1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Kanker

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kanker masih menjadi masalah kesehatan terbesar di dunia. Kanker
dapat dikategorikan sebagai penyakit yang bersifat ”silent killer” (pembunuh
diam-diam) karena umumnya penderita kanker mengetahui bahwa dirinya
mengidap kanker ketika sudah pada stadium lanjut (metastasis). Data ini juga
didukung oleh WHO (2015) yang menyatakan bahwa metastasis merupakan
penyebab utama kematian akibat kanker. Penyakit kanker tertinggi pada
perempuan adalah kanker payudara dan kanker leher rahim. Kanker payudara
menjadi kanker yang paling sering terjadi pada wanita dengan kisaran angka
kejadian sebesar 1,38 juta kasus baru per tahun (Eccles et al., 2013). Pada
tahun 2016, diperkirakan terdapat 1,68 juta kasus kanker baru dan 30%
diantaranya akan meninggal dunia ( National Cancer Institute, 2016). Data
hasil riset kesehatan dasar menyebutkan bahwa prevalensi kanker adalah 1,4
per 1000 orang (Anonim, 2016).
Beberapa usaha penyembuhan kanker yang dilakukan selama ini antara
lain pembedahan, kemoterapi, penyinaran, imunoterapi, dan pengobatan
hormon. Adapun agen-agen kemoterapi dan kemoprevensi yang sudah banyak
digunakan memiliki beberapa keterbatasan, seperti adanya peristiwa resistensi,
efek samping, dan daya efikasi yang kurang memadai pada kanker stadium
lanjut. Akibatnya terjadi inefisiensi terapi, sehingga perlu dikembangkan model
1
2
terapi
yang lebih efektif. Salah satu pengembangan terapi kanker
diarahkan pada terapi kombinasi (Greenwald, 2002). Bahan alam banyak
dieksplorasi untuk digunakan sebagai agen kemoprevensi. Beberapa tumbuhan
asli Indonesia telah diketahui memiliki aktivitas kemopreventif dengan target
yang spesifik.
Bahan
alam
Indonesia
yang
dilaporkan
memiliki
aktivitas
sebagai antikanker adalah daun jure (Nerium indicum Mill.) yang mengandung
senyawa oleandrin dan senyawa turunan kardenolid lainnya serta kayu manis
(Cinnamomum burmannii) yang mengandung senyawa sinamaldehid (Wang et
al., 2009). Kombinasi keduanya untuk pengembangan terapi kanker payudara
yang berbasis targeted therapy khususnya pada kasus metastasis perlu
ditelusuri. Oleh karena itu, melalui penelitian ini diharapkan mampu menjadi
sumber data ilmiah terapi kanker payudara yang telah mengalami metastasis
menggunakan kombinasi ekstrak daun jure (EDJ) dan destilat kayu manis
(DKM). Pengujian sitotoksisitas tunggal dan kombinasi EDJ dan DKM
dilakukan menggunakan MTT assay. Proses penghambatan migrasi sebagai
salah satu tahap metastasis diamati dengan scratch wound healing assay. Hasil
dari penelitian ini diharapkan dapat menjadi acuan pengembangan terapi
kanker payudara yang telah mengalami metastasis.
3
B. Rumusan Masalah
1. Apakah EDJ dan DKM bersifat sitotoksik pada sel kanker payudara 4T1?
2. Apakah kombinasi EDJ dan DKM memberikan efek sinergis berdasarkan
nilai indeks kombinasi yang diperoleh?
3. Apakah perlakuan kombinasi EDJ dan DKM memiliki potensi menghambat
migrasi sel kanker payudara 4T1?
C. Tujuan Penelitian
1. Tujuan Umum
Mengeksplorasi
potensi
kombinasi
EDJ dan DKM
sebagai agen
kemoprevensi dan kokemoterapi berbasis bahan alam yang dapat digunakan
dalam terapi kanker payudara yang telah mengalami metastasis.
2. Tujuan Khusus
a. Mengkaji aktivitas sitotoksik EDJ dan DKM pada sel kanker payudara 4T1.
b. Mengkaji sinergisitas kombinasi EDJ dan DKM berdasarkan nilai indeks
kombinasi yang diperoleh.
c. Mengkaji potensi penghambatan migrasi sel kombinasi EDJ dan DKM.
