas senyawa nitrogen umumnya berasal dari
limbah organik rumah tangga sepanjang daerah aliran sungai yang mengalami
dekomposisi, limbah pupuk nitrogen anorganik areal pertanian dan senyawa
nitrogen anorganik tanah yang mengalami erosi tepi sungai. Sumber senyawa
nitrogen lain berasal dari proses nitrifikasi, proses dekomposisi mikroorganisma
dan eksresi organisma di habitat muara sungai serta gas oksida nitrogen dari udara
yang terlarut melalui air hujan. Limbah industri merupakan faktor utama
pencemaran yang meningkatkan senyawa nitrogen pada muara Sungai Cisadane
disamping faktor-faktor di atas.
Bakteri Pereduksi Nitrat
Kelompok bakteri pereduksi nitrat merupakan mikroorganisma yang terlibat
dalam daur nitrogen di alam. Kelompok bakteri ini berperanan dalam pengubahan
senyawa nitrat menjadi produk akhir gas nitrogen atau senyawa amonium.
Rusmana (2003b) menyatakan bahwa terdapat tiga proses reduksi nitrat
disimilatif pada bakteri yaitu denitrifikasi, reduksi nitrat menjadi amonium
disimilatif dan oksidasi amonium disimilatif (anaerob ammonia oxidation,
anammox). Denitrifikasi adalah proses reduksi nitrat menjadi N2O atau N2. Pada
proses ini bakteri menggunakan nitrat sebagai penerima elektron terakhir untuk
memperoleh energi pada kondisi O2 terbatas atau anaerob (Zumft 1997; Ricardson
2000; Ricardson et al. 2001). Reduksi nitrat menjadi amonium disimilatif adalah
proses untuk menghilangkan kelebihan tenaga pereduksi dan menunjang
pertumbuhan bakteri pada kondisi anaerob (Cole 1996). Anamoks adalah oksidasi
amonia secara anaerobik dimana terjadi pengubahan amonium dan nitrat atau
nitrit menjadi gas nitrogen. Pada metabolisma ini membentuk senyawa antara
hidroksil amin dan hidrazin (Jetten et al. 2001).
Tiga lintasan proses reduksi nitrat oleh aktivitas bakteri dapat digambarkan
sebagai berikut (Rusmana 2003b).
NO
N 2O
N2
NO
N 2O
N2
(1)
(1)
N2O
(3)
N2O
NO3
-
NO3-
-
NH4
NO2-
NH4
NO2
NH2OH
NH2OH
NH3
(2)
(2)
N2H2
N2
(3)
N2H2
N2
(3)
NH3
Gambar 2 Lintasan reduksi nitrat oleh aktivitas bakteri (1) Denitrifikasi,
(2).Reduksi nitrat amonifikasi disimilatif (3) Oksidasi amonia secara
anaerob.
Enzim-Enzim yang Berperan pada Reduksi Nitrat
Kelompok bakteri pereduksi nitrat baik denitrifikasi, bakteri DNRA maupun
anamoks
memiliki enzim-enzim tertentu untuk mengkatalisasi reaksi-reaksi
reduksi nitrat. Enzim pada bakteri denitrifikasi adalah nitrat reduktase (Nar dan
Nap), Nitrit reduktase (Nir), Nitrit oksid reduktase (Nor), Nitrous oksid reduktase
(Nos) (Moreno - Vivian et al. 1999; Zumft 1997; Ricardson et al. 2001).
Bakteri DNRA memiliki enzim nitrat reduktase (Nap dan Nar) yang
mereduksi nitrat menjadi nitrit dan dua enzim yang mereduksi nitrat menjadi
amonium yaitu Nir B (Harbone et al. 1992) dan enzim formate dependent nitrite
reduction to amonium atau Nrf (Cole 1996).
Pada spesies tertentu
seperti
Wollinella succinogens dan Campylobacter fetus memiliki enzim nitrous oksida
reduktase (Nos). Enzim ini mereduksi gas N2O menjadi gas Nitrogen (Zumft
1997).
Enzim yang terdapat pada bakteri anamoks adalah nitrit reducing enzyme
(NR) yaitu enzim yang mereduksi nitrit menjadi hidroksil amin (NH2OH).
