ISOLASI DAN KARAKTERISASI FRAGMEN cDNA
advertisement
ISOLASI DAN KARAKTERISASI FRAGMEN cDNA DARI GEN PENYANDI METALLOTHIONEIN DARI KEDELAI KULTIVAR SLAMET YASSIER ANWAR SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008 SURAT PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul: Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari METALLOTHIONEIN Tipe 2 dari Kedelai Kultivar Slamet Gen Penyandi adalah karya saya sendiri yang diarahkan oleh Komisi Pembimbing dan belum pernah dipublikasikan oleh siapapun. Sumber data dan informasi yang dikutip dalam tesis ini telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Oleh karena itu, semua isi tesis ini dapat dipertanggung jawabkan kebenarannya. ABSTRACT YASSIER ANWAR. Isolation and characterization of cDNA fragment of gene encoding metallothionein type 2 from Glycine max L. cv. Slamet under direction of SUHARSONO, UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO. Metallothionein (MT) has a capability to bind the metal ion. Therefore it has an important role in the detoxification of this ion, including aluminum (Al). This protein has a low molecular weight and contains cysteine-rich residue. The objective of this research is to isolate and characterize the fragment of cDNA encoding MT type 2 (Mt2) from Glycine max L. (GmMt2). To isolate the cDNA fragment of GmMt2, we started with total RNA isolation. We had successfully isolated total RNA. Total cDNA had been synthesized with using the total RNA as template by reverse transcription. By PCR technique, the cDNA fragment of GmMt2 had been successfully isolated with using total cDNA as template and specific primers of Mt2 designed from Arabidopsis thaliana (AtMt2)(Acc. EM_PL:AY037263). The GmMt2 fragment was succesfully inserted into pGEM®–T Easy plasmid, then the recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli DH5α. Sequence analysis showed that the lenght of PCR-isolated GmMt2 fragment is 257 bp containing 246 bp open reading frame encoding for 81 amino acids. Enzym restriction sites analysis showed that GmMt2 fragment does not contain the restriction sites found in the multi cloning sites of pGEM®–T Easy. Nucleotide and amino acid alignment analysis using BLAST program showed that GmMt2 fragment is similar with complete cDNA of AtMt2A (Acc. NM_111773). Key words : Glycine max L., metallothionein, cysteine, cDNA RINGKASAN YASSIER ANWAR. Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen Penyandi metallothionein Tipe 2 dari Kedelai Kultivar Slamet. Dibimbing oleh SUHARSONO, UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO. Metallothionein merupakan protein yang mengandung banyak asam amino sistein, memiliki berat molekul yang rendah serta memiliki kemampuan dalam mengikat dan mengkoordinasi atom-atom logam. Oleh karena itu, MT mempunyai peranan yang penting dalam mendetoksifikasi ion logam, termasuk aluminium (Al). MT telah ditemukan pada berbagai macam organisme termasuk tanaman, mamalia, cendawan dan beberapa spesies dari prokariot. Penelitian ini tujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi fragmen cDNA dari gen yang menyandikan MT tipe 2 dari kedelai kultivar Slamet (GmMt2). Isolasi fragmen cDNA Mt2 Glycine max L. (GmMt2), diawali dengan isolasi RNA total. Dengan transkripsi balik, cDNA total berhasil disintesis dari RNA total sebagai cetakan. cDNA total hasil sintesis diuji kemurniannya dari kontaminasi genom dengan PCR menggunakan primer spesifik untuk cDNA ekson1-ekson2 dari aktin. Dengan PCR, fragmen cDNA GmMt2 telah berhasil diisolasi dengan menggunakan cDNA total sebagai cetakan dan primer spesifik Mt2 yaitu MF dan M7R yang dirancang dari Arabidopsis thaliana (AtMt2) (nomor akses EM_PL:AY037263). Fragmen GmMt2 berhasil disisipkan ke dalam plasmid pGEM-T Easy, kemudian plasmid rekombinan ini diintroduksikan ke dalam Escherichia coli DH5α. Analisis cDNA sisipan didalam plasmid rekombinan dilakukan melalui pemotongan dengan EcoRI. Pengurutan fragmen GmMt2 dilakukan untuk analisis dan karakterisasi sekuen. Analisis sekuen menunjukkan bahwa panjang fragmen GmMt2 yang diisolasi dengan PCR adalah 257 pb, mengandung 246 pb open reading frame dan menyandikan 81 asam amino dengan 14 asam amino cysteine (Cys). GmMt2 memiliki berat molekul 8,2 kDA. GmMt2 mengandung cDNA lengkap yang mengandung kodon awal sampai kodon akhir dari Mt2. Analisis penyejajaran urutan nukleotida dan asam amino yang menggunakan program BLAST, menunjukkan bahwa fragmen GmMt2 sama dengan cDNA utuh dari AtMt2A (nomor akses NM_111773). Hasil deduksi asam amino dari fragmen GmMt2 memperlihatkan bahwa motif urutan asam amino Cys dari GmMT2 terdiri dari Cys-Cys (residu 3-4), Cys-X-Cys (8-10, 14-16, 67-69, 73-75, 78-80) dan Cys-X-X-Cys (20-23). Analisis situs restriksi pada fragmen GmMt2 menunjukkan bahwa fragmen