Produksi asam suksinat oleh Actinobacillus

Andriyani_1513100005_B
Produksi asam suksinat oleh Actinobacillus succinogenes
pada batch fermentation dari gula campuran
Asam suksinat merupakan salah satu bahan yang diperlukan dalam dunia
industri. Asam suksinat merupakan salah satu produk fermentasi , salah satu hasil
fermentasi dari A. Succinogenes. A. Succinogenes adalah mikroorganisme capnophilic,
dan memiliki reaksi karboksilasi melalui fosfoenolpiruvat (PEP) yang diubah menjadi
oksaloasetat (kunci dalam jalur pembentukan asam suksinat) ,karbonat dibutuhkan
untuk reaksi dapat diberikan dengan penambahan garam karbonat atau melalui sparging
dengan CO2. Produksi suksinat oleh A. Succinogenes dari monosakarida glukosa,
manosa, galaktosa, arabinosa dan xylose, serta dari gula campuran meniru komposisi
gula SSL yang diproduksi melalui proses pulping kayu Eucalypus globulus . bahan baku
yang kaya pentosa ini sebagai pemanfaatan gula yang mengandung aliran limbah dari
industri pulp dan kertas
Bahan dan metode yang digunakan pada penelitian ini meliputi:
1. Mikroorganisme yang digunakan yakni Actinobacillus succinogenes 130Z (CCUG43843)
2. Seed culture, Menggunakan medium TSB ( Tryptic Soy Broad) , mikroorganisme
yang akan digunakan dikultur dalam 100-150 ml TSB selama 12-16 jam dan
diinkubator pada suhu 37o C dan 130 rpm
3. Fermentasi masing-masing jenis gula pada botol duran
Fermentasi batch dilakukan di dalam botol duran , masing- masing
monosakarida yang di gunakan sebanyak 10 g/l sebagai sumber karbon. 5 g/l yeast
extract , 1.16 g/L NaH2PO4·H2O, 0.31 g/L Na2HPO4, 1 g/L NaCl, 0.2 g/L
MgCl2·6H2O and 0.2 g/L CaCl2·2H2O. Para fermentasi dilakukan dengan penambahan
dari 10 g / L dari MgCO3 pada awal fermentasi. MgCO3 memiliki kelarutan rendah dan
bertindak sebagai buffer solid,secara bertahap melarutkan asam organik yang diproduksi
dan diberikan Supplay Co2 sebanyak 0,5 vvm. Dan kemudian diinkubasi pada 170 rpm
dan 37 0 C
4. Fermentasi menggunakan bioreaktor pada campuran gula
Benih inokulum yang digunakan adalah 10 % , medium yang digunakan sama
dengan medium pada botol duran namun sumber karbon yang digunakan dicampur
dalam 50g/l dengan rasio 6,2 g/l glukosa, 6,,4 g,l galaktosa, 2,6 g/l mannosa, 2 g/l
arabinosa, 32,8 g/l xylosa, rasio yang digun akan bersdasarkan konsentrasi aliran SSL
yang diproduksi dari kalsium/magnesium sulfite pulping pada Eucalypus globulus.
Supplay karbonat diberikan dengan 5 kondisi berbeda yakni: 0,5 vvm CO2,
MgCo3(50g/l), kombinasi 0,5 vvm dengan MgCO3 dan 6,20 atau 50 g/l MgCO3 yang
ditambahkan.