D. Urgensi Penelitian
Penelitian ini dilakukan untuk mengeksplorasi kombinasi bahan alam
Indonesia yang berpotensi sebagai agen kemoprevensi dan kokemoterapi
penyakit kanker payudara, terutama untuk mengatasi kasus metastasis. Hasil
penelitian ini akan sangat bermanfaat untuk menambah data ilmiah mengenai
aktivitas sitotoksik serta kemampuan EDJ dan DKM dalam menghambat
migrasi sel kanker payudara 4T1. Hasil penelitian ini juga dapat dipublikasikan
4
untuk menambah informasi dan menjadi dasar pengembangan penelitian
selanjutnya untuk mengembangkan agen terapi kanker payudara yang lebih
efektif.
E. Tinjauan Pustaka
1.
Kanker Payudara
Kanker payudara merupakan kanker utama yang menyerang wanita dan
menjadi penyebab kematian kedua setelah kanker paru-paru (Siegel et al.,
2013). Kanker payudara menyerang pada membran mukosa dan kelenjar
payudara terutama pada ductus dan lobus. Adapun ciri-ciri sel kanker secara
umum yang telah dijelaskan oleh Hanahan and Weinberg (2011) yaitu:
a.
Sel kanker mampu mengadakan sinyal proliferasi secara terus
menerus dan mandiri sehingga sel akan membelah secara terus
menerus.
b.
Sel kanker mengalami kerusakan jalur antiproliferasi sehingga
penghambatan pertumbuhan sel kanker tidak dapat dihindari.
c.
Sel kanker mampu bertahan dari mekanisme apoptosis karena
jalurnya rusak. Apoptosis yaitu kematian sel yang mengalami
kerusakan gen secara terprogram.
d.
Sel kanker tidak mengalami senescence karena mampu melakukan
replikasi tanpa batas.
e.
Sel kanker mampu membentuk pembuluh darah baru atau
angiogenesis untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dan oksigen
sehingga sel kanker dapat terus tumbuh dan menyebar.
5
f.
Sel kanker mampu menginvasi jaringan dan bermetastasis karena
kehilangan E-chaderin yang merupakan molekul penting dalam
adhesi sel dengan sel lain.
g.
Sel kanker mampu menghidar dari kontrol sistem imun sehingga
tanda-tanda pembentukan sel kanker yang akan berkembang tidak
akan terdeteksi.
h.
Sel kanker mengalami ketidakstabilan dan mutasi genom sehingga
dapat menyebabkan gagalnya sel melakukan apoptosis.
i.
Sel kanker mampu menginduksi inflamasi sehingga ketersediaan
molekul bioaktif seperti faktor pertumbuhan akan terjaga sehingga
sel tetap dapat berproliferasi.
j.
Sel kanker mampu meregulasi energetik seluler sehingga proliferasi
sel menjadi tidak terkontrol.
Proses proliferasi kanker payudara diinisiasi oleh adanya overekspresi
beberapa protein, misalnya estrogen receptor (ER), progesteron receptor (PR)
dan human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) yang merupakan
protein predisposisi kanker payudara (Eccles, 2001). Sebesar 15-20% kanker
payudara merupakan kanker payudara yang triple negative, yaitu yang tidak
mengekspresikan ER, PR, dan HER2 (Abramson et al., 2015). Pada triple
negative breast cancer (TNBC), sering terjadi kegagalan dalam kemoterapi
(Vinod et al., 2013; Mehta et al., 2013). Dilaporkan sebagian besar pasien
kanker payudara yang mengekspresikan fenotip TNBC bersifat metastatik (Ma
6
et al., 2012). Sehingga perlu adanya pengembangan terapi yang lebih efektif
yaitu agen antimetastasis untuk mengatasi kegagalan tersebut.
2.
Migrasi dan Metastasis
Migrasi sel merupakan proses yang sangat penting dalam proses invasi,
yang memungkinkan tumor primer untuk bermetastasis. Migrasi dideskripsikan
sebagai perpindahan sel dalam substrat seperti membran basal atau serat
matriks ekstraseluler. Migrasi terjadi pada permukaan 2D tanpa merusak
jaringan serat. Sedangkan dalam invasi terjadi perpindahan sel menembus
matriks 3D dan diikuti dengan pembentukan kembali lingkungan 3D (Kramer
et al., 2012). Pada sel tumor, kemampuan invasi dan metastasis mampu
membentuk koloni baru setelah sel terlepas dari tumor primer. Migrasi sel
diawali dengan protrusi atau penonjolan membran sel membentuk lamellipodia
atau kaki semu. Sel kanker dapat bergerak secara perlahan melalui serat
matriks ekstraseluler (ECM) ke pembuluh darah pada tumor primer
menggunakan lamellipodia (Condeelis and Segall, 2003).
