ISOLASI DAN KARAKTERISASI FRAGMEN cDNA

ISOLASI DAN KARAKTERISASI FRAGMEN cDNA
DARI GEN PENYANDI METALLOTHIONEIN
DARI KEDELAI KULTIVAR SLAMET
YASSIER ANWAR
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul:
Isolasi
dan
Karakterisasi
Fragmen
cDNA
dari
METALLOTHIONEIN Tipe 2 dari Kedelai Kultivar Slamet
Gen
Penyandi
adalah karya saya sendiri yang diarahkan oleh Komisi Pembimbing dan belum pernah
dipublikasikan oleh siapapun. Sumber data dan informasi yang dikutip dalam tesis ini
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis
ini. Oleh karena itu, semua isi tesis ini dapat dipertanggung jawabkan kebenarannya.
ABSTRACT
YASSIER ANWAR. Isolation and characterization of cDNA fragment of gene
encoding metallothionein type 2 from Glycine max L. cv. Slamet under direction of
SUHARSONO, UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.
Metallothionein (MT) has a capability to bind the metal ion. Therefore it has an
important role in the detoxification of this ion, including aluminum (Al). This protein has a
low molecular weight and contains cysteine-rich residue. The objective of this research is to
isolate and characterize the fragment of cDNA encoding MT type 2 (Mt2) from Glycine
max L. (GmMt2). To isolate the cDNA fragment of GmMt2, we started with total RNA
isolation. We had successfully isolated total RNA. Total cDNA had been synthesized with
using the total RNA as template by reverse transcription. By PCR technique, the cDNA fragment
of GmMt2 had been successfully isolated with using total cDNA as template and specific primers
of Mt2 designed from Arabidopsis thaliana (AtMt2)(Acc. EM_PL:AY037263). The
GmMt2 fragment was succesfully inserted into pGEM®–T Easy plasmid, then the recombinant
plasmid was introduced into Escherichia coli DH5α. Sequence analysis showed that the lenght
of PCR-isolated GmMt2 fragment is 257 bp containing 246 bp open reading frame encoding
for 81 amino acids. Enzym restriction sites analysis showed that GmMt2 fragment does not
contain the restriction sites found in the multi cloning sites of pGEM®–T Easy. Nucleotide and
amino acid alignment analysis using BLAST program showed that GmMt2 fragment is
similar with complete cDNA of AtMt2A (Acc. NM_111773).
Key words : Glycine max L., metallothionein, cysteine, cDNA
RINGKASAN
YASSIER ANWAR. Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen Penyandi
metallothionein Tipe 2 dari Kedelai Kultivar Slamet. Dibimbing oleh SUHARSONO,
UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.
Metallothionein merupakan protein yang mengandung banyak asam amino sistein,
memiliki berat molekul yang rendah serta memiliki kemampuan dalam mengikat dan
mengkoordinasi atom-atom logam. Oleh karena itu, MT mempunyai peranan yang penting
dalam mendetoksifikasi ion logam, termasuk aluminium (Al). MT telah ditemukan pada
berbagai macam organisme termasuk tanaman, mamalia, cendawan dan beberapa spesies
dari prokariot. Penelitian ini tujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi fragmen
cDNA dari gen yang menyandikan MT tipe 2 dari kedelai kultivar Slamet (GmMt2).
Isolasi fragmen cDNA Mt2 Glycine max L. (GmMt2), diawali dengan isolasi RNA
total. Dengan transkripsi balik, cDNA total berhasil disintesis dari RNA total sebagai
cetakan. cDNA total hasil sintesis diuji kemurniannya dari kontaminasi genom dengan
PCR menggunakan primer spesifik untuk cDNA ekson1-ekson2 dari aktin.
Dengan PCR, fragmen cDNA GmMt2 telah berhasil diisolasi dengan menggunakan
cDNA total sebagai cetakan dan primer spesifik Mt2 yaitu MF dan M7R yang dirancang
dari Arabidopsis thaliana (AtMt2) (nomor akses EM_PL:AY037263). Fragmen GmMt2
berhasil disisipkan ke dalam plasmid pGEM-T Easy, kemudian plasmid rekombinan ini
diintroduksikan ke dalam Escherichia coli DH5α. Analisis cDNA sisipan didalam
plasmid rekombinan dilakukan melalui pemotongan dengan EcoRI.
Pengurutan fragmen GmMt2 dilakukan untuk analisis dan karakterisasi sekuen.
Analisis sekuen menunjukkan bahwa panjang fragmen GmMt2 yang diisolasi dengan
PCR adalah 257 pb, mengandung 246 pb open reading frame dan menyandikan 81 asam
amino dengan 14 asam amino cysteine (Cys). GmMt2 memiliki berat molekul 8,2 kDA.
GmMt2 mengandung cDNA lengkap yang mengandung kodon awal sampai kodon akhir
dari Mt2. Analisis penyejajaran urutan nukleotida dan asam amino yang menggunakan
program BLAST, menunjukkan bahwa fragmen GmMt2 sama dengan cDNA utuh dari
AtMt2A (nomor akses NM_111773). Hasil deduksi asam amino dari fragmen GmMt2
memperlihatkan bahwa motif urutan asam amino Cys dari GmMT2 terdiri dari Cys-Cys
(residu 3-4), Cys-X-Cys (8-10, 14-16, 67-69, 73-75, 78-80) dan Cys-X-X-Cys (20-23).
Analisis situs restriksi pada fragmen GmMt2 menunjukkan bahwa fragmen
tersebut tidak mengandung situs pemotongan enzim restriksi endonuklease yang terdapat
pada situs pengklonan (MCS = multi cloning sites) dari pGEM®–T Easy. Semua situs
restriksi yang terdapat pada MCS pGEM®–T Easy dapat digunakan untuk mengisolasi
sisipan GmMt2.