5. fermentasi Bioreaktor SSL, Menggunakan kondisi dan medium seperti fermentasi
campuran gula, gula murni digantikan dengan SSL
6. Analisis
Analisis yang dilakukan meliputi: optikal density pada 600 nm, berat kering (berat
kering diukur pada eksperimen bioreaktor tanpa MgCO3 dan berkorelasi dengan optikal
Andriyani_1513100005_B
density, pengukuran fluoresense (menggunakan BioView Sensor ), pengukuran aktifitas
enzim (Aktivitas enzim terkait dengan jumlah protein dalam ekstrak sel, yang
ditentukan dengan menggunakan Kit Coomassie Ditambah Assay (Thermo Fisher
Scientific, Waltham, MA, USA),Pengukuran pada 595 nm), gula dan asam (Analisis
dilakukan
menggunakan
HPLC),
karbon
dan
kalkulasi
keseimbangan
redoks(keseimbangan karbon dihitung dari hasil produk dinyatakan dalam C-mol / Cmol)
Hasil
1. Batch fermerntation pada masing –masing gula
Bhh glukosa merupakan jenis gula yang dikonsumsi
gula
tercepat dengan hasil asam suksinat yakni
sebesar 0,56 g/g, hasil ini adalah hasil tertinggi
dibandingkan menggunakan sumber karbon
yang lain. Hasil suksinat sumber karbon yang
lain yakni : xylosa 0,42 g/g; mannosa : 0,38g/g;
arabinosa : 0,44 g/g
pentosa memberi hasil asetat
yang lebih tinggi dari gula
heksosa , hasil biomasa pada
hexosa ( glukosa dan manosa )
lebih tinggi dari gula pentosa
2. Batch Fermentation pada campuran gula
1. Serapan gula
Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa serapan gula dan produksi suksinat terus berlanjut
hingga sebagian besar gula diserap. Xylosa belum dapat terserap secara keseluruhan pada 72
jam, namun konsentrasi residu hanya 1-2 g/l. Glukosa yang jumlahnya lebih rendah dari
pada xylose habis setelah 30 jam. Glukosa dan xylosa dikonsumsi secara co-consumsi,
konsumsi glukosa lebih rendah dari pada xylose. Manosa dan arabinosa akan dikonsumsi jika
sebagian besar glukosa telah dikonsumsi sedangkan galaktosa tidak dikonsumsi sama sekali
2. Produksi asam
Pada fase inisiasi pertumbuhan konsentrasi asam asetat sebanding dengan konsentrasi asam
suksinat pada 12 sampai 20 jam
3. Profil pertumbuhan biomasa
konsentrasi biomassa maksimum dicapai dalam 12-20 jam setelah penurunan bertahap Pada
saat penurunan OD, agregasi sel diamati di permukaan cairan di reaktor dan terbentuk busa.
Jumlah sel agregat mengalami peningkatan mulai pengamatan pertama sampai akhir
percobaan.
Andriyani_1513100005_B
4. Produk hasil, Karbon, Keseimbangan redox
Nilai negatif pada hasil karbon dioksida dikalkulasikan
berdasarkan rumus
menunjukkan fiksasi bersih dari karbon dioksida yang
terjadi menyebabkan produk suksinat tinggi sesuai yang
diharapkan. Hasil penelitian menunjukkan keseimbangan
karbon terjadi antara 84-104%
5. Aktifitas enzim
Aktifitas enzim mengindikasikan jalur metabolisme mana yang aktif. Aktifitas G6PDH diuji
untuk mengetahui keterlibatan jalur oxidatif pentosa fosfat. Aktifitas G6PDH tertinggi
pada seed kultur (95±12 mU/mg).Sedangkan aktifitas FDH sangat terbatas pada semua
sampel. Hasil menunjukakan ekspresi enzim FDH tidak diaktifkan selama peralihan dari
aerobik ke anaerobik
6. Supplay karbonat
Satu C-mol CO2 diperlukan untuk setiap tiga C-mol monosakarida yang
diubah menjadi suksinat. Kebutuhan karbonat dapat disuplai dengan gas CO2, baik
penuh maupun sebagian. Fermentasi dilakukan dengan 5 kondisi asupan karbonat yang
berbeda Satu-satunya produk yang menunjukkan hasil perbedaan signifikan secara
statistik kondisi pasokan karbonat adalah biomassa hasil (F (4,9) = 5,47, p = 0,0163).
Namun, ada tidak ada kecenderungan secara sistematis dalam biomassa hasil dengan
pasokan karbonat. Perbedaan ini kemungkinan karena pembentukan biofilm.
7. Fermentasi SSL
glukosa akan dikonsumsi setelah konsumsi xylosa mencapai 76%,
arabinosa 52%, mannosa 39% . biomasa pada fermentasi SSL tidak
dapat diukur baik menggunakan densitas maupun berat kering sel
Keterangan : A .suksinat (segitiga hitam), asam asetat (black
diamond), asam format (segitiga putih), asam laktat (persegi putih).
B. Xylose (segitiga putih) , galaktosa (segitiga hitam), glukosa
(lingkaran putih), mannose (diamond putih) dan arabinosa (hitam
persegi).
Andriyani_1513100005_B
Diskusi
1. Hasil Suksinat
Hasil suksinat yang diperoleh dari A. succinogenes bervariasi tidak hanya karena
sumber karbon A. succinogenes, seperti Pasteurellaceae spp menunjukkan auxotrophy
untuk beberapa nutrisi, misalnya, amino asam glutamat, sistein dan metionin. senyawa
ini biasanya ditemukan pada rumen ,namun dalam penelitian fermentasi, penambahan
suksinat dalam medium diperlukan untuk mendukung pertumbuhan. Hasil suksinat
dengan glukosa sebagai sumber karbon utama berkisar 0,50-0,94 g suksinat per g
glukosa . A. succinogenes memiliki beberapa tentative glucose uptake systems, baik
phosphotransferase ditambah sistem (PTS) dan sistem permease. faktor utama tingginya
hasil suksinat pada glukosa adalah penyerapan PTS-independent pada glukosa . hasil
suksinat yang diperoleh pada xylose (0.42 g / g) dan arabinosa (0.44 g / g) secara
signifikan lebih rendah dari pada glukosa.
