lampiran - IPB Repository

LAMPIRAN
Lampiran 1 Bagan alir penelitian
Biawak air
bagian duodenum,
jejenum, ileum, kolon
Cuci dengan akuades
dan kerok lapisan
atasnya (mukosa
Ekstraksi enzim protease
Analisis kadar protein
Pencirian enzim
SDS-PAGE
Analisis aktivitas keratinase
(in vitro)
Lampiran 2 Prosedur pembuatan pereaksi kimia
Pereaksi untuk analisis aktivitas enzim dan kadar protein
•
Kasein Hammarsten 2% b/v
Sebanyak 1 g kasein ditimbang, lalu dilarutkan dalam 40 ml bufer fosfat 50 mM, pH
7,0 kekeruhan larutan dihilangkan dengan penambahan NaOH 1 M, lalu diatur
hingga pH 7 dengan penambahan HCl 1 M dan ditera dengan akuades hingga
volume total 50 ml.
•
Tirosin 5 mM
Sebanyak 0,0453 g tirosin dilarutkan dalam 40 ml akuades dan ditambahkan NaOH
1 M hingga larut, lalu dinetralkan hingga pH 7,0 dengan HCl 1 M. Selanjutnya,
larutan ditera dengan akuades hingga volume 50 ml.
•
TCA 0.1 M
Larutan stok TCA 1 M dibuat dengan cara melarutkan 16,339 g TCA dalam 100 ml
akuades, lalu diaduk dengan pengaduk magnetik hingga homogen. Larutan kerja
TCA 0,1 M dibuat dengan cara mengencerkan 10 ml larutan TCA 1 M dengan
akuades hingga volume 100 ml.
•
Na2CO3 0,4 M
Sebanyak 4,2397 g Na2CO3 dilarutkan dalam 100 ml akuades, lalu diaduk dengan
pengaduk magnetik hingga homogen.
•
Pereaksi Folin-Ciocalteau (1:2)
Sebanyak 10 ml pereaksi Folin-Ciocalteau diencerkan dengan akuades hingga
volume 30 ml.
•
Pereaksi Bradford
Stok larutan Bradford dibuat dengan cara melarutkan 0,1 g Coomassie Brilliant Blue
G-250 dalam 50 ml etanol 95% v/v dan 100 ml asam fosfat 85% v/v, lalu ditera
dengan akuades hingga volume 200 ml. Larutan kerja Bradford dibuat dengan cara
mengencerkan 5 ml larutan stok Bradford dengan akuades hingga volume total 50
ml.
Pereaksi untuk analisis SDS-PAGE dan zimografi
•
Larutan A (40% (b/v) akrilamida; 2 % (b/v) bis-akrilamida)
Sebanyak 4,38 ml akrilamida dan 2,40 bis-akrilamida untuk gel pemisah dan
Sebanyak 0,48 ml akrilamida dan 0,26 ml bis-akrilamida untuk gel penahan.
•
Larutan B (bufer gel pemisah, Tris-HCl 1,5 M pH 8,8)
Sebanyak 3,75 ml larutan Tris-HCl pH 8,8 dan 0,15 ml larutan SDS 10% (b/v)
untuk gel pemisah.
•
Larutan C (bufer gel penahan, Tris-HCl 1,5 M pH 6,8)
Sebanyak 1,26 ml larutan Tris-HCl pH 6,8 dan 50 µl larutan SDS 10% (b/v) untuk
gel penahan.
•
Ammonium persulfat 10% (b/v)
Sebanyak 0,1 g ammonium persulfat dilarutkan hingga homogen dengan 1 ml
akuades.
•
Bufer elektroforesis
Sebanyak 1.803 g Tris, 8,648 g glisin, dan 0,6 g SDS dilarutkan dengan 600 ml
akuades, lalu ditera hingga pH 8,3 dengan HCl 1 M.
•
Bufer sampel
1. SDS-PAGE
Sebanyak 0,3 ml Tris-HCl 1 M pH 6,8, 2,5 ml gliserol 50% (v/v), 1 ml SDS
10% (b/v), 0,25 ml 2-merkaptoetanol, 0,5 ml bromfenol biru 1% (b/v), dan 0,45
ml akuabides sampai volume total 5 ml.
2. Zimografi
Sebanyak 0,5 g SDS, 1 ml gliserol 50% (v/v), 1 ml bromfenol biru 1% (b/v),
0,625 ml Tris-HCl 1 M pH 6,8, dan 2.,75 ml akuabides sampai volume total 5
ml.
•
Larutan pewarna
Sebanyak 0,5 g Coomassie Brilliant Blue R-250 dilarutkan dalam campuran 225 ml
metanol, 50 ml asam asetat glasial, dan 225 ml akuades sampai volume total 500 ml.
•
Larutan peluntur
Komposisi larutan peluntur terdiri atas 50 ml metanol, 50 ml asam asetet glasial, dan
400 ml akuades sampai volume total 500 ml.
