Output file - Digilib

Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
ISSN : 2087-9652
=======================================================================================================
01
SINTESA ATP BERTANDA P-32 SEBAGAI PERUNUT BIOLOGI MOLEKUL
Wira Y Rahman*, Endang Sarmini*, Herlina*, Triyanto*, Hambali*, A.Mutalib*
Santi Nurbaiti**
*Pusat Radioiaotop dan Radiofarmaka
**Kelompok Keahlian Biokimia, Fakultas Matematika & Ilmu Pengetahuan Alam, ITB
ABSTRAK
Kebutuhan perunut DNA/RNA dalam perkembangan biolologi molekul di Indonesia saat
ini sangat dirasakan. Salah satunya adalah nukleotida bertanda [γ32P]-ATP yang banyak
digunakan dalam penelitian bioteknologi. Penguasaan teknik sintesa nukleotida bertanda ini akan
sangat mendukung peningkatan kemampuan dalam bidang biologi molekul. Sintesa ini dilakukan
dengan reaksi enzimatis yang merupakan bagian dari proses glikolisis, dimulai dari fruktosa 1,6diphosphat, nukleotida ADP dan radioisotop P-32 dengan menggunakan enzim aldolase,
gliseraldehid 3-fosfat, 3-fosfogliseratkinase dan laktat dehidrogenase. Pemurniannya dengan
menggunakan kolom kromatografi DEAE Sephadex. ATP bertanda yang dihasilkan berada pada
Rf 0, dan P-32 dengan Rf 0,6. Dengan dihasilkannya nukleotida bertanda [γ32P]-ATP ini yang
juga merupakan dasar untuk sintesa nukleotida bertanda lainnya, diharapkan kebutuhan akan
nukleotida bertanda di Indonesia dapat terpenuhi.
Kata Kunci : Perunut DNA/RNA, Proses glikolisis, Enzimatis, Radioisotop P-32, Nukleotida
bertanda [γ32P]-ATP
ABSTRACT
DNA / RNA tracer requirement in the development of molecular biology in Indonesia is
currently strongly felt. One of them is labeled nucleotide [γ32P]-ATP which is widely used in
biotechnology research. Authorizing nucleotide synthesis techniques will support increasing
ability in molecular biology field. This synthesis was done by enzymatic reactions which part of
the glycolysis process, starting from fructose 1,6-diphosphat, ADP nucleotide and P-32
radioisotope by using aldolase enzyme, glyceraldehyde 3-phosphate, 3-phosphoglycerate kinase
and lactate dehydrogenase. Purification by using DEAE Sephadex column chromatography. ATP
labeled which is produced marked at Rf 0 and P-32 at Rf 0,6. Labeled nucleotide [γ32P]-ATP
which is resulted as basis for other labeled nucleotide synthesis so labeled nucleotides demand
in Indonesia is expected to be fulfilled.
Key words : DNA/RNA tracer, glycolysis process, enzymatic, P-32 radioisotope, nucleotide
labeled [γ32P]-ATP
7
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
ISSN : 2087-9652
=======================================================================================================
PENDAHULUAN
Biologi molekul telah mengalami perkembangan yang sangat pesat semenjak tiga
dasawarsa yang lalu dan telah memberikan banyak manfaat bagi perkembangan ilmu
pengetahuan maupun bagi kehidupan manusia sehari-hari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin,
bahan pangan, bahan pakaian dan lainnya, telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi
biologi molekul. Untuk mendapatkan kombinasi sifat-sifat baru suatu makhluk hidup dilakukan
perubahan langsung pada DNA dan genomnya. Usaha untuk mengubah DNA genom secara
langsung ini disebut dengan istilah rekayasa genetika. Dan untuk mendeteksi gen atau fragmen
DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar digunakan perunut
(pelacak/probe) DNA/RNA [1,2,3].
Edwin M Southern (1975) telah mempublikasikan prosedur untuk mendeteksi fragmen
DNA yang spesifik. Prosedur ini dikenal dengan nama teknik Southern Blotting. Perunut yang
digunakan untuk mendeteksi fragmen DNA yang spesifik tersebut merupakan asam nukleat
pendek, beruntai tunggal (RNA atau DNA beuntai tunggal) dan diberi label radioaktif [3,4].
Selama dekade terakhir ini aplikasi radioisotop telah berkembang dengan cepat tidak
hanya digunakan dalam pencitraan untuk memperoleh informasi fungsional suatu zat senyawa,
juga untuk mendalami berbagai macam proses fisiologi dan patologi. Pemanfaatan teknologi
nuklir dalam bidang kesehatan dengan teknik molekul saat ini di Indonesia semakin berkembang
seperti yang telah dilakukan di PATIR – BATAN dalam mendeteksi HPV (human papilloma
virus) penyebab kanker serviks, yaitu dengan mendeteksi DNA virus tersebut. Melalui DNA
virus bisa diketahui apakah virus tersebut menjadi penyebab kanker atau bukan. Sedikitnya ada
100 tipe HPV, namun hanya beberapa yang menyebabkan kanker serviks, yakni HPV 16 dan 18.