Metastasis merupakan salah satu tahapan dalam proses karsinogenesis di
mana terjadi penyebaran sel-sel kanker pada berbagai jaringan dan organ lain
dalam tubuh. Metastasis dapat menyebar melalui jaringan limfa, pembuluh
darah, rongga tubuh dan juga transplantasi kanker. Metastasis merupakan fase
kritik dan merupakan penyebab utama kematian pasien kanker (Steeg, 2003).
Pada proses metastasis, sel kanker atau tumor akan terlepas dari sel tumor
primer dengan merusak jaringan ekstraseluler, melakukan migrasi, menginvasi
jaringan di sekitarnya, memasuki pembuluh darah dan mencapai target jaringan
7
tertentu (Geho et al., 2005). Setelah berpindah dari sistem sirkulasi darah atau
sistem limpatik, sel kanker dapat tersimpan dalam suatu organ dan membentuk
tumor sekunder (Woodhouse et al., 1997). Proses terjadinya metastasis salah
satunya dimulai dengan peningkatan degradasi proteolitik komponen matrik
ekstraseluler (ECM) (Pantel and Brakenhoff, 2004). Setelah sel tumor melekat
pada ECM, sel tumor harus menghancurkan ECM dengan mengeluarkan enzim
proteolitik dan merangsang fibroblast dan makrofag untuk memproduksi enzim
protease. Terdapat tiga enzim protease, yaitu serin, sistein, dan metalloprotease (MMP). Terdapat 26 jenis MMP, diantaranya adalah MMP2 dan
MMP9 yang masuk dalam golongan gelatinase. Enzim ini mendegradasi
kolagen tipe IV pada membran basalis dan gelatin pada kulit (Verma and
Hansch, 2007). Ekspresi berlebihan dari MMP2 dan MMP9 dapat menurunkan
kemungkinan
survival
pasien
kanker
payudara.
Beberapa
penelitian
menyebutkan bahwa mitogen-activated protein kinase (MAPK) merupakan
pusat pengaturan aktivitas MMP (Chen et al., 2005 ; Westermarck and Kahari,
1999). MAPK terlibat dalam induksi promotor MMP melalui NF-κB dan AP-1
(Gondi and Rao, 2009). Ekspresi MMP9 diregulasi oleh faktor transkripsi NFкB (Cho et al., 2007), sedangkan MMP2 diregulasi oleh faktor transkripsi P53
(Kenny et al., 2008). Promotor MMP2 juga mempunyai beberapa faktor
transkripsi yang mengikat, diantaranya NF-κB dan AP-1 (Peng et al., 2006).
Selain itu, dilaporkan aktivasi jalur phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) dan
downstream-nya mampu meningkatkan kemampuan metastasis dengan
memodulasi motilitas dan invasi sel kanker (Lee et al, 2010). Terdapat bukti
8
bahwa faktor pertumbuhan dan sitokin mempengaruhi ekspresi MMP9 melalui
aktivasi faktor transkripsi NF-κB dan AP-1 melalui jalur signaling Ras/MAPK
dan PI3K/AKT (Deryugina and Quigley, 2006). NF-κB dan AP-1 mengikat
promotor MMP2 dan MMP9 dalam induksi ekspresi gen MMP2 dan MMP9
yang terkait dengan invasi sel tumor (Chuang et al., 2007 ; Huang et al., 2002).
Pengamatan migrasi sel dapat dilakukan dengan berbagai macam metode.
Terdapat 10 metode untuk mengamati migrasi sel yaitu Boyden chamber assay,
scratch wound healing assay, cell exclussion zone assay, Fence assay,
microcarrier bead assay, spheroid migration assay, horizontal capillary assay,
capillary tube migration assay, leukocyte migration agarose technique assay,
dan single cell motility assay (Kramer et al., 2012). Metode scratch wound
healing merupakan metode in vitro untuk pengamatan migrasi sel yang paling
sederhana dan ekonomis dibanding dengan metode lainnya (Todaro et al.,
1965). Prinsip dari metode ini adalah membuat celah buatan (scratch) pada sel
monolayer yang kofluen. Sel akan berkomunikasi satu sama lain sehingga pada
waktu tertentu akan menutup scratch yang telah dibuat. Tahap dasar dari
metode ini adalah membuat scratch pada sel monolayer, pengambilan gambar
pada waktu awal dan beberapa rentang waktu tertentu, kemudian
membandingkan gambar untuk menentukan nilai migrasi sel (Liang et al.,
2007). Pengamatan dilakukan hingga waktu 24 jam setelah perlakuan sampel.