Hidrazin Hidrolase (HH) enzim yang mereduksi hidroksilamin menjadi hidrazin
(N2H4) dan Hydrazine – oxidising enzyme (HZO), enzim yang mengoksidasi
hidrazin menjadi gas nitrogen (Jetten et al. 2001).
Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif (DNRA)
Pada kondisi yang sesuai beberapa genus dapat mereduksi nitrit menjadi
amonia melalui proses reduksi nitrat disimilasif. Prosesnya berlangsung pada saat
kandungan senyawa nitrit tinggi (Kelso et al. 1997). Kelompok bakteri ini bersifat
fermentatif (Rusmana & Nedwell 2004), dapat memanfaatkan senyawa organik
untuk pembentukan energi melalui transfer elektron di sitoplasma (Purwoko
2007).
Purwoko (2007) mengemukakan bahwa sebagian besar prokariota
fermentatif menghasilkan semua ATP melalui fosforilasi tingkat subtrat,
kemudian ATP dihidrolisis oleh ATP sintetase, sehingga dapat menghasilkan
perbedaan potensial yang digunakan untuk aktivitas membran. Organisma
fermentatif memerlukan akseptor elektron untuk menerima elektron dari NADH.
Kelompok bakteri pereduksi nitrat dapat memanfaatkan senyawa nitrat sebagai
penerima elektron alternatif untuk mendapatkan energi dibawah kondisi oksigen
terbatas (Ricardson et al. 2001).
Kelompok bakteri DNRA mereduksi senyawa nitrat sejalan dengan
penambahan senyawa nitrit, ketika konsentrasi nitrat rendah terjadi penambahan
senyawa amonium (Kelso et al. 1997). Pada beberapa pengamatan di lapangan
menunjukkan bahwa proses nitrat amonifikasi disimilatif banyak terjadi pada suhu
tinggi (Herbert & Nedwell 1990). Bakteri DNRA lebih dominan pada lingkungan
yang rasio C/N nya tinggi (Nedwell 1982). Bakteri DNRA lebih kompetitif dari
pada bakteri denitrifikasi pada konsentrasi bahan organik tinggi.
Bakteri-bakteri nitrat amonifikasi disimilatif diantaranya adalah Bacillus
pyocyanes, Clostridium pasteurianum, Desulfovibrio desulfuricans (Moat et al.
2002).
Bacillus licheniformis, Wollinella succinogenes, Citrobacter freundii,
Klebsiella oxytoca, K. Pneumonia, Escherichia coli (Rusmana 2003a).
Rusmana (2003a) telah mengisolasi dan mengkarakterisasi Klebsiella
pneumonia yang mereduksi nitrat menjadi amonium dan menghasilkan N2O
sebagai produk sampingnya. Syahputra (2007) telah mengisolasi dan menyeleksi
bakteri nitrat amonifikasi disimilatif dari muara sungai Cisadane. Isolat terpilih
dikarakterisasi mempunyai kemiripan dengan Escherichia sp 21 CR dengan
tingkat kemiripan 97%. Sebagian besar famili Enterobacteriaceae mereduksi
nitrat dan bersifat fermentatif (Holt et al. 1994).
Proses pembentukan N2O pada
kelompok bakteri nitrat amonifikasi
disimilatif bukan sebagai senyawa antara seperti pada kelompok bakteri
denitrifikasi, tetapi merupakan produk samping
melalui reaksi kimia
dalam
menghasilkan amonium (Rusmana 2003a). Bagan proses reaksi kimia reduksi
nitrat ke amonium dapat ditunjukkan pada Gambar 3.
N 2O
NO3-
NO2-
NO
N2O2H2
NOH
NH4+
NH2OH
Gambar 3 Bagan pembentukan N2O pada reduksi nitrat oleh bakteri DNRA
(Darjamurni 2003)
Pada kelompok bakteri DNRA terjadi dua tahap reaksi enzimatik yaitu tahap
pertama oleh enzim Nap dan Nar seperti pada bakteri dinitrifikasi. Patereu et al.
(1994) menyatakan bahwa ada dua tipe enzim yang mereduksi nitrat menjadi nitrit
yaitu nitrat reduktase yang terdapat pada membran (Nar) dan nitrat reduktase yang
terdapat pada periplasmik (Nap). Enzim Nar aktivitasnya berhubungan langsung
dengan proses respirasi pembentukan ATP yang dapat dipengaruhi oleh
konsentrasi oksigen dimana oksigen menghambat sistem transpor nitrat. Enzim
Nap yang mereduksi nitrat dalam periplasma tidak sensitif terhadap oksigen.