Larutan berbagai bufer
Larutan kerja bufer 50mM dibuat dengan cara mengencerkan 25 ml larutan stok
bufer 0,2 M dengan akuades hingga volume total 100 ml.
Lampiran 3 Pembuatan kurva standar Bradford.
[BSA] (mg/ml)
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
Absorbansi
(nm)
0,064
0,070
0,074
0,079
0,080
0,082
0,087
0,089
0,090
0,092
Sampel
duodenum
jejenum
ileum
kolon
Absorbansi
0,115
0,108
0,106
0,081
0,100
0,090
Absorbansi (nm)
0,080
0,070
0,060
y = 0,0299x + 0,0643
R2 = 0,9614
0,050
0,040
0,030
0,020
0,010
0,000
0,00
0,20
0,40
0,60
[BSA]m g/m l
0,80
1,00
1,20
kadar
protein
1,6956
1,4615
1,3946
0,5585
Lampiran 4 Penentuan absorbansi enzim maksimum protease dari bagian usus biawak
air
Suhu 45°C
Waktu
(menit)
5
10
15
20
Suhu 55°C
Waktu
(menit)
5
10
15
20
Suhu 65°C
Waktu
(menit)
5
10
15
20
A Blanko
(nm)
A Standar
(nm)
2,115
2,291
2,398
2,014
2,354
2,312
2,429
2,149
A Blanko
(nm)
A Standar
(nm)
2,129
2,186
2,150
2,265
2,299
2,287
2,226
2,468
A Blanko
(nm)
A Standar
(nm)
2,118
2,259
2,286
2,167
2,273
2,326
2,318
2,338
Duodenum
2,783
2,414
2,602
2,512
A Sampel (nm)
Jejenum
Ileum
2,642
2,609
2,396
2,385
2,613
2,481
2,404
2,428
Kolon
2,616
2,380
2,480
2,413
Duodenum
2,745
2,548
2,506
2,528
A Sampel (nm)
Jejenum
Ileum
2,685
2,684
2,546
2,484
2,497
2,363
2,277
2,596
Kolon
2,645
2,479
2,361
2,436
Duodenum
2,396
2,516
2,345
2,372
A Sampel (nm)
Jejenum
Ileum
2,332
2,316
2,519
2,559
2,318
2,346
2,329
2,325
Kolon
2,255
2,545
2,359
2,324
Lampiran 5 Penentuan aktivitas maksimum enzim spesifik dari bagian usus biawak air
Suhu
45
Waktu
(menit)
5
10
15
20
Suhu
55
Waktu
(menit)
5
10
15
20
suhu
65
Waktu
(menit)
5
10
15
20
Aktivitas enzim (U/ml)
Duodenum Jejenum
Ileum
3,3540
2,6460 2,4803
3,5143
3,0000 2,6857
2,6322
2,7742 1,0710
1,1066
0,8666 0,9200
Aktivitas enzim Spesifik (U/mg)
Kolon
2,5155
2,5428
1,0581
0,8867
Duodenum
1,9780
2,0725
1,5523
0,6526
Jejenum
1,8104
2,0526
1,8981
0,5929
Ileum
1,7785
1,9257
0,7679
0,6597
Kolon
4,5038
4,5527
1,8944
1,5875
Aktivitas enzim (U/ml)
Duodenum Jejenum
Ileum
4,3482
3,9247
3,9176
2,1505
2,1386
1,7703
1,8737
1,8263
1,1215
0,3887
0,0177
0,4892
Kolon
3,0353
1,7406
1,1105
0,2527
Aktivitas enzim Spesifik (U/mg)
Duodenum
Jejenum
Ileum
Kolon
2,5643
2,6853 2,8091 5,4345
1,2682
1,4633 1,2693 3,1164
1,1050
1,2496 0,8041 1,9883
0,2292
0,0121 0,3507 0,4525
Aktivitas enzim (U/ml)
Duodenum Jejenum
Ileum
2,1523
1,6567
1,5330
2,3015
2,3284
2,6865
0,7375
0,4000
0,7500
0,3596
0,2842
0,2772
Kolon
1,0606
2,5612
0,9125
0,2754
Aktivitas enzim Spesifik (U/mg)
Duodenum
Jejenum
Ileum
Kolon
1,2693
1,1335 1,0992 1,8990
1,3573
1,5931 1,9263 4,5856
0,4349
0,2737 0,5378 1,6338
0,2121
0,1945 0,1988 0,4932
Lampiran 6 Contoh perhitungan aktivitas enzim (U/ml) dan aktivitas spesifik (U/mg).
