3 metodologi - IPB Repository

8
3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan April sampai Juni 2012 dan bertempat
di unit pengolahan tradisional Teluk Petai, Kampar, Riau, Laboratorium
Mikrobiologi Hasil Perairan, Laboratorium Pengetahuan Bahan Baku Hasil
Perairan serta Laboratorium Pengolahan Pangan Ilmu dan Teknologi Pangan
Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan selais asap
(Ompok hypophthalmus) yang berasal dari Teluk Petai, Kampar, Riau. Bahan
kimia yang digunakan untuk analisis TVB antara lain larutan asam borat 2%,
larutan asam klorida (HCl) 0,02 N, larutan asam trikloroasetat (TCA) 7%, larutan
kalium karbonat (K2CO3) jenuh (1:1). Bahan-bahan untuk uji mikrobiologi antara
lain Lactose Broth, plate count agar (PCA), garam fisiologis, dan aquades.
Bahan-bahan untuk analisis proksimat antara lain aquades, HCl, NaOH, katalis
selenium, H2SO4, H3BO3, dan pelarut heksana.
Alat-alat yang digunakan yaitu plastik, aluminium foil, tissue,
kantung
plastik, pisau, talenan, cawan porselen, tabung Kjeldahl, kapas bebas lemak,
tabung soxhlet, timbangan analitik, homogenizer, Aw-meter, erlenmeyer 250 ml,
corong, kertas saring, gelas ukur, pipet volumetrik, mikro pipet, tip,
cawan
Conway beserta tutupnya, inkubator, desikator, oven, tabung durham, cawan petri,
tabung reaksi, kulkas, vortex, rak tabung reaksi, sudip, alu dan mortar.
3.3 Prosedur Kerja
Penelitian ini dilakukan untuk mengkaji dan mempelajari keadaan sanitasi
pengolahan ikan selais asap (O. hypophthalmus) serta mutunya yang dilakukan
dengan wawancara, pengamatan terhadap pengaruh penyimpanan ikan asap pada
suhu dingin dan analisis mutu ikan asap selais. Analisis mutu terdiri dari uji
organoleptik, uji fisik, uji kimia, dan uji mikrobiologi. Uji fisik meliputi uji
aktivitas air (aw), uji kimia meliputi uji Total Volatile Base (TVB) dan proksimat.
9
Uji mikrobiologi meliputi uji TPC (total plate count) dan, Escherechia coli. Ikan
selais asap kemudian dikemas menggunakan plastik HDPE non vakum dan
disimpan pada suhu dingin selama 20 hari. Uji TPC, aw dan TVB dilakukan setiap
5 hari selama penyimpanan, sedangkan uji proksimat dilakukan pada awal.
Prosedur penelitian disajikan pada Gambar 2.
Ikan selais asap
Wawancara dan
observasi
Analisis mutu dan penyimpanan
(suhu ruang dan kulkas) produk
ikan selaisasap
-
Uji organoleptik
Analisis proksimat
Kadar TVB
Uji TPC
Uji bakteri E. Coli*
Uji aw**
Gambar 2 Diagram alir proses uji dalam penelitian ikan asap.
*analisis mutu ikan selais asap; **analisis penyimpanan ikan selais asap
3.4 Pengambilan Sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel ikan selais kering
yang berasal dari tiga pasar tradisional yang berbeda di Pekan baru, Riau. Sampel
yang digunakan dipisahkan dalam beberapa kemasan untuk dianalisis mutunya,
terdiri dari uji organoleptik, uji fisik, uji kimia, dan uji mikrobiologi.
10
3.4.1 Analisis proksimat
a) Analisis kadar air (AOAC 2005)
Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah
mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 oC selama 30 menit.
Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 30 menit) dan
ditimbang hingga beratnya konstan. Cawan dimasukkan ke dalam oven dengan
suhu 105 oC selama 6 jam. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator
kemudian ditimbang.