Enzim Nar yang terdapat di membran plasma mempunyai transmembran proton
motive force (PMF) tempat terjadinya sintesis ATP (Moreno- Vivian et.al 1999).
Demikian pula menurut Carter et al. (1995) reduksi nitrat dalam periplasma
tidak sensitif terhadap hambatan oksigen. Oleh karena itu, nitrat reduktase
periplasmik berhubungan dengan kemampuan untuk respirasi nitrat dalam
ketersediaan oksigen pada spesies laboratorium. Oksidasi quinol oleh nitrat
reduktase periplasmik tidak terpusat untuk menghasilkan gradien proton
elektrokimia,
tetapi
cukup
bertindak
keseimbangan regulasi reaksi redoks
respirasi aerobik.
sebagai
katup
untuk
membantu
dan mempertahankan jalannya rantai
Enzim Nap merupakan komplek dari dua sub unit protein. Sub unit Nap A
mengikat kofaktor Molibdenum (Mo) sebagai sisi aktif dari enzim. Sub unit Nap
B mempunyai dua situs ikatan heme C yang memiliki perbedaan potensial. Nap C
merupakan sitokrom tipe tetraheme C, berperan dalam transfer elektron antara
Quinol dan Nap AB (Richardson 2000).
Reaksi enzimatik tahap kedua yaitu perubahan nitrit menjadi amonium oleh
enzim Nir B yang aktivitasnya bergantung pada NADH sitoplasma sebagai donor
elektron (Harbone et al. 1992) dan enzim Nrf yang aktivitasnya bergantung pada
format sebagai donor elektron (Cole 1996). Dalam Richardson (2000) kinerja
enzim pereduksi nitrat menjadi amonium disimilatif digambarkan sebagai berikut
(Gambar 4).
NO2-
NH4+
NrfA
NapA
NapB
Periplasma
NO3-
NO2-
NO3NO2-
NrfB
NrfB
NrfC
NrfC
NapC
Membran plasma
NarI
NrfD
NarH
NO3-
NO2NarG
NirD
Sitoplasma
NirB
NO3-
NO2-
NO -
NH +
2
4
Gambar 4 Enzim pereduksi nitrat bakteri nitrat amonifikasi
disimilatif
Ketersediaan oksigen di lingkungan pada bakteri nitrat amonifikasi
disimilatif diantaranya berkaitan erat dengan sistem sensor regulator sebagai
mikroorganisme
anaerob
fakultatif. Kelompok bakteri DNRA memiliki
kemampuan adaptasi dari aerob ke anaerob atau sebaliknya. Oksigen merepresi
sintesis reduktase anaerob, sebaliknya pada kondisi oksigen terbatas akan
merepresi sintesis
ketoglutarat dehidrogenase. Hal ini mengakibatkan perubahan
kondisi jalur asam sitrat dari siklus TCA oksidatif menjadi non siklus/ reduktif
(White 1995).
Pada White (1995) dijelaskan bahwa pergantian
reduktif Escherichia coli
respirasi oksidatif dan
sebagai salah satu bakteri DNRA diatur oleh tiga
sistem, yaitu sistem Arc (Aerobic respiration control), sistem Nar (Nitrat
anaerobic respiration) dan sistem Fnr. Sistem Arc merupakan sistem dua
komponen. Sistem ini merepresi gen-gen aerob berupa enzim-enzim siklus asam
sitrat, piruvat dehidrogenase, asam lemak oksidase, dan sitokrom oksidase. Selain
itu sistem Arc menginduksi gen-gen mikroaerob (sitokrom d oksidase dan sintesis
kobal alamin).
Sistem Nar terdiri dari 3 protein yaitu Nar X, Nar L dan Nar Q. Sistem ini
juga merupakan sistem dua komponen, Nar X berperan sebagai histidin kinase,
sedangkan Nar L sebagai protein regulator respons.