Perhitungan aktivitas enzim (U/ml)
Asampel − Ablanko
faktorpeng enceran
Aktivitas protease (U/ml) =
Χ
As tan dar − Ablanko
waktuinkub asi
Contoh perhitungan pada suhu 45 °C selama 5 menit sampel duodenum
Aktivitas keratinase (U/ml) =
2,783 − 2,115 6
Χ
2,351 − 2,115 5
=3,3540 U/ml
Perhitungan kadar protein (mg/ml)
Persamaan dari kurva standar:
y = 0,0299x + 0,0643
x = [BSA] mg/ml
Y = Absorbansi (nm)
Contoh perhitungan pada sampel duodenum dengan nilai absorbansi 0,115
y = 0,0299x + 0,0643
0,115 = 0,0299x + 0,0643
x = 1,6356 mg/ml
[protein] (mg/ml) = 1,6356 mg/ml
Perhitungan aktivitas spesifik enzim (U/mg)
Aktivitas Enzim spesifik (U/mg) =
aktivitasenzim(U / mg )
[Pr otein](mg / ml )
Contoh perhitungan pada suhu 45 °C selama 5 menit sampel duodenum
Aktivitas Enzim Spesifik (U/mg) =
3,3540
1,6356
=1,9779 U/mg
Lampiran 7 Data Pengaruha Suhu, pH dan ion logam pada aktivitas enzim maksimum dari ekstrak kasar
enzim protease lapisan atas (mukosa) usus biawak air (Varanus salvator).
Pengaruh suhu
Suhu Blanko
(°C)
(nm)
45
55
65
2,115
2,129
2,118
Pengaruh pH
Blanko
pH
(nm)
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1,340
1,307
1,275
1,283
1,301
1,362
1,217
1,328
1,285
1,266
Standar
(nm)
2,354
2,299
2,273
Duodenum
2,783
2,745
2,396
Standar
(nm)
1,980
1,932
1,981
1,941
1,979
1,982
2,116
1,984
1,935
1,996
Duodenum
1,696
1,705
1,767
1,818
1,873
1,892
2,056
1,883
1,716
1,708
Sampel (nm)
Jejenum Ileum
2,642
2,609
2,685
2,684
2,332
2,316
Sampel (nm)
Jejenum Ileum
1,689
1,652
1,759
1,715
1,836
1,765
1,871
1,803
1,893
1,823
1,918
1,846
2,002
1,982
1,813
1,844
1,780
1,831
1,750
1,699
Colon
2,616
2,645
2,255
Colon
1,695
1,727
1,770
1,838
1,879
1,883
1,998
1,724
1,542
1,529
Aktivitas enzim (U/ml)
Duodenum Jejenum
Ileum
3,354
2,6460
2,4803
4,3482
3,9247
3,9176
2,1523
1,6568
1,5329
Colon
2,5154
3,0353
3,0353
Aktivitas enzim (U/ml)
Duodenum Jejenum
Ileum
0,668
0,654
0,585
0,764
0,868
0,783
0,836
0,954
0,833
0,976
1,072
0,948
1,012
1,048
0,924
1,026
1,076
0,937
1,120
1,048
1,021
1,015
0,887
0,944
0,796
0,914
1,008
0,727
0,796
0,712
Colon
0,666
0,806
0,841
1,012
1,023
1,008
1,042
0,724
0,474
0,432
Pengaruh ion logam
ion
NaCl
Cacl2
MgCl2
KCl
Kontrol
Blanko
(nm)
Standar
(nm)
0,095
0,064
0,097
0,071
0,114
0,313
0,239
0,325
0,321
0,531
Duedenum
0,164
0,068
0,101
0,148
0,256
Sampel (nm)
Jejenum Ileum
0,134 0,153
0,066 0,073
0,102 0,098
0,141 0,132
0,235 0,243
Colon
0,132
0,069
0,104
0,112
0,202
Aktivitas enzim (U/ml)
Duedenum Jejenum
0,0317
0,0179
0,0023
0,0011
0,0018
0,0022
0,0308
0,0280
0,0341
0,0290
Ileum
0,0266
0,0051
0,0004
0,0244
0,0309
Colon
0,0170
0,0029
0,0031
0,0164
0,0211
Lampiran 8 Pembuatan kurva standar SDS-PAGE.
BM (KDa)
203
118
86
51,6
34,1
29
19,2
Standar
Log
BM
2,3075
2,0719
1,9345
1,7126
1,5327
1,4624
1,2833
Sampel
Rf
(cm)
0,0794
0,1508
0,2143
0,3809
0,5714
0,6984
0,9127
Rf (Cm)
0,1666
0,2381
0,3190
0,3238
0,4603
0,6666
0,9841
Log BM
1,8231
1,7605
1,6897
1,6855
1,5659
1,3853
1,1073
BM
66,54
57,61
48,94
48,47
36,80
24,28
12,80
2,5
Log BM
2
1,5
y = -1,142x + 2,2486
R2 = 0,9404
1
0,5
0
0
0,2
0,4
0,6
Rf (cm)
0,8
1