Perhitungan kadar air:
% kadar air =
Keterangan:
x 100%
A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat cawan dengan sampel (gram)
C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (gram)
b) Analisis kadar abu (AOAC 2005)
Analisis kadar abu dilakukan untuk mengetahui jumlah abu yang terdapat
pada suatu bahan terkait dengan mineral dan bahan yang dianalisis. Cawan
porselen dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven bersuhu sekitar 105 oC
selama 30 menit. Cawan abu porselen tersebut dimasukkan ke dalam desikator
(30 menit) dan kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 5 gram ditimbang
kemudian dimasukkan ke dalam cawan abu porselen, kemudian dibakar di atas
kompor listrik sampai tidak berasap dan dimasukkan ke dalam tanur pengabuan
dengan suhu 600 oC selama 6 jam.
Cawan dimasukkan ke dalam desikator
kemudian ditimbang.
Perhitungan kadar abu ikan selais:
Keterangan:
A=
Berat cawan abu porselen kosong (gram)
B=
Berat cawan abu porselen dengan sampel (gram)
C=
Berat
cawan abu porselen dengan sampel
dikeringkan (gram)
setelah
11
c) Analisis kadar lemak (AOAC 2005)
Sampel seberat 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan
dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu
lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan
tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung
soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Pelarut lemak yang ada dalam labu
lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap.
Pada saat destilasi
pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak
kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven
pada suhu
105 oC, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya
konstan (W3).
Kadar lemak ditentukan dengan rumus :
Keterangan : W1 = Berat sampel (gram)
W2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram)
W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram)
d) Analisis kadar protein (AOAC 1980)
Prinsip dari analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar
(crude protein) pada suatu bahan. Tahapan yang dilakukan dalam analisis protein
terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi.
1. Tahap destruksi
Sampel ditimbang seberat 1 gram. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam
labu kjeldahl. Setengah butir selenium dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan
ditambahkan 10 mL H2SO4. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke
dalam alat pemanas dengan suhu 410 oC. Proses destruksi dilakukan sampai
larutan menjadi hijau jernih.
2. Tahap destilasi
Larutan yang telah jernih didinginkan dan kemudian ditambahkan 10 ml
akuades dan 10 mL NaOH 40%, lalu didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam
erlenmeyer 125 mL yang berisi 25 mL asam borat (H3BO3) 4% . Hasil destilat
berwarna hijau kebiruan.
12
3. Tahap titrasi
Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1013 N sampai warna larutan
pada erlenmeyer berubah warna menjadi merah muda. Volume titran dibaca dan
dicatat. Perhitungan kadar protein pada ubur-ubur adalah sebagai berikut:
% Kadar Protein = % nitrogen x faktor konversi (6,25)
3.4.2 Uji organoleptik (SNI 2346)
Metode yang digunakan untuk uji organoleptik ikan asap berdasarkan SNI
2346 tentang petunjuk pengujian organoleptik atau sensori pada produk
perikanan. Metode ini menggunakan angka yang berkisar antara 1 sampai 9
dengan penilaian dalam bentuk produk ikan asap. Pengukuran organoleptik
merupakan cara penilaian mutu ikan selais asap yang bersifat subyektif dengan
mengunakan indera manusia.
3.4.3 Uji kimia
Pengujian kimia dilakukan untuk mengetahui karakteristik kimia ikan asap
yang meliputi uji TVB. Pengujian TVB dilakukan dengan cara penimbangan
sampel sebanyak 15 gram, kemudian ditambahkan 45 mL TCA 7%
dan
dihomogenkan, lalu disaring dengan kertas saring dan ditampung dalam
erlenmeyer. Selanjutnya diambil 1 mL ekstrak dimasukkan ke dalam cekungan
luar pinggir kiri dari cawan Conway, dipipet sebanyak 1 mL K2CO3 dan
dimasukkan ke dalam cekungan luar pinggir kanan. Asam borat sebanyak 1 ml
dipipet dan dimasukkan ke dalam cekungan tengah cawan Conway, kemudian
cawan ditutup, sedikit digoyangkan untuk mencampur ketiga larutan tersebut.