Dalam penelitian untuk tuberkulosis (TB) di Indonesia (Indonesia termasuk negara dengan
penderita TB terbanyak ke-3 setelah India dan China), radioisotop telah digunakan untuk
mendeteksi orang yang terkena penyakit dan juga mendeteksi kuman yang sifatnya resistan
[4,5,6,7]. Berbagai hasil penelitian menunjukkan bahwa metode radioaktif ternyata relatif lebih
sensitif daripada metode non radioaktif.
Seiring dengan perkembangan biologi molekul di Indonesia maka kebutuhan akan
senyawa nukleotida bertanda untuk perunut sangat dirasakan. Untuk itu penguasaan teknik
sintesa nukleotida bertanda akan sangat mendukung peningkatan kemampuan di bidang biologi
molekul. Proses sintesa ini dapat diterapkan sebagai tahap pertama dari suatu proses
berkelanjutan untuk memproduksi nukleotida bertanda [32P] lainnya.
METODA
Dalam proses sintesa nukleotida bertanda ini digunakan metoda yang dikembangkan oleh
Sakamoto [6] dengan menggunakan sebagian metode glikolisis yang diharapkan lebih efisien.
Diawali dari fruktosa 1,6-biphosphat yang dipecah oleh enzim aldolase membentuk dihidroksi
aseton phosphat dan gliseraldehid 3-phosphat. Dihidroksi aseton fosfat kemudian menjadi 3fosfogliseral-dehida juga dengan pertolongan enzim glycerol-3-phosphate dehydrogenase.
8
ISSN : 2087-9652
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
=======================================================================================================
32
H
3
32
PO + 5’-ADP
4
[γ- P]ATP
Selanjutnya fosfogliseraldehida bersenyawa dengan suatu asam fosfat radioaktif
(H332PO4) dan berubah menjadi 1,3–disfosfogliseraldehida. 1,3–difosfogliseraldehida berubah
menjadi asam 1,3–difosfogliserat dengan bantuan enzim dehidrogenase serta ion Mg2+,
membantu proses ini, sehingga ADP akan berubah menjadi AT32P.
Gambar. 1. Bagian dari proses glikolisis dengan reaksi enzimatis
pembentukan ADP menjadi ATP dengan penambahan P-32 radioaktiv
9
ISSN : 2087-9652
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
=======================================================================================================
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil karakterisasi proses sintesa nukleotida bertanda [γ32P]-ATP dianalisa dengan
menggunakan plat TLC PEI Celullosa dan Beta Counter Eberline sebagaimana terlihat pada
Gambar 2.
700000
600000
500000
Cacahan
400000
300000
200000
100000
0
-2 -100000
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Jarak (cm)
P-32 pH7
Gambar 2. Radioanalisa plat TLC dari 32P pH 7
Gambar 2. menunjukkan bahwa radioanalisa 32P pH 7 memiliki Rf sebesar 0,53 sementara dari
literatur diketahui bahwa 32P pH 7memiliki Rf 0,6. Hal ini mengindikasikan terjadinya sedikit
pergeseran pada nilai Rf untuk 32P, sedangkan nilai Rf ATP adalah 0. Hasil analisa juga
menunjukkan bahwa pada waktu inkubasi (t) 10 menit, ATP bertanda sudah terbentuk sedangkan
pada waktu inkubasi t=30 menit, tidak terdeteksi adanya ATP bertanda yang terbentuk. Pada
t=30 menit ATP bertanda yang telah terbentuk terlepas kembali 32P-nya sehingga yang terdeteksi
hanya 32P, seperti terlihat pada Gambar 3.
100000
80000
Cacahan
60000
40000
20000
Rf ATP
0
-2
-1
0
-20000
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Jarak (cm)
t=10 min
t=30 min
Gambar 3. Radioanalisa plat TLC untuk inkubasi selama (t) menit
10
ISSN : 2087-9652
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
=======================================================================================================
Dari hasil radioanalisa ini menunjukkan bahwa aktivitas awal 32P sebelum direaksikan sangat
tinggi, tetapi setelah direaksikan selama waktu inkubasi tertentu aktivitas yang terukur cukup
kecil. Hal ini menyarankan bahwa proses sintesa nukleotida bertanda ini memerlukan aktivitas
32
P yang cukup besar, sebagaimana yang dilakukan oleh Sakamoto yang menggunakan aktivitas
32
P sebesar 10 mCi/ml. Dalam penelitian ini, aktivitas 32P yang digunakan sebesar 0,1055
mCi/ml.
7000
6000
5000
Cacahan
4000
3000
2000
1000
0
-2
-1
0
-1000
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Jarak (cm)
Botol A
Botol B
Gambar 4. Radioanalisa plat TLC untuk botol A filtrat setelah loading ke kolom
dan botol B hasil elusi dengan HCl 0,03 M
Cacahan
Setelah nukleotida bertanda berhasil disintesis, selanjutnya dilakukan permurnian
menggunakan kolom kromatografi DEAE-Sephadex dan hasil fraksinasi yang didapatkan
dianalisa kembali dengan menggunakan plat TLC dan Beta counter Eberline. Botol A
merupakan filtrat hasil sintesis yang telah dimasukkan ke dalam kolom DEAE–Sephadex,
diharapkan ATP bertanda tertahan di dalam kolom sedangkan pengotor-pengotornya akan
terbawa keluar, terlihat tidak ada cacahan terukur (menandakan bahwa ATP bertanda tertahan di
dalam kolom). Kemudian kolom dielusi dengan HCl 0,03 M untuk menghilangkan sisa-sisa
fosfat anorganik, AMP dan ADP (ditandai dengan Botol B).