Pengamatan lebih dari 24 jam akan mengurangi validitas penelitian karena
tidak dapat dibedakan antara sel yang berproliferasi dengan sel yang bermigrasi
(Rodriguez et al., 2005).
9
3.
Sel 4T1
Sel 4T1 adalah salah satu model sel kanker payudara yang sering
digunakan dalam penelitian karena mempunyai kemiripan sifat dengan kanker
payudara manusia stadium lanjut atau metastasis (Tao et al., 2008). Sifat dari
sel 4T1 adalah agresif, metastatik kuat, imunogenik rendah dan mewakili
karakteristik yang menyerupai kanker payudara stadium IV pada manusia
(Zwolak et al., 2008). Sel 4T1 merupakan model kanker payudara triple
negative, yaitu kanker payudara yang tidak mengekspresikan estrogen receptor
(ER), progesteron receptor (PR), dan human epidermal growth factor receptor
2 (HER2) (Bao et al., 2011). Sel 4T1 merupakan continous cell line yang
diisolasi dari jaringan tumor payudara mencit (Mus musculus). Sel 4T1 telah
digunakan untuk menguji efikasi terapi dan mekanisme molekuler agen
kemoterapi yang relevan terhadap manusia. Sel 4T1 mudah ditransplantasikan
pada mencit dan bermetastasis ke berbagai jaringan antara lain hati, paru-paru,
otak, limfa, dan tulang (Pulaski and Ostrand-Rosenberg, 2001).
4.
Jure (Nerium indicum Mill.)
Jure (Nerium indicum Mill.) (Gambar 1) adalah tumbuhan yang secara
tradisional dilaporkan sebagai antikanker (Hartwel, 1982). Di Indonesia,
tumbuhan ini dikenal dengan nama jure (jawa), kenyeri (Bali), kembang
mentega dan oleander (Hembing, 1993).
Klasifikasi tanaman ini adalah sebagai berikut:
Divisi
: Spermatophyta
Sub divisi
: Angiospermae
10
Kelas
: Dicotyledoneae
Bangsa
: Apocynales
Suku
: Apocynaceae
Genus
: Nerium
Jenis
: Nerium indicum Mill. (Backer and Van den Brink, 1963)
Gambar 1. Jure (Nerium indicum Mill.) (Koleksi CCRC)
Beberapa aktivitas telah banyak dilaporkan antara lain sebagai
antikanker, diuretika, antiskabies, mengobati herpes (Perry, 1980), antibakteri,
antijamur, ekspektoran, insektisida, bengkak, panguat jantung (Siddiqui et al.,
1987). Jure mengandung senyawa golongan kardenolida seperti oleandrin,
oleandrigenin, digoksin, digitoin, digitoksigenin, nerizoside, neritaloside, dan
odoroside (Trease and Evans, 2002). Tanaman jure mengandung senyawa
oleandrin yang berpotensi sebagai antiinflamasi dan antikanker (Shanmugam et
al., 2012). Ekstrak etanolik jure diketahui memiliki potensi antikanker,
diantaranya berefek sitotoksik pada sel leukimia HL60 dan K562 (Turan et al.,
2006), dan sel kanker paru-paru A549 (Jose et al., 2013). Oleandrin yang
merupakan senyawa bioaktif daun jure juga memiliki efek sitotoksik pada sel
myeloma (Wahyuningsih et al., 2000), dan sel kanker ginjal (Wahyuningsih,
2006). Kandungan senyawa golongan kardenolida dalam jure mampu
11
menghambat fibroblast growth factor -2 (FGF-2) melalui interaksi dengan
pompa Na+, K+ -ATPase pada sel kanker prostat (Smith et al., 2001). Oleandrin
mampu memblok NF-κB dan AP-1 yang diinduksi oleh TNF, PMA, dan LPS
(Manna et al., 2001) dan mampu menginduksi apoptosis pada sel kanker
prostat melalui penghambatan Na+, K+ -ATPase (McConkey et al., 2000). Uji
toksisitas sub akut daun jure pernah dilakukan pada tikus putih jantan galur
wistar dan hasil penelitian menunjukkan bahwa infusa daun jure sampai
konsentrasi 20% selama 30 hari tidak menyebabkan efek toksik dan perubahan
hematologi, berat badan, masukan makanan, kimia urin, SGPT, ureum dan
histopatologi masih dalam rentang nilai normal (Prasetyawati et al., 2004).