Setelah selesai diinkubasi lebih kurang selama 1 jam, kemudian dilakukan titrasi
larutan borat pada bagian dalam (inner chamber) cawan Conway blanko dengan
larutan HCl 0,01 N sehingga warna larutan asam borat berubah menjadi merah
muda, selanjutnya berturut-turut titrasi larutan asam borat pada cawan Conway
contoh sampai diperoleh warna merah yang sama dengan blanko. Perhitungan
nilai TVB dapat dihitung dengan rumus:
13
Keterangan :
i
= Volume titrasi sampel (mL)
j
= mL titrasi HCl blanko
Fp
= faktor pengenceran
3.4.4 Uji mirobiologi
Uji mikrobiologi dilakukan untuk mengetahui cemaran biologis pada ikan
asap selais. Uji mikrobiologi terdiri dari pengujian TPC dan bakteri E. coli.
(1) Pengujian total plate count (TPC) atau penentuan angka lempeng total
(ALT) pada produk perikanan (SNI 01-2332.3-2006)
a) Preparasi Contoh
Sampel diambil secara acak dan dipotong kecil-kecil hingga beratnya
10 gram, kemudian dimasukkan ke dalam wadah atau aluminium foil.
Selanjutnya dimasukkan ke dalam larutan garam fisiologis 90 mL dan
dihomogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran
10-1, kemudian dengan pipet steril diambil 1 mL homogenat di atas dan
dimasukkan ke dalam 9 mL larutan garam fisiologis untuk mendapatkan
pengenceran 10-2. Pengenceran selanjutanya (10-3), dilakukan dengan mengambil
sampel dari pengenceran 10-2 dimasukkan ke dalam 9 mL larutan garam
fisiologis. Pada setiap pemindahan 1 mL bahan kemudian di vortex. Selanjutnya
dilakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-4, 10-5 dan seterusnya sesuai
kondisi sampel.
b) Metode agar tuang (pour plate method)
Sampel yang telah diencerkan 10-1, 10-2 dan seterusnya, dipipet masingmasing 1 mL dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Prosedur tersebut
dilakukan secara duplo untuk setiap pengenceran. Media plate count agar (PCA)
yang telah didinginkan dalam waterbath hingga mencapai suhu 45 oC, dituangkan
sebanyak 12-15 mL ke dalam masing-masing cawan yang sudah berisi sampel.
Cawan yang telah berisi sampel dan media PCA digerakkan ke depan ke belakang
ke kiri dan ke kanan supaya tercampur sempurna. Setelah agar menjadi padat,
14
untuk menentukan mikroorganisme aerob cawan-cawan tersebut diinkubasi dalam
posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 31 oC. Pengenceran
yang digunakan dicatat dan dilakukan penghitungan jumlah total koloni. Jumlah
koloni bakteri yang dihitung adalah cawan petri yang mengandung koloni bakteri
antara 30 koloni-300 koloni.
(2) Pengujian bakteri E. coli (SNI 01-2331.1-2006)
Pengujian bakteri E. coli dilakukan dalam beberapa tahap. Tahap uji tersebut
adalah uji pendugaan, uji penegasan, uji morfologi, dan uji biokimia.
a) Tahap analisis
Pengenceran 10-2 disiapkan dengan cara melarutkan 1 mL larutan 10-1 ke
dalam 9 mL larutan pengencer garam fisiologis. Pengenceran selanjutnya
dilakukan sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh.
Pada setiap
pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Sebanayak 1 mL larutan
dipindahkan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri atau 5 seri tabung Lauryl
Tryptose Broth (LTB) yang berisi tabung Durham.
Tabung-tabung tersebut
diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 oC. Selanjutnya diperhatikan gas yang
terbentuk setelah inkubasi selama 24 jam dan diinkubasi kembali tabung-tabung
negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam
tabung durham.
b) Uji pendugaan E. coli
Setiap tabung LTB yang positif diinokulasi dengan jarum ose ke tabungtabung yang berisi larutan EC Broth dan tabung durham. Selanjutnya tabungtabung tersebut diinkubasi dalam waterbath sirculation selama 48 jam pada suhu
45 oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi
dari cairan yang ada dalam tabung yang diinkubasi. Tabung-tabung tersebut
diperiksa setelah 24 jam diinkubasi, untuk menguji timbulnya gas. Apabila tidak
menghasilkan gas atau negatif, diinkubasi kembali selama 48 jam. Tabung yang
positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Selanjutnya
ditentukan nilai Angka Paling Memungkinkan (APM) berdasarkan tabung-tabung
EC yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM).
Nilainya dinyatakan sebagai (APM/g faecal coliform).