Berdasarkan kesamaan urutan nukleotida Mt2, GmMt2 sama dengan AtMt2A dari
Arabidopsis thaliana. Kesamaan antara GmMt2 dengan AtMt2A dapat mengindikasikan
kesamaan peran. Berdasarkan kesamaan urutan nukleotida Mt2, GmMt2 sama dengan
AtMt2A dari Arabidopsis thaliana. Kesamaan antara GmMt2 dengan AtMt2A dapat
mengindikasikan kesamaan peran. GmMT2 mempunyai fungsi yang sama dengan
AtMT2A yaitu berperan dalam pengikatan dan detoksifikasi logam dan membatasi
kerusakan oksidatif.
Analisis domain berdasarkan analisis kesejajaran asam amino GmMT2 dari
berbagai spesies tanaman, fragmen GmMT2 memiliki 33 residu yang secara umum
sejajar dengan domain MT tanaman, famili MT kelompok ke-15 (MT2_15p). GmMT2
memiliki 81 residu yang sama dengan domain dari subfamili MT kelompok tanaman
yaitu MT tipe 2.
Kata kunci : Glycine max L., metallothionein, sistein, cDNA
@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2008
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebut sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh
karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
ISOLASI DAN KARAKTERISASI FRAGMEN cDNA
DARI GEN PENYANDI METALLOTHIONEIN TIPE 2
DARI KEDELAI KULTIVAR SLAMET
YASSIER ANWAR
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul Penelitian
: Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen Penyandi
metallothionein Tipe 2 dari Kedelai Kultivar Slamet
Nama Mahasiswa : Yassier Anwar
Nomor Pokok
: P055040011
Program Studi
: Bioteknologi
Menyetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Suharsono, DEA
Ketua
Dr. Ir. Utut Widyastuti S, M.Si
Anggota
Diketahui
Ketua Program
Studi Bioteknologi
Dr. Ir. Muhammad Jusuf, DEA
Tanggal ujian : 28 Juli 2008
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS
Tanggal lulus:
PRAKATA
Segala puji penulis panjatkan kepada Allah Subhanaahu Wa Ta’alaa atas limpahan
berkat dan rahmat-Nya yang tiada terhingga sehingga penulis dapat menyelesaikan
penelitian dan penulisan tesis ini. Shalawat dan salam disampaikan kepada Rasulullah
Muhammad SAW atas keteladanannya.
Terima kasih penulis sampaikan kepada dan yang telah membimbing dengan sabar
dan penuh perhatian dalam penelitian ini. Terima kasih kepada Dr. Ir. Suharsono, DEA
dan Dr. Ir. Utut Widyastuti S, M.Si selaku pembimbing yang telah meluangkan waktu
didalam memberi bimbingan, nasehat dan ilmu yang sangat berharga bagi penulis.
Terima kasih kepada Dr. Ir.Miftahuddin, M.Si selaku penguji tesis yang telah
memberikan saran dan masukannya. Terima kasih kepada Dr. Ir.Muhammad Jusuf, DEA
selaku ketua Program Studi Bioteknologi SPs IPB.
Terima kasih kepada Proyek Hibah Penelitian Tim Pascasarjana (HPTP) batch III
atas nama Dr. Ir. Suharsono, DEA, yang telah membiayai penelitian ini. Terima kasih
kepada Laboratorium BIORIN dan BMST PPSHB IPB yang telah menyediakan fasilitas
dalam pelaksanaan penelitian dan juga kepada Pak Mulya serta Mbak Pepi atas
kerjasama dan bantuannya.
Terima kasih yang tak terhingga penulis sampaikan kepada Ayahanda (Alm)
Anwar Kasim, Ibunda (Almh) Rasmiwati Amin, Adinda (Almh) Maisarah, (Almh) Siti
Rahmah dan (Alm) Kautsar yang telah menjadi inspirator bagi penulis untuk
menyelesaikan cita-cita ini. Kepada Ayahanda (Alm) M. Jusuf, Ibunda Badrulaili, serta
Istri Intan Keumala Sary dan Ananda Muhammad Fathul Islam atas doa, kesabaran,
pengertian, pengorbanan dan kasih sayangnya.
Terima kasih juga kepada yang selalu memberi motivasi dan kerjasamanya bagi
penulis selama menempuh studi. Rekan-rekan sejati dan seperjuangan di Laboratorium
BIORIN dan BMST PPSHB IPB: Pak Muzuni, Mas Firda, Mbak Laela Sari, Rina
Kurnianingsih, Bu Sri Listyowati, Niken, Ulfa, Pak Ulung, Bu Hanum, Bu Ratna, Pak
Ali, Mashuda, Rizki Amelia Lubis, Agustina Senjayani, Siti Mutti Sawitri, Widyartini,
Pak Hadi Sunarso, Mas Neo, Yasinta Ratna Wulandari, Bahrelfi, Budi Hebat, Ammay,
Popi, T. Dian Fauziah, Lulut, Hakiim, Jaya, Nindia, Zahro, Dona, teman-teman BTK ‘04
dan semua pihak yang telah banyak membantu.
Sebagai penutup, semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi kemajuan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Agustus 2008
Yassier Anwar
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Meuredu, Aceh Pidie pada tanggal 27 Juni 1979 sebagai
anak pertama dari pasangan (Alm) Anwar Kasim dan (Almh) Rasmiwati. Saat ini
penulis telah menikah dengan Intan Keumala Sary dan memiliki putra Muhammad
Fathul Islam.
Penulis menyelesaikan studi di Jurusan Agronomi, FAPERTA, Universitas Syiah
Kuala Banda Aceh tahun 2004. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi S2
pada program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana IPB Bogor.