-2
400
350
300
250
200
150
100
50
0
-1-50 0
1
2
3
4
5
Fraksi 3
6
7
Jarak tiap 1 cm
Fraksi 4
8
9
10
11
12
13
14
15
Fraksi 5
Gambar 5. Radioanalisa dari fraksinasi setelah dielusi dengan HCl 0,25 M
pada fraksi 3, 4 dan 5
11
ISSN : 2087-9652
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
=======================================================================================================
Nukleotida bertanda [γ32P]-ATP kemudian dielusi dengan menggunakan larutan HCl 0,25
M. Setiap 1 ml fraksi dikumpulkan dalam mikrotube untuk dianalisa dengan menggunakan Beta
counter Eberline. Hasilnya menunjukkan bahwa ATP bertanda 32P terdapat dalam 3 – 5 ml
pertama dari 15 ml eluat yang dihasilkan sebagaimana terlihat pada Gambar 5. Hasil radioanalisa
ini menunjukkan aktivitas nukleotida bertanda terdapat pada fraksi 3, 4 dan 5 meskipun
aktivitasnya masih cukup rendah.
Puncak-puncak yang lainnya kemungkinan besar adalah hasil samping dari reaksi
enzimatis karena pemisahan baru dilakukan setelah menit ke 30, untuk hasil yang lebih optimal
akan dilakukan pemisahan pada t=10 menit. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada reaksi
enzimatis t=10 menit berikut :
Cacahan
60000
55000
50000
45000
40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
-5000
-2
-1
0
-10000
t=10 min
Rf 32P
Rf ATP
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Jarak (cm)
t=10 min
Gambar 6. Radioanalisa dari reaksi enziamtis pada t=10 menit
Cacahan terukur cukup besar berkisar 55000, tetapi karena reaksi dibiarkan berlangsung sampai
30 menit ATP yang terbentuk terlepas kembali menjadi ADP dan 32P. Sehingga sangat
mempengaruhi hasil akhir proses pemisahan.
KESIMPULAN
Dari proses sintesis yang dilakukan didapatkan ATP bertanda 32P ([γ32P]-ATP) berada
pada fraksi 3, 4 dan 5, meskipun aktivitas yang didapatkan masih cukup rendah. Hal ini
dikarenakan aktivitas enzim yang digunakan cukup kecil dan rendahnya aktivitas 32P yang
digunakan (0,1055 mCi). Sehingga untuk mendapatkan nukleotida bertanda dengan aktivitas
yang diinginkan membutuhkan aktivitas dari 32P yang cukup tinggi. Dengan berhasil
disintesisnya [γ32P]-ATP ini membuka peluang proses sintesis berkelanjutan untuk memproduksi
nukleotida bertanda [32P] lainnya.
12
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
ISSN : 2087-9652
=======================================================================================================
UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis mengucapkan terimakasih kepada sejawat dari PTNBR – BATAN Bandung,
terutama Ibu Azmairit dkk, atas kerjasamanya yang baik dalam penyediaan P-32 (H332PO4).
DAFTAR PUSTAKA
1. Fatchiyah dan Estri Laras Arumningtyas, “Kromosom, Gen, DNA, Synthesis Protein dan
Regulasi”, Laboratorium Biologi molekul dan Seluler Universitas Brawijaya Malang,
2006.
2. Nunuk Priyani, ”Sifat Fisik dan Kimia DNA”, Program Studi Biologi dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara, 2004.
3. Aris Tjahjoleksono, “Teknologi DNA Rekombinan”, Jurusan Biologi FMIPA, Institut
Pertanian Bogor.
4. Budiawan, ”Pengembangan Teknik 32P-Postlabelling untuk Mendeteksi Dini Resiko
Kanker”, Risalah Pertemuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan
Radiasi, 2000.
5. Ratnawati Kukuh, Muhayatun dan Natalia Adventini, ”Sintesa dan Pemurnian [y32P]ATP”, Procedings Seminar Sains dan Teknologi Nuklir, PPTN-BATAN Bandung,
19-20 Maret 1997.
6. F. Sakamoto, M. Izumo, K. Hashimoto, Y. Fuji,”Study of optimum condition for
synthesis of [y-32P]ATP with high specific radioactivity”, Journal of Radioanalytycal
and Nuclear Chemistry, Vol. 239, No.2 (1999) 423-427.
7. Mukh Syaifudin dan Devita Tetriana, “ANALISIS MUTASI GEN inhA UNTUK UJI
RESISTENSI M. tuberculosis TERHADAP ISONIAZID DENGAN METODE SSCP
RADIOAKTIF”, Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi, BATAN Jakarta
13