Templat tugas akhir S1

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Salmonella sp. PADA REPTIL
ERFIANDINI EKA PUSPITA
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Identifikasi
Salmonella sp. pada Reptil adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2015
Erfiandini Eka Puspita
NIM B04110050
ABSTRAK
ERFIANDINI EKA PUSPITA. Isolasi dan Identifikasi Salmonella sp. pada
Reptil. Dibimbing oleh I WAYAN TEGUH WIBAWAN
Salmonella sp. merupakan agen patogen bagi manusia yang bersifat
zoonosis. Kejadian salmonellosis pada manusia dapat disebarkan oleh hewan
peliharaan eksotik (exotic pet animals). Infeksi mikroorganisme ini pada manusia
akan meningkat didukung oleh popularitas dan varietas reptil sebagai hewan
peliharaan eksotik. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan
Salmonella sp. pada reptil sebagai faktor penyebaran melalui kontak langsung
dengan manusia yang memelihara reptil. Sampel yang digunakan adalah swab
kulit disekitar kloaka setiap reptil yang berasal dari salah satu petshop di Dramaga
Bogor. Penelitian ini dilakukan melalui tahapan isolasi, uji presumtif, dan uji
konfirmasi. Hasil penelitian menunjukan bahwa prevalensi keberadaan
Salmonella sp. pada hewan eksotik khususnya reptil di petshop tersebut sebanyak
7.5%. Hasil positif didapatkan pada sampel yang berasal dari ular.
Kata kunci : isolasi, identifikasi, Salmonella sp., reptil, swab kulit.
ABSTRACT
ERFIANDINI EKA PUSPITA. Isolation dan Identification Salmonella sp. in
Reptile. Supervised by I WAYAN TEGUH WIBAWAN
Salmonella sp. is a zoonotic pathogenic agent. The incidence of
salmonellosis can be spread by exotic pets. Microorganism infection in humans
correlates with the popularity of exotic pets. This research aims to determine the
presence of Salmonella on reptiles as a spreading factor through direct contact
with humans. Cloacal skin swab of reptiles in one of petshops in Dramaga, Bogor
were used as samples. This research was conducted through steps: isolation,
presumptive test, and confirmation test. The result of this research showed that
the prevalence of Salmonella on exotic animals especially reptiles in the
mentioned pet shop is 7.5%. The positive results are mostly acquired from
samples derived from snakes.
Keyword : isolation, identification, reptile, Salmonella sp., skin swab.
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Salmonella sp. PADA REPTIL
ERFIANDINI EKA PUSPITA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya
ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul penelitian yang telah dilaksanakan sejak
bulan Januari sampai Mei 2015 ini ialah Isolasi dan Identifikasi Salmonella sp.
pada Reptil.
Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Prof Dr Drh I Wayan Teguh Wibawan, MS sebagai dosen pembimbing atas
segala bimbingannya, masukan, dukungan, nasihat, serta kesabarannya
sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini.
2. Drh Wyanda Arnafia dan Drh Siti Gusti Ningrum yang telah banyak memberi
saran, bimbingan dan menyempurnakan skripsi ini.
3. Drh Purnomo yang telah menyediakan tempat dan waktunya dalam
pengambilan sampel penelitian.
4. Bapak Agus Soemantri, Bapak Nur, Bapak Didik, Mas Adji dan beserta
seluruh staf Laboratorium Bakteriologi Bagian Mikrobiologi Medis,
Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesmavet (IPHK), Fakultas Kedokteran
Hewan Institut Pertanian Bogor dan staf Laboratorium Bakteriologi Balai
Besar Veteriner Bogor yang telah membantu selama pengumpulan data.
5. Keluarga tercinta, Ayahanda A Kohar Lutfi, Ibunda Erna Hastuti, Adinda
M. Ridho Andwi Putra dan Adinda Rahmadian Tri Noval atas doa dan
dukungannya kepada penulis.
6. Sylvia Oscarina dan Andi Aulia Ariesty sebagai teman penelitian. Ibu
Masniari, Oktavia, Nia, Meilany, Rianti, para Yasminers dan seluruh angkatan
FKH 48 yang telah memberikan warna dan cerita.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih belum sempurna, sehingga
kritik, saran, dan masukan yang membangun sangat diharapkan dalam penulisan
karya ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2015
Erfiandini Eka Puspita
DAFTAR ISI
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Manfaat Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Klasifikasi dan Karakteristik Reptil
Klasifikasi dan Karakteristik Bakteri Salmonella sp.
Patogenesis Salmonellosis
Salmonellosis pada Reptil
METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Desain Penelitian
Pengambilan dan Jumlah Sampel
Alat dan Bahan
Metode Penelitian
Tahap Pre-Enrichment (Pra-Pengayaan)
Tahap Enrichment (Pengayaan)