Sistem ini menginduksi
sintesis transkripsi gen nitrat reduktase dan menghambat gen fumarat reduktase
serta gen aerobik lainnya. Penelitian selanjutnya diketahui bahwa Nar Q juga
berperan sebagai penerima sensor (White 1995 ; Purwoko 2007).
Sistem Fnr merupakan sistem tunggal yang berperanan pada kondisi
anaerob. Protein Fnr berperan sebagai regulator positif untuk transkripsi gen-gen
dalam pertumbuhan anaerob dan regulator negatif untuk transkripsi gen-gen
pertumbuhan aerob (White 1995 ; Purwoko 2007).
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2008 sampai Maret 2009.
Tempat penelitian di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Bahan Penelitian
Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri nitrat amonifikasi
disimilatif (DNRA)
koleksi Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi,
FMIPA IPB Bogor. Isolat merupakan bakteri terpilih dari penelitian sebelumnya
hasil isolasi dari muara Sungai Cimandiri Pelabuhan Ratu Sukabumi Jawa Barat
dan muara Sungai Cisadane Tangerang Banten. Kode isolat dari muara Sungai
Cimandiri adalah FR1 dan FR2 (Marnis 2008). Kode isolat dari muara Sungai
Cisadane HF7 dan LF6 (Syahputra 2007).
Konfirmasi dan Peremajaan Isolat.
Peremajaan isolat murni dimulai dengan konfirmasi kemurnian isolat
menggunakan media padat, dilanjutkan dengan peremajaan isolat murni pada
media cair.
Komposisi media cair adalah: 10 g Natrium asetat, 4,2 g NaNO3,
3,0 g yeast ekstrak, 0,5 g (NH4)2SO4, 0,9 g K2HPO4.3 H2O, 0,5 g MgSO4.7H2O,
0,2 g KH2PO4, 0,1 g CaCl2.2H2O dengan salinitas 2% dan pH 7 (Rodina 1972).
Media padat dibuat sama dengan media cair ditambah agar bacto 20 g per liter.
Media disterilisasi pada suhu 1210 C tekanan udara 1 atmosfer selama 15 menit.
Konfirmasi kemurnian isolat dilakukan dengan cara diinokulasikan masingmasing isolat murni bakteri nitrat amonifikasi disimilatif dengan metoda cawan
gores pada medium agar, kemudian diinkubasikan selama 7 hari. Karakterisasi
dan morfologi sel tiap isolat dilakukan dengan teknik pewarnaan gram
(Hadioetomo 1993).
Konfirmasi kemurnian isolat secara fisiologi dilakukan dengan uji
fermentatif. Keempat isolat ditumbuhkan pada medium glukosa dengan indikator
brom cressol purple. Isolat diletakkan pada tabung bertutup untuk membatasi
masukan oksigen. Uji ini dilakukan untuk melihat kemampuan fermentasi dari
tiap isolat. Perubahan warna ungu menjadi kuning menunjukkan isolat tersebut
melakukan fermentasi, jika tidak terjadi perubahan warna bukan
kelompok
bakteri fermentatif. Peremajaan bakteri pada medium cair dilakukan dengan cara
diinokulasikan 1 lup tiap isolat pada medium cair masing-masing sebanyak 20
ml kedalam botol yang berukuran 100 ml. Inkubasi dilakukan selama 24 jam
Tahap selanjutnya masing-masing isolat diambil 1 ml dimasukkan ke medium 50
ml untuk perbanyakan inokulan dan diinkubasikan selama 24 jam.
Seleksi Aktivitas Reduksi Nitrat pada Konsentrasi
Oksigen (O2) yang Berbeda
Pengukuran aktivitas reduksi nitrat pada konsentrasi oksigen berbeda
dilakukan pada
botol serum steril 75 ml yang ditutup dengan butyl rubber
septum. Pengkondisian konsentrasi oksigen dengan pengaturan volume saturasi
udara pada head space botol serum.
Botol serum steril volume 75 ml diisi dengan 23 ml medium cair. Botol
dibuat kondisi an aerobik dengan cara menghilangkan oksigen yang terdapat di
dalam botol. Gas nitrogen bebas oksigen dialirkan ke dalam botol reaksi dengan
menggunakan jarum/syringe steril selama 15 menit. Sebelum gas dimasukkan,
gas terlebih dahulu disaring dengan filter steril diameter 47 mm dengan ukuran
0,45 mikro meter.
