Purifikasi dan Karakterisasi Protein Inhibitor Enzim

I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Famili Flaviviridae terdiri atas tiga genera, yaitu genus flavivirus, pestivirus
dan hepacivirus. Genus flavivirus terdiri atas lebih dari 70 jenis virus, yang pada
umumnya ditularkan melalui perantaraan nyamuk atau arthropoda. Genus flavivirus
diantaranya adalah virus demam berdarah (DENV), Japanese encephalitis virus
(JEV), tick-borne encephalitis virus (TBEV), yellow fever virus (YFV), West Nile virus
(WNV), Murray Valley encephalitis virus (MVEV), dan St.Louis encephalitis virus
(SLEV). Flavivirus merupakan patogen yang sangat penting, bertanggungjawab
terhadap banyak penyakit pada manusia dan hewan, dan menyebabkan banyak
kematian.
WHO mencatat di seluruh dunia lebih dari 50 juta orang terinfeksi demam
berdarah (DENV), 200.000 orang terinfeksi Yellow Fever Virus dan sekitar 50.000
orang terinfeksi Japanese Encephalitis virus (JEV). Infeksi flavivirus dapat
menyebabkan demam berdarah (pada YFV dan DENV) dan ensefalitis serta
kerusakan saraf otak (pada JEV, TBEV, WNV, SLEV, dan MVEV). Pada umumnya
flavivirus yang paling mematikan yaitu JEV, YFV, TBEV dan DENV memiliki tingkat
mortilitas antara 5-30% (Puig-Basagoiti 2006).
Terapi yang spesifik untuk menangani infeksi flavivirus belum didapatkan.
Saat ini vaksin yang tersedia untuk manusia hanya dari tiga jenis flavivirus yaitu
YFV, JEV dan TBEV (Ray & Shi 2006), sehingga menjadi prioritas bagi peneliti
kesehatan masyarakat untuk mengembangkan dan mendapatkan vaksin dan
senyawa antivirus untuk mencegah dan mengobati penyakit infeksi flavivirus.
Penyakit Japanese encephalitis (JE) merupakan salah satu penyakit infeksi
yang serius, karena menyebabkan infeksi akut sistem saraf pusat. Sekitar 30% dari
yang sembuh juga menyisakan kelumpuhan, kerusakan otak dan penyakit serius
lainnya. Walaupun vaksin telah dikembangkan sejak tahun 1960, sampai saat ini
belum ada obat yang efektif untuk penanganan penyakit ini. JE ditularkan melalui
perantaraan nyamuk Culex tritaeniorinchus dan daerah penyebarannya adalah di
Asia terutama di Asia Tenggara. Di Indonesia yang termasuk endemik JEV yaitu di
daerah Kalimantan, Bali, Nusa Tenggara, Sulawesi, Maluku , Papua dan Lombok
(Spicer 2006).
Beberapa upaya telah dilakukan dalam rangka penemuan obat bagi penyakit
yang disebabkan oleh flavivirus, diantaranya adalah penemuan inhibitor terhadap
enzim yang esensial untuk replikasi virus tersebut, seperti enzim protease, helikase,
dan polimerase (Borowski et al. 2002b). Kini telah menjadi suatu kebutuhan yang
mendesak untuk menemukan inhibitor yang selektif dan sangat spesifik bagi
replikasi flavivirus (Paeshuyse et al. 2006).
Banyak
pendekatan
telah
dilakukan
untuk
mendapatkan
senyawa
kemoterapik antivirus, diantaranya adalah dengan mendesain struktur kristal 3D dari
protein-protein viral atau struktur sekunder/ tersier dari genom RNA viral, menapis
sejumlah besar senyawaan yang berpotensi sebagai agen antivirus, menguji
inhibitor yang telah dikenal dari virus lain, memodifikasi secara kimiawi inhibitor virus
yang telah diketahui untuk mengoptimalkan fungsinya, dan imunoglobulin intravenus
(Ray & Shi 2006). Selain itu pencarian inhibitor enzim RNA helikase merupakan
salah satu teknik untuk mengembangkan pengobatan terhadap virus tersebut
sehingga menjadi salah satu target penemuan obat antivirus.