5.
Kayu Manis (Cinnamomum burmannii)
Kayu manis (Cinnamomum burmanii) (Gambar 2) merupakan tanaman
tahunan yang banyak terdapat di daerah sub tropis dan tropis. Selain digunakan
sebagai rempah atau pemberi cita rasa, hasil olahan lainnya seperti minyak
atsiri dan oleoresin banyak dimanfaatkan dalam industri farmasi, kosmetik,
makanan, minuman, rokok, dan sebagainya. Klasifikasi tanaman ini adalah
sebagai berikut:
Divisi
: Magnoliophyta-Flowering plants
Kelas
: Magnoliopsida-Dicotyledons
Subkelas
: Magnoliidae
Ordo
: Laurales
Famili
: Lauraceae- Laurel famili
Genus
: Cinnamomum Schaeffer- Cinnamon
12
Jenis
: Cinnamomum burmanii Nees ex Blume
(Wagner et al., 1999)
Gambar 2. Tanaman dan Simplisia Kayu Manis (Cinnamomum burmanii) (Koleksi CCRC)
Di dalam minyak atsiri kayu manis terdapat senyawa yang berperan
sebagai antioksidan dimana senyawa terbesar yang dimiliki adalah kumarin
(13,39%), eugenol (17,62%), dan sinamaldehid (60,72%) (Wang and Yang,
2009). Ekstrak kayu manis dapat menjadi inhibitor protein angiogenesis,
VEGF,
sehingga berpotensi sebagai agen kemopreventif (Lu et al., 2010)
serta menghambat pertumbuhan beberapa jenis sel myeloid dan menginduksi
G2/M arrest (Scoene et al., 2008). Sinamaldehid yang terdapat dalam kayu
manis memiliki aktivitas antiinflamasi dengan menghalangi degradasi IκB
sehingga mempengaruhi supresi NF-κB (Liao et al., 2005). Selain itu,
sinamaldehid juga mampu menurunkan level protein anti-apoptosis XIAP dan
Bcl-2 seiring dengan protein pro-apoptosis Bax (Lin et al., 2013 ). Larasati et
al. (2014) membuktikan bahwa DKM memiliki efek sitotoksik terhadap sel
kanker serviks HeLa dengan IC50 sebesar 250 µg/mL dan mampu menginduksi
apoptosis pada sel kanker serviks HeLa.
13
F. Landasan Teori
Kanker payudara stadium lanjut memiliki kemampuan untuk melakukan
metastasis atau penyebaran sel kanker pada organ dan jaringan tubuh lain.
Metastasis terjadi ketika sel terlepas dari tumor primer dan berpindah ke bagian
lain melalui sirkulasi darah ataupun limpa, hingga akhirnya sel kanker dapat
tersimpan dan membentuk tumor sekunder. Salah satu proses terjadinya
metastasis adalah adanya migrasi sel kanker di jaringan ataupun antar organ
dalam tubuh.
Daun jure dan kayu manis merupakan bahan alam yang mengandung
senyawa yang berpotensi sebagai antikanker yaitu oleandrin dan sinamaldehid.
Senyawa oleandrin dan sinamaldehid dilaporkan mampu berefek antikanker.
Salah satu mekanismenya yaitu melalui penghambatan jalur NF-κB dan AP-1.
Oleh karena itu, dengan dihambatnya jalur tersebut, diduga kombinasi daun
jure dan kayu manis mampu menekan ekspresi MMP2 dan MMP9 sehingga
menghambat migrasi sel kanker payudara yang telah mengalami metastasis.
Dengan demikian, diharapkan kombinasi EDJ dan DKM memiliki efek
penghambatan migrasi sel kanker melalui scratch wound healing assay.
G. Hipotesis
1. EDJ dan DKM bersifat sitotoksik pada sel kanker payudara 4T1
2. Kombinasi EDJ dan DKM memberikan efek sinergis berdasarkan nilai
indeks kombinasi yang diperoleh
Perlakuan kombinasi EDJ dan DKM memiliki potensi menghambat
migrasi sel kanker payudara 4T1