Langkah berikutnya, saturasi udara pada masing-masing botol dikondisikan
menjadi 0%, 1%, 10%, 30%, 50%, 80%, dan 100%. Saturasi udara dimasukkan
pada masing-masing botol serum yang telah diberi perlakuan pembebasan oksigen
sebanyak 0,5 ml, 5 ml, 15 ml, 25 ml, dan 40 ml. Pada waktu proses pemasukan
saturasi udara, gas nitrogen akan terdorong keluar melalui jarum yang dipasang
pada tutup botol disamping syringe, sehingga volume saturasi udara pada masingmasing botol menjadi 1%, 10%, 30%, 50%, 80%. Pengkondisian saturasi udara
100% dilakukan dengan tanpa memasukkan gas nitrogen murni pada botol serum.
Kondisi saturasi udara 0% dengan pengisian gas nitrogen murni tanpa
memasukkan saturasi udara.
Seluruh botol serum yang telah dikondisikan saturasi udaranya dikocok
untuk melarutkan gas perlakuan. Masing-masing botol serum diinokulasi dengan
1 ml isolat. Isolat diletakan pada inkubator berpenggoyang pada kecepatan 80 rpm
suhu ruang (28-31)oC selama 96 jam (Su et al. 2001).
Setelah diinkubasi pada kadar oksigen yang berbeda, dilakukan pengukuran
densitas sel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Kultur
biakan bakteri diambil sebanyak 1ml pada tabung efendorf dan disentrifugasi
dengan kecepatan 4000 rpm selama 15 menit untuk mendapatkan supernatan.
Supernatan dari kultur biakan dianalisis kandungan nitrit, nitrat dan amonium.
Analisis nitrit.
Analisis Nitrit menggunakan metode Sulfanilamide (Cleseri et al 1989).
Nitrit dengan amina aromatik pada sulfalinamide akan membentuk diazonium.
Senyawa tersebut dengan NED (N-I-Naphtyl Ethylene Diamine Dyhidrochloride)
membentuk gugus kromofor yang berwarna merah muda (Lampiran 1) dan dapat
diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kadar nitrit
ditentukan dengan cara memasukkan 5 ml sampel yang telah diencerkan kedalam
tabung reaksi, ditambahkan 0,1 sulfanilamid (C6H8N2O2S) dan 0,1 NED.
Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 540 nm. Kurva standar natrium nitrit (NaNO2) dengan konsentrasi
sebesar : 0 ;
0,2; 0,4; 0,6; 0,8 , dan 1,0 mg/l kemudian dikonversi ke mM
digunakan untuk menentukan kadar nitrit pada sampel (Lampiran 2).
Analisis nitrat
Analisis senyawa nitrat dengan menggunakan metode Greenberg et al
(1992). Kadar nitrat ditentukan dengan cara memasukkan 20 ml sampel yang
telah diencerkan ke dalam kolom reduksi yang berisi cadmium. Pada saat sampel
melewati kolom reduksi, cadmium akan mereduksi nitrat menjadi nitrit. Sampel
sebanyak 5 ml direaksikan dengan reagen pada analisis nitrit.
Sampel akan
menunjukkan perubahan warna merah muda (Lampiran 1), diukur pada panjang
gelombang 540 nm. Kurva standar natrium nitrit (NaNO2) dengan konsentrasi
sebesar : 0 ;
0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 mg/l, kemudian dikonversi ke mM
digunakan untuk menentukan kadar nitrit pada sampel. Nilai konsentrasi nitrat
adalah hasil pengurangan antara konsentrasi nitrit yang dilewatkan pada kolom
reduksi dengan konsentrasi nitrit yang tidak dilewatkan.
Analisis amonium
Pengukuran konsentrasi amonium menggunakan metode phenate (Cleseri et
al. 1989). Kadar amonium ditentukan dengan cara 5 ml sampel yang diencerkan ,
dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 0,2 ml larutan fenol alkohol
(C6H5OH) lalu dihomogenkan, diamkan selama 1 menit lalu tambahkan 0,2 ml
Na-Dihidro Nitroprusid (Na2[Fe(CN)NO]2.H2O), kemudian ditambahkan 0,5 ml
larutan oksidan yang terdiri dari Natrium Sitrat (C6H5Na3O7.2H2O) dan Natrium
hipoklorit (NaOCl2) dan dibiarkan selama satu jam pada suhu ruang (28-31)o C.