tersebut tidak mengandung situs pemotongan enzim restriksi endonuklease yang terdapat pada situs pengklonan (MCS = multi cloning sites) dari pGEM®–T Easy. Semua situs restriksi yang terdapat pada MCS pGEM®–T Easy dapat digunakan untuk mengisolasi sisipan GmMt2. Berdasarkan kesamaan urutan nukleotida Mt2, GmMt2 sama dengan AtMt2A dari Arabidopsis thaliana. Kesamaan antara GmMt2 dengan AtMt2A dapat mengindikasikan kesamaan peran. Berdasarkan kesamaan urutan nukleotida Mt2, GmMt2 sama dengan AtMt2A dari Arabidopsis thaliana. Kesamaan antara GmMt2 dengan AtMt2A dapat mengindikasikan kesamaan peran. GmMT2 mempunyai fungsi yang sama dengan AtMT2A yaitu berperan dalam pengikatan dan detoksifikasi logam dan membatasi kerusakan oksidatif. Analisis domain berdasarkan analisis kesejajaran asam amino GmMT2 dari berbagai spesies tanaman, fragmen GmMT2 memiliki 33 residu yang secara umum sejajar dengan domain MT tanaman, famili MT kelompok ke-15 (MT2_15p). GmMT2 memiliki 81 residu yang sama dengan domain dari subfamili MT kelompok tanaman yaitu MT tipe 2. Kata kunci : Glycine max L., metallothionein, sistein, cDNA @ Hak Cipta milik IPB, tahun 2008 Hak Cipta dilindungi Undang-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebut sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB ISOLASI DAN KARAKTERISASI FRAGMEN cDNA DARI GEN PENYANDI METALLOTHIONEIN TIPE 2 DARI KEDELAI KULTIVAR SLAMET YASSIER ANWAR Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008 Judul Penelitian : Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen Penyandi metallothionein Tipe 2 dari Kedelai Kultivar Slamet Nama Mahasiswa : Yassier Anwar Nomor Pokok : P055040011 Program Studi : Bioteknologi Menyetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. Suharsono, DEA Ketua Dr. Ir. Utut Widyastuti S, M.Si Anggota Diketahui Ketua Program Studi Bioteknologi Dr. Ir. Muhammad Jusuf, DEA Tanggal ujian : 28 Juli 2008 Dekan Sekolah Pascasarjana Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS Tanggal lulus: PRAKATA Segala puji penulis panjatkan kepada Allah Subhanaahu Wa Ta’alaa atas limpahan berkat dan rahmat-Nya yang tiada terhingga sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini. Shalawat dan salam disampaikan kepada Rasulullah Muhammad SAW atas keteladanannya. Terima kasih penulis sampaikan kepada dan yang telah membimbing dengan sabar dan penuh perhatian dalam penelitian ini. Terima kasih kepada Dr. Ir. Suharsono, DEA dan Dr. Ir. Utut Widyastuti S, M.Si selaku pembimbing yang telah meluangkan waktu didalam memberi bimbingan, nasehat dan ilmu yang sangat berharga bagi penulis. Terima kasih kepada Dr. Ir.Miftahuddin, M.Si selaku penguji tesis yang telah memberikan saran dan masukannya. Terima kasih kepada Dr. Ir.Muhammad Jusuf, DEA selaku ketua Program Studi Bioteknologi SPs IPB. Terima kasih kepada Proyek Hibah Penelitian Tim Pascasarjana (HPTP) batch III atas nama Dr. Ir. Suharsono, DEA, yang telah membiayai penelitian ini. Terima kasih kepada Laboratorium BIORIN dan BMST PPSHB IPB yang telah menyediakan fasilitas dalam pelaksanaan penelitian dan juga kepada Pak Mulya serta Mbak Pepi atas kerjasama dan bantuannya. Terima kasih yang tak terhingga penulis sampaikan kepada Ayahanda (Alm) Anwar Kasim, Ibunda (Almh) Rasmiwati Amin, Adinda (Almh) Maisarah, (Almh) Siti Rahmah dan (Alm) Kautsar yang telah menjadi inspirator bagi penulis untuk menyelesaikan cita-cita ini. Kepada Ayahanda (Alm) M. Jusuf, Ibunda Badrulaili, serta Istri Intan Keumala Sary dan Ananda Muhammad Fathul Islam atas doa, kesabaran, pengertian, pengorbanan dan kasih sayangnya. Terima kasih juga kepada yang selalu memberi motivasi dan kerjasamanya bagi penulis selama menempuh studi. Rekan-rekan sejati dan seperjuangan di Laboratorium BIORIN dan BMST PPSHB IPB: Pak Muzuni, Mas Firda, Mbak Laela Sari, Rina Kurnianingsih, Bu Sri Listyowati, Niken, Ulfa, Pak Ulung, Bu Hanum, Bu Ratna, Pak Ali, Mashuda, Rizki Amelia Lubis, Agustina Senjayani, Siti Mutti Sawitri, Widyartini, Pak Hadi Sunarso, Mas Neo, Yasinta Ratna Wulandari, Bahrelfi, Budi Hebat, Ammay, Popi, T. Dian Fauziah, Lulut, Hakiim, Jaya, Nindia, Zahro, Dona, teman-teman BTK ‘04 dan semua pihak yang telah banyak membantu. Sebagai penutup, semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan. Bogor, Agustus 2008 Yassier Anwar RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Meuredu, Aceh Pidie pada tanggal 27 Juni 1979 sebagai anak pertama dari pasangan (Alm) Anwar Kasim dan (Almh) Rasmiwati. Saat ini penulis telah menikah dengan Intan Keumala Sary dan memiliki putra Muhammad Fathul Islam. Penulis menyelesaikan studi di Jurusan Agronomi, FAPERTA, Universitas Syiah Kuala Banda Aceh tahun 2004. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi S2 pada program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana IPB Bogor.