identifikasi keberadaan gen nitrilase dalam sampel

2
primer spesifik yang dirancang berdasarkan
sekuen gen yang terdapat pada bank gen.
Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat
memberikan
informasi
mengenai
metagenomik sebagai metode deteksi gen
penyandi nitrilase yang relatif cepat dan
akurat. Selanjutnya gen nitrilase tersebut
dapat dimanfaatkan sebagai biokatalis melalui
konstruksi rekombinan untuk produksi
senyawa obat enansiomer tunggal.
TINJAUAN PUSTAKA
Senyawa Nitril
Senyawa-senyawa nitril organik tersebar
secara luas di alam. Berbagai senyawa ini
telah didalilkan sebagai senyawa-senyawa
yang memiliki peran kunci dalam kimia
prebiotik yang
menyebabkan terjadinya
evolusi makromolekul biologis dan kehidupan
primitif (Commeyras et al. 2004). Nitril
merupakan asam karboksilat yang memiliki
gugus sianida (R-CN). Gugus siano dari nitril
sangat polar, gugus ini dapat menjelaskan
kelarutan yang baik pada beberapa nitril di
dalam air dan sifat reaktif dari nitril tersebut
(Bunch 1998). Sebagian kecil nitril larut
dalam air, tetapi kelarutannya berkurang
bergantung panjang rantai atau adanya
struktur aromatik. Senyawa nitril (RCN)
tersebar luas di lingkungan, di alam nitril
terutama hadir sebagai sianoglikosida yang
diproduksi oleh tanaman dan hewan. Tanaman
juga memproduksi senyawa nitril yang lain
seperti sianolipid, risinin, dan fenilasetonitril.
Selain itu, nitril alami dapat ditemukan pada
minyak tulang, serangga dan mikroorganisme
seperti jamur, bakteri, spons, dan ganggang
(Gupta et al 2010).
Sebagian besar nitril merupakan senyawa
yang sangat toksik, mutagenik, dan
karsinogenik (Tinggang et al. 2007).
Umumnya toksisitas nitril pada manusia
diekspresikan sebagai penyakit gastritis dan
mual (muntah), iritasi bronkial, gangguan
respirasi,
dan
osteolathrysm
yang
menyebabkan kepincangan dan kelainan
skeletal (Kaul et al. 2007). Senyawa ini juga
dikenal sebagai salah satu penyebab
kerusakan lingkungan (Brandao & bull 2003).
Industri kimiawi menggunakan berbagai
senyawa nitril secara ekstensif untuk
memproduksi berbagai macam senyawa
kimia, seperti pelarut, bahan pada industri
plastik, karet sintetis, bahan pada industri
farmasi, herbisida, pertanian, penyepuhan
logam, dan senyawa-senyawa kimia penting
lainnya (Kaul et al. 2007).
Biotransformasi Senyawa Nitril
Biotransformasi merupakan konversi
kimia dari suatu senyawa organik menjadi
produk yang diinginkan dengan bantuan
enzim maupun sel hidup, yang mengandung
enzim yang diperlukan. Alasan penggunaan
biotransformasi,
yaitu
kemampuan
mikroorganisme, misalnya
bakteri untuk
menghasilkan sejumlah besar biomassa dan
berbagai macam enzim yang berbeda dalam
waktu singkat serta kemo-, regio-, dan
enantioselektivitas enzim. (Leresche & Meyer
2006).
Biotransformasi telah menarik perhatian
sebagai alternatif terhadap hidrolisis kimia
dalam proses kimia organik karena memiliki
beberapa keuntungan, seperti kondisi pH dan
temperatur reaksi yang tidak ekstrim, hasil
produk sampingan yang lebih sedikit jika
dibandingkan dengan proses hidrolisis
kimiawi secara konvensional, pembentukan
senyawa
kiral
cocok
untuk
biopharmaceuticals, serta kemampuannya
untuk mengurangi jumlah polusi lingkungan
(Luo et al. 2010; Yeom et al. 2008).
Degradasi mikrobial dari gugus nitril dapat
terjadi melaui dua jalur enzimatis, yaitu
dengan enzim nitrilase secara langsung atau
reaksi secara tidak langsung dengan nitril
hidratase dan amidase (Gambar 1). Nitrilase
berfungsi mengkatalisis pemotongan gugus
nitril secara langsung, sehingga menghasilkan
asam dan amonia, sementara itu nitril
hidratase mengkatalisis hidrasi nitril sehingga
menghasilkan gugus amida kemudian amida
ditransformasi menjadi asam karboksilat dan
amonia oleh amidase (Nasagawa et al. 1988;
Shaw et al. 2003; Frederick 2006; Yeom et al.
2007).
Nitril hidratase
amidase
Gambar 1 Biotransformasi senyawa nitril
(Frederick 2006)
Nitrilase Sebagai Enzim Pendegradasi
Senyawa Nitril
Nitrilase merupakan enzim penting secara
komersial dan digunakan dalam produksi
asam pirazinoat, agen antimycobacterial,
asam nikotinat (Bhalla et al. 1992), ibuprofen
dan degradasi bromoxynil dan ioxynil
(Yamamoto et al. 1990). Dalam industri, nitril
3
sebagian besar dikonversi secara kimia
menjadi asam yang bernilai tinggi dan amida.