Sampel yang telah diberi larutan indikator menunjukkan perubahan warna hijau
sampai biru (Lampiran 1), diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 640 nm. Kurva standar amonium klorida (NH4Cl) sebesar: 0 ; 0,2;
0,4; 0,6; 0,8 ; 1,0; 2,0; 4,0; dan 8,0 mg/l kemudian dikonversi ke mM digunakan
untuk menghitung konsentrasi amonia pada sampel (Lampiran 2).
Perhitungan Pembentukan Gas.
nitrit (NO2 -), dan amonium (NH4+)
nitrat (NO3-),
Setelah konsentrasi
diketahui dari masing-masing sampel, dihitung jumlah nitrat yang tereduksi
dengan rumus :
= [NO3-] kontrol – [NO3-]inokulasi
[NO3-] tereduksi
%
[NO3-]
=
tereduksi
[NO3-] red
x
100
-
[NO3 ] kontrol
Jumlah senyawa nitrit yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut:
[NO2-] terbentuk
%[NO2
[NO2-] perlakuan – [NO2-] kontrol
=
] terbentuk = [NO2-] perlakuan – [NO2-] kontrol
-
x 100
-
[NO3 ]tereduksi
Jumlah senyawa amonium yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut:
=
[NH4+] perlakuan – [NH4+] kontrol
% [NH4+] terbentuk =
[NH4+] perlakuan – [NH4+] kontrol
[NH4+] terbentuk
x
100
[NO3-]tereduksi
Estimasi produk akhir gas yang terbentuk dihitung dengan rumus
[Gas ]
=
[NO3-]reduksi – [NO2-] terbentuk – [NH4 +] terbentuk
%[
=
[Gas] X 100%
Gas]
[NO3-] tereduksi
Keterangan : Konsentrasi nitrat kontrol didapatkan dari sediaan medium steril
tanpa bakteri .
Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Isolat Terpilih
Dua isolat terbaik dalam mereduksi nitrat dan responsif terhadap oksigen
dipilih untuk diamati kinetikanya. Botol serum steril volume 125 ml diisi dengan
50 ml medium cair. Sebanyak 1 ml isolat diinokulasikan pada tiap botol yang
telah dikondisikan saturasi udaranya secara berurutan masing-masing 1 %, 10%,
100%. Kultur biakan diinkubasikan pada suhu ruang (28-31)oC selama 96 jam
(Su et al 2001).
Kultur biakan diamati pola pertumbuhannya dan dianalisis
konsentrasi nitrat, nitrat, dan amonium dengan metoda yang telah diuraikan
sebelumnya. Analisis dilakukan setiap selang waktu 12 jam selama 96 jam (4
hari).
Hasil pertumbuhan digambarkan pada suatu grafik pertumbuhan pada
kondisi oksigen berbeda. Korelasi antara konsentrasi sel dengan kerapatan optis
(OD) isolat, dilakukan metoda hitungan cawan (Lampiran 3) pada konsentrasi
pengenceran 10 -6, 10-7, 10 -8, dan 10-9. Kultur biakan yang sama diencerkan dan
OD dari beberapa pengenceran diukur. Kurva standar pertumbuhan dibuat dari
nilai-nilai OD pengenceran dan konsentrasi sel sehingga didapatkan nilai regresi
dan persamaan garis (Lampiran 4) untuk menentukan jumlah sel. Laju
pertumbuhan spesifik maksimum didapatkan dengan mencari nilai regresi dan
persamaan garis dari korelasi waktu inkubasi dengan nilai ln jumlah sel. Laju
pertumbuhan maksimum merupakan koefisien variabel x pada persamaan garis
Y= ax + c (Maier et al. 2000).
Hasil uji kimia digambarkan dalam suatu grafik yang menunjukkan
hubungan lama inkubasi dengan nitrat tereduksi, nitrit, dan amonium serta
estimasi gas N2O yang terbentuk pada setiap konsentrasi oksigen yang berbeda.
Kecepatan reduksi setiap sel masing-masing isolat dihitung pada kondisi saturasi
udara 1 %, 10% dan 100%.