15
c) Uji penegasan E. coli (confirmed E. coli)
Tabung-tabung EC Broth positif diambil dan digoreskan ke LEMB agar
dengan menggunakan jarum ose, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu
35 oC. Koloni E. coli akan memberikan ciri yang khas, yaitu terdapat warna hitam
pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik. Beberapa koloni (typical)
Escherichia colidiambil dari masing-masing cawan LEMB dan digoreskan ke
media PCA miring dengan jarum tanam, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 35 oC. Jika tidak ada koloni yang khas (typical), pindahkan satu atau lebih
koloni yang tidak khas (typical) E. coli ke media PCA miring.
d) Uji morfologi
Prosedur uji morfologi dilakukan dengan pewarnaan gram dari setiap koloni
Escherichia coli terduga. Biakan diambil dari PCA yang telah diinkubasi selama
24 jam. Dengan menggunakan mikroskop, bakteri E. coli termasuk bakteri gram
negatif, berbentuk batang pendek atau coccus.
e) Uji biokimia
1. Produk indol (I)
Sebanyak satu ose E. coli dari PCA miring yang diduga positif diambil dan
dilakukan inokulasi ke dalam tryptone Broth serta diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 35 oC. Uji Indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 mL- 0,3 mL pereaksi
kovacs. Reaksi menunjukkan positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan
bagian atas media dan negatif jika terbentuk cincin warna kuning.
2. Uji voges proskauer (VP)
Sebanyak satu ose koloni E. coli dari PCA miring yang diduga positif diambil
dan dilakukan inokulasi ke dalam MRVP Broth serta diinkubasi selama 48 jam
pada suhu 35 oC, dipindahkan 1 ml dari setiap MRVP Broth yang tumbuh ke
tabung reaksi ukuran 13 mm
100 mm steril dan ditambahkan 0,6 mL larutan
alpha naphtol dan 0,2 mL 40% KOH, dan dikocok. Untuk mempercepat reaksi
ditambahkan sedikit Kristal keratin. Selanjutnya dikocok kembali dan didiamkan
selama 2 jam. Reaksi menunjukkan positif jika terbentuk warna merah muda eosin
sampai merah mirah delima (ruby)
16
3. Uji methyl red (MR)
Media MRVP Broth di atas diinkubasi kembali selama 48 jam pada suhu
o
35 C. Selanjutnya ditambahkan 5 tetes indikator methyl red pada setiap MRVP
Broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna
kuning.
4. Uji sitrat (C)
Sebanyak satu ose dari PCA miring digoreskan ke permukaan simmon citrate
agar, kemudian diinkubasi selama 96 jam pada suhu 35 oC. Reaksi positif jika
terjadi pertumbuhan dan media berubah menjadi warna biru, reaksi negatif jika
tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.
5. Produksi gas dari laktosa
Sebanyak satu ose dari PCA miring diinokulasikan ke dalam LTB, dan
diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 35 oC. Reaksi positif jika menghasilkan
gas pada tabung durham. Interpetasi hasil pengujian E. coli disajikan pada Tabel
2.
Tabel 2 Interpetasi hasil pengujian bakteri E. coli (SNI 01-2332.1-2006)
Kriteia
Biotipe 1
Biotipe 2
Gas pada tabung LTB
+
+
Indol
+
-
MR
+
+
VP
-
-
Citrate
-
-
Uji morfologi
Gram negatif, bentuk batang
Gram negatif, bentuk batang
pendek berspora
pendek tidak berspora
3.5 Penentuan Aktivitas Air (aw)
Sampel sebanyak 2-5 gram ditumbuk sampai halus, dimasukkan ke dalam
plastik kemudian dimasukkan ke dalam a w meter untuk pengukuran nilai aw.
Sebelum dilakukan pengukuran aw meter distandarisasi dengan NaCl, Mg(NO3)2
dan BaCl2 masing-masing selama 30 menit, kemudian dilakukan pengukuran aw
masing-masing sampel selama 15 menit.
17
3.6 Analisis Data
Data dianalisis menggunakan analisis statistik menggunakan rancangan acak
lengkap. Data disajikan dalam bentuk histogram, tabel atau gambar kemudian
diiterpretasikan.