Hatsu et al. (2002), menyatakan bahwa aktinomisetes dapat menghasilkan
inhibitor RNA helikase JEV. Sementara itu informasi mengenai penggunaan
aktinomisetes indigen Indonesia untuk menemukan inhibitor enzim RNA helikase
JEV sampai saat ini belum tersedia, sehingga mendorong peneliti untuk menemukan
dan memurnikan protein inhibitor terhadap enzim RNA helikase JEV tersebut.
Berdasarkan potensi aktinomisetes
yang sangat besar, kegiatan isolasi, koleksi
termasuk identifikasi dan karakterisasi aktinomisetes dari berbagai lokasi di
Indonesia merupakan kegiatan yang sangat menarik. Selanjutnya pemanfaatan
koleksi aktinomisetes ini melalui teknik penapisan secara cepat dan tepat, dengan
kondisi fermentasi yang optimum, merupakan sumber alternatif untuk mendapatkan
senyawa bioaktif baru. Salah satu diantaranya adalah pencarian obat terhadap
penyakit menular seperti infeksi yang disebabkan oleh flavivirus.
Pada studi sebelumnya, gen helikase dari JEV telah berhasil dikloning ke
dalam plasmid pET-21b (nama bangunnya masing-masing pET-21b/HCV NS3 hel
dan pET-21b/JEV NS3 hel). Enzim ini bisa diekspresikan pada E. coli
BL21(DE3)pLysS dengan induksi Isopropyl ß-D thiogalactopyranoside (IPTG)
(Utama et al. 2000; Hatsu et al. 2002), sehingga enzim murni helikase dapat
diperoleh
melalui
purifikasi
dari
biakan
E.
coli
BL21(DE3)pLysS
dengan
menggunakan kromatografi afinitas, untuk selanjutnya digunakan sebagai substrat
bagi pencarian senyawa inhibitor terhadap enzim tersebut.
Saat ini telah dilakukan penapisan sekitar 1.800 isolat aktinomisetes koleksi
Pusat penelitian Bioteknologi LIPI (Grace 2006), dan telah diperoleh sekitar 11 isolat
aktinomisetes yang memiliki kemampuan menghambat aktivitas enzim RNA helikase
JEV di dalam supernatannya. Kesebelas isolat aktinomisetes tersebut memiliki
aktivitas inhibitor sekitar 45-50% terhadap enzim RNA helikase JEV. Dari isolat
yang memiliki aktivitas inhibitor yang tinggi, selanjutnya akan digunakan untuk
mencari protein target yang memiliki aktivitas inhibitor ATPase dari RNA helikase
JEV. Enzim RNA helikase, selain memiliki aktivitas helikase (ATP-dependent
helicase), juga memiliki aktivitas ikatan RNA (RNA binding) dan ATPase (RNAstimulated ATPase). Karena aktivitas RNA helikase tergantung pada aktivitas
ATPase dan uji ATPase dapat dilakukan dengan mudah, skrining inhibitor helikase
dapat dilakukan melalui uji ATPase.
Protein inhibitor terhadap enzim RNA helikase JEV yang diperoleh akan
dipurifikasi
dengan
menggunakan
beberapa
langkah
pemurnian,
seperti
pengendapan dengan amonium sulfat, kromatografi gel filtrasi, TLC dan HPLC.
Karakterisasi yang dilakukan terhadap inhibitor tersebut, berupa pengukuran bobot
molekul, pengujian kestabilan protein tersebut terhadap suhu dan pH. Penelitian ini
diharapkan akan menemukan protein yang bersifat inhibitor terhadap enzim RNA
helikase JEV. Penelitian ini juga diharapkan akan membantu penemuan obat baru,
sehingga mengurangi ketergantungan kita terhadap obat-obatan dari luar negeri.
1.2 Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah: 1) mendapatkan protein murni yang bersifat
inhibitor terhadap enzim RNA helikase JEV, dan 2) karakterisasi protein yang
bersifat inhibitor tersebut, yang meliputi stabilitas protein, bobot molekul protein
inhibitor, dan aktivitas penghambatan terhadap enzim RNA helikase.