Produk xylosa dan arabinosa memberikan hasil yang lebih rendah dari pada
glukosa, pada sistem transport xylosa dan arabinosa sperti memiliki perbedaan dengan
sistem transport pada glukosa. Terdapat dugaan tingginya hasil suksinat pada glukosa
disebabkan karena rendahnya afinitas pada proton symporter D-xylosa dan tingginya
afinitas ATP- dependent transporter ada xylosa dan arabinosa.
2. Produktifitas
Hasil produktifitas berkisar antara 0,32 dan 0,53 g / (Lh) Percobaan dengan gula
yang berbeda menunjukkan produktivitas asam suksinat lebih rendah untuk xylose,
mannose dan arabinosa dibandingkan dengan glukosa . sistem transportasi untuk
beberapa gula yang berbeda menyebabkan produktivitas yang berbeda. Penelitian
sebelumnya pada substrat glukosa menunjukkan penurunan laju pertumbuhan dan
produktivitas asam suksinat ketika lebih dari 30 g / L glukosa. Dalam percobaan pada
fermentasi gula campuran, total konsentrasi gula (50 g / L) memberikan hasil yang jauh
lebih tinggi. Jika mekanisme penghambatan adalah sama untuk semua gula dan efeknya
aditif, cara fed-batch dapat meningkatkan produktifitas. Selama pertumbuhan pada
glukosa, pembentukan biomassa berhenti ketika jumlah dari produk mencapai 20 g / L,
setelah yang produksi asam suksinat itu dipisahkan dari pertumbuhan.
3. By‑product formation and carbon balance
hasil suksinat hilang dari perubahan karbon menjadi biomasa atau diekskresikan
oleh produk.Terdapat hasil lain yakni asetat dan format serta sebagian kecil laktat. .pada
jalur metabolik A. succinigenes, gula dimetabolisme pada jalur embden-meyerhofparnas dan jalur pentosa fosfat (PPP) keduanya berakhir di fosfoenol pirufat (PEP)
Andriyani_1513100005_B
dimana metabolisme terbagi menjadi dua cabangy yaitu C3 dan C4. cabang C4 dari PEP
ke suksinat terdapat empat jalur enzim ,enzim yang pertama yaitu fosfoenolpiruvat
carboxykinase (PEPCK) yang mengkatalisis konversi PEP ke oksaloasetat (OAA)
melalui fiksasi CO2. hasil suksinat yang tinggi diperoleh dengan meminimalkan produk
yang terbentuk pada jalur C3 dengan menyediakan cukup karbonat untuk karboksilasi .
dengan demikian banyak aliran metabolik yang menuju jalur C4. ketika karboksilasi
terlalu rendah etanol dapat dibentuk, bukan suksinat, namun dalam penelitian ini tidak
ditemukan etanol selama fermentasi, cabang C3 dimulai dengan piruvat kinetase yang
mengkonversi PEP ke piruvat, kemudian lanjut dilanjut ke metabolisme C3, C2 dan C1.
gen encoding untuk laktat dehidrogenase (LDH) telah ditemukan dalam genom namun
produksi laktat sangat rendah . Produk yang ditemukan melimpah selain suksinat adalah
asetat , asetat dibentuk melalui jalur PFL yang seharusnya menghasilkan jumlah molar
yang sama dengan fomat namun dalam percobaan ini jumlah molar asetat kurang dari
jumlah molar format, perbedaan jumlah format dan asetat dapat dihitung melalui 2
reaksi yang berbeda yakni 1. beberapa asetat yang diproduksi oleh PDH lebih
menghasilkan CO2 dari pada format ,2. ada juga format yang kemudian dioksidasi
menjadi CO2 oleh formate dehydrogenase (FDH) uji aktifitas enzim menunjukkan
adanya aktifitas PDH namun tidak ada aktifitas FDH , ini menujukkan bahwa asetat
yang melebihi jumlah format diproduksi melalui jalur PDH dalam fermentasi oleh A.