Namun, konversi kimia membutuhkan asam
atau basa kuat, energi tinggi, dan dapat
menyebabkan pembentukan racun yang tidak
diinginkan pada produk. Selain itu, metode
secara kimiawi juga berpotensi untuk
mengakibatkan polusi lingkungan berupa
Nitro Oxida (NOx)- yaitu suatu gas rumah kaca
(Cantarela et al. 2006; Julie et al. 2007;
Frederick 2006).
Nitrilase
berfungsi
mengkatalisis
pemotongan gugus nitril secara langsung,
sehingga menghasilkan asam dan amonia.
Penggunaan nitrilase dalam proses biokatalisis
menarik perhatian sejak tahun 1980 karena
dapat menggantikan penggunaan asam kuat
dan katalis basa dalam proses hidrolisis nitril.
Perkembangan
berikutnya,
potensi
biotransformasi ini menjadi lebih luas dengan
diisolasinya mikroorganisme pemetabolisme
nitril yang mesofilik dan termofilik, dan
purifikasi enzim-enzim pengkonversi nitril
yang baru, termasuk yang bersifat termostabil.
Berbagai produk yang dapat dihasilkan dari
biokatalis pengkonversi nitril ini mencakup
berbagai senyawa alifatik, alisiklik, aromatik,
asam karboksilat heterosiklik, dan amida
(Mylerova & Martinkova 2003). Superfamili
enzim nitrilase ditandai dengan adanya situs
aktif yang mengandung empat posisi residu
asam amino terkonservasi, yaitu cys, glu, glu,
dan lys (Gambar 2). Nitrilase biasanya
terdapat sebagai homo-oligomer dengan
ukuran monomer sekitar 40 kDa. Aktivitas
nitrilase biasanya tergantung pada kumpulan
subunit dan dipengaruhi oleh suhu, pH,
konsentrasi enzim, serta substrat (O'Reilly &
Turner 2003).
Gambar 2
Posisi residu asam amino pada
situs aktif enzim nitrilase
(Brenner 2002)
Metagenomik
Metagenomik merupakan teknik analisis
genomik dari komunitas bakteri pada
lingkungan yang tidak memerlukan kultivasi
bakteri (uncultured) (Schlooss & Handelsman
2003; Kimura 2006). Teknologi ini
dinamakan demikian berdasarkan istilah yang
digunakan
oleh
Handelsman
untuk
menerangkan konsep statistika dari metaanalisis dan genomik (Kimura 2006). Untuk
mempelajari dan menggunakan genom-genom
dari mikroba yg belum dikulturkan, metode
metagenomik telah sering digunakan sejak
tahun 1990-an. Berbagai studi telah
menerapkan proses metagenomik untuk
mencari biokatalis atau molekul-molekul baru
untuk aplikasi bioteknologis atau farmasi
(Ryu & Yun 2005).
Kualitas analisis metagenomik berkaitan
dengan kualitas DNA yg digunakan, dan
beberapa prosedur ekstraksi yg telah
dikembangkan untuk isolasi DNA dari
lingkungan (Green & Keller 2006). Analisis
metagenomik diawali dengan isolasi DNA
dari sampel lingkungan. Kesulitan utama yang
terkait dengan pendekatan metagenom
biasanya berhubungan dengan kontaminasi
DNA yang telah dimurnikan oleh senyawa
fenolik yang termurnikan bersama DNA.
Senyawa-senyawa ini sulit dihilangkan. Selain
itu,
polifenol
juga
diketahui
dapat
mengganggu proses modifikasi enzimatis
pada DNA yang telah dimurnikan (Tsai &
Olson 1992). Pendekatan yang digunakan
untuk ekstraksi DNA secara metagenomik
biasanya serupa dengan pendekatan yang
digunakan pada ekstraksi DNA dari kultur
murni. Langkah dasar yang harus dilakukan
meliputi penghancuran matriks tanah, lisis sel,
pemisahan DNA dari serpihan sel, dan
pemurnian DNA (Meyer 2006).
Polymerase Chain Reaction
Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)
merupakan suatu reaksi in vitro untuk
menggandakan jumlah molekul asam nukleat
pada target tertentu dengan dengan bantuan
enzim termofilik Taq polimerase dan variasi
suhu (Old & Primrose 1994). Agar PCR dapat
dilaksanakan, suatu informasi mengenai
sekuen DNA perlu diketahui untuk melakukan
perancangan primer yang sesuai. Perancangan
primer dilakukan dengan beberapa kriteria,
yaitu panjang sekuen primer berkisar antara
15-25 nukleotida, kedua primer hendaknya
tidak mengalami self annealing sehingga
sekuen sepasang primer tidak saling
komplemen, perbedaan temperatur annealing
(melting point) antara kedua primer sebaiknya
kurang lebih sama, sepasang primer sebaiknya
memiliki persentase basa nukleotida GC
cukup tinggi dibandingkan % basa AT (40-