succinogenes, CO2 merupakan substrat dan produk, yang dapat difiksasi oleh PEPCK
dan di lepaskan oleh dekarboksilasi melalui enzim lain. jumlah karbon yang ditemukan
sebagai produk akhir fermentasi melebihi jumlah karbon yang disediakan sebagai gula
diawal, sejalan dengan fiksasi CO2 oleh PEPCK selama suksinat diproduksi. salah satu
alasan fiksasi / evolusi CO2 tidak hanya dapat diestimasi pada jalur metabolisme untuk
pengukuran produk akhir. evolusi CO2 dari jalur lain seperti jalur pentosa phospate
(OPPP) tidak menunjukkan pengukuran produk akhir dapat masuk pada estimasi CO2.
aktifitas enxim G6PDH , pada OPPP mengindikasikan bahwa OPPP aktif dalam proses
fermentasi.
4. suplay karbonat
produksi satu mol suksinat dari monosakarida menghasilkan satu mol NADH,
memerlukan regenerasi untuk memepertahankan keseimbangan redoks.Asetat
dihasilkan dari glukosa melalui jalur PFL menghasilkan satu NADH per mol asetat.
Dengan demikian, equimolar produksi suksinat, asetat dan format akan memenuhi
keseimbangan NADH. selama fase pertumbuhan terbentuk asetat dan suksinat di dekat
rasio ekuimolar tetapi produksi ini sedikit berkurang pada tahap dua dimana format
tidak lagi dibentuk dan rasio asetat untuk produksi suksinat menurun. hal ini
menunjukkan jalur PFL hanya aktif pada fase pertumbuhan, namun PDH tetap aktif
selama proses fermentasi. Meskipun asetat dibentuk oleh PDH menghasilkan 2 mol
NADH per mol asetat, keseimbangan redoks selama non-pertumbuhan suksinat
menghasilkan fase tidak puas karena sebagian besar jumlah suksinat terbentuk pada fase
ini. untuk menjaga keseimbangan NADH diperlukan penambahan jalur pada regenerasi
NADH. produktivitas suksinat pada glukosa yang berbeda lebih tinggi dari pada
campuran gula. Sebuah produktivitas maksimum 0,86 g / L h dicapai ketika diletakkan
pada 100 g / glukosa L dan 40 g / L MgCO3 dengan 0,1 vvm CO2 sparging Karena
produktivitas gula yang dicampur dalam penelitian ini memiliki pasokan karbonat lebih
rendah 0,32 0,53 g / L jam, mungkin tidak menjadi faktor pembatas. Karena kedua
CO2 dan MgCO3 dapat digunakan sebagai pasokan karbonat, Pasokan garam karbonat
dapat dibuat sebagai tambahan ke reaktor bersama-sama dengan komponen media
Andriyani_1513100005_B
lainnya di awal fermentasi atau dipompa ke dalam reaktor sebagai solusi. Selain garam
karbonat yang lebih ekonomis menggunakan metode yang sederhana sedangkan
Penambahan CO2 gas membutuhkan
peralatan sparging dan energi untuk
menggerakkan kompresor gas . hal lain yang dapat meningkatkan produktifitas suksinat
adalah P dengan integrasi dengan tanaman bioetanol. integrasi melibatkan pemanfaatan
gula dari biomassa yang dihidrolisis, di mana etanol yang diproduksi yeast
mengkonsumsi heksosa dan setelah penghapusan etanol dengan distilasi, A.
succinogenes bisa memfermentasi pentosa menjadi suksinat. yeast dapat sebagai
.sumber nitrogen dan CO2 dari fermentasi etanol sebagai sumber karbonat. Dengan cara
ini, fraksi karbohidrat biomassa sepenuhnya dimanfaatkan.
5. SSL
SSL ditambahkan dalam produksi asam yang sesuai. konsumsi gula dalam percobaan
ini mengikuti tren yang sama seperti di fermentasi gula campuran. Glukosa lebih
disukai sebagai substrat . Perbedaan utama dibandingkan dengan fermentasi gula
campuran adalah bahwa galaktosa dikonsumsi selama fermentasi SSL meskipun hanya
dalam jumlah yang kecil. Sangat mungkin bahwa galaktosa dikonsumsi di tingkat
rendah bahwa konsumsi itu hanya terdeteksi di fermentasi SSL karena waktu fermentasi
diperpanjang . salah satu penelitian menemukan bahwa konsumsi galaktosa adalah lebih
lambat dari konsumsi glukosa, xilosa dan arabinosa .tidak ada perubahan distribusi
produk sebagai konsekuensi menigkatnya permintaan pemeliharaan karena
penghambatan senyawa yang ditemukan dalam SSL