Tahap Isolasi dan Identifikasi
Uji Konfirmasi Biokimia
Uji Konfirmasi Isolat Salmonella Menggunakan Metode PCR
Analisis Data
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Uji Konfirmasi Biokimiawi
Uji Konfirmasi Isolat Salmonella Menggunakan Metode PCR
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
RIWAYAT HIDUP
1
1
1
1
2
2
2
3
4
5
5
5
5
5
6
6
6
6
7
8
8
9
9
10
11
13
13
13
14
16
DAFTAR GAMBAR
1 Mekanisme invasi Salmonella sp. (Revolledo 2010).
2 Diagram alur pengujian Salmonella sp.
3 Koloni Salmonella sp. pada media BSA
4 Hasil Uji Biokimia
5 Hasil elektroforesis sampel yang diduga Salmonella sp.
4
7
10
11
12
DAFTAR TABEL
1 Reaksi biokimia Salmoella sp. (BSN 2008)
2 Sampel yang diduga positif Salmonella sp. pada BSA
3 Sampel yang diduga positif Salmonella sp. pada TSIA
4 Persentase prevalensi Salmonella sp. pada reptil
7
9
10
12
2
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Reptil merupakan hewan melata, berdarah dingin, dan memiliki masa hidup
yang relatif panjang dari mamalia. Sifat dan karakteristik unik tersebut membuat
akhir-akhir ini popularitas reptil sebagai hewan peliharaan yang eksotik, semakin
meningkat. Saat ini diperkirakan 1% dari rumah tangga di Amerika Serikat dan
Eropa memelihara jenis hewan ini, dan jenis yang paling banyak dipelihara adalah
jenis kura-kura (Harris et al. 2010). Selama popularitas dan varietas hewan ini
meningkat, maka semakin tinggi infeksi yang terjadi pada manusia akibat
terinfeksi mikroorganisme pada reptil, khususnya Salmonella sp.. Banyak studi
telah membuktikan bahwa kejadian salmonellosis pada manusia dapat disebarkan
oleh hewan peliharaan eksotik (exotic pet animals).
Salmonelosis merupakan penyakit yang disebabkan oleh infeksi dari
Salmonella sp., dan salah satu penyakit zoonotik yang penting menyerang
manusia dan hewan. Gray (2011) dalam sebuah penelitian menyatakan sekitar
40% isolat Salmonella sp. ditemukan pada saluran pencernaan reptil.
Salmonella sp. juga ditemukan pada tanah tempat reptil dipelihara dan di feses.
Salmonella sp. merupakan agen patogen bagi manusia yang dapat
menyebabkan penyakit serius, namun tidak menimbulkan gejala klinis pada reptil.
Kemampuan penyebaran bakteri ini sangat mudah, baik secara langsung maupun
tidak langsung. Secara langsung bakteri ini dapat menginfeksi melalui kontak
langsung saat menangani hewan, sedangkan secara tidak langsung dapat terinfeksi
dari kontaminasi kandang dan alat pakan hewan. Menurut Geue dan Löschner
(2002), reptil liar memiliki prevalensi Salmonella sp. lebih rendah dibandingkan
reptil yang dipelihara dalam penangkaran. Sebanyak 88.9% isolat Salmonella sp.
ditemukan pada sampel reptil yang dipelihara di pet shop dan sebanyak 58.8%
ditemukan pada sampel reptil yang ditangkap dari alam liar. Salmonella sp. pada
hewan reptil dapat terdeteksi di kloaka dan ulas kulit (skin swab). Penyebaran
Salmonella sp. dari reptil melalui kulit ke lingkungan lebih mudah karena reptil
bergerak dengan merayap. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui keberadaan
Salmonella sp. pada reptil khususnya pada kulit sebagai faktor penyebaran melalui
kontak langsung dengan manusia yang memelihara reptil.
Perumusan Masalah
Diperlukan penelitian untuk memecahkan pertanyaan mengenai keberadaan
Salmonella sp. pada sampel swab kulit di sekitar kloaka reptil khususnya pada
reptil sebagai hewan peliharaan.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai keberadaan
Salmonella sp. pada reptil yang digunakan sebagai hewan peliharaan.
2
TINJAUAN PUSTAKA
Klasifikasi dan Karakteristik Reptil
Reptil adalah hewan bertulang belakang yang merayap, bersisik dan
bernapas dengan paru-paru. Indonesia memiliki tiga ordo yaitu: Testudines,
Squamata dan Crocodylia. Tuatara (Ordo Rhynchocephalia) merupakan reptil
primitif yang terdiri dari 1 jenis dan hanya terdapat di SelandiaBaru (O’Shea dan
Halliday 2001).
Berikut adalah klasifikasi umum reptil:
Kingdom :
Animalia
Filum
:
Chordata
Sub-filum :
Vertebrata
Kelas
:
Reptilia
Sub Kelas :
Eureptilia
Super Ordo :
Lepidosauria, Testudines, Archosauria
Ordo
:
Testudines (kura-kura)
Squamata (kadal, ular, dan amphisbaenia)
Rhynchocephalia (tuatara)
Crocodylia (buaya)
Ciri utama reptil adalah tubuhnya yang ditutupi dengan sisik-sisik rata atau
berduri yang berfungsi untuk mengatur sirkulasi air melalui kulitnya. Hewan ini
tidak memiliki rambut atau bulu. Warna kulit beragam, dari warna yang
menyerupai lingkungannya sampai warna yang membuat reptil mudah terlihat.
Semua reptil tidak memiliki telinga eksternal. Sebagian besar reptil terdapat
perbedaan antara jantan dan betina pada ukuran dan bentuk, maupun warna tubuh
dewasa (Halliday dan Adler 2000). Hampir semua reptil adalah ovipar atau
bertelur, dan sebagian lagi ovovivipar. Reptil dapat bersifat ovipar maupun
ovovivipar walaupun termasuk dalam genus yang sama.
Klasifikasi dan Karakteristik Bakteri Salmonella sp.
Salmonella sp. berhabitat secara alami pada saluran pencernaan hewan. Saat
ini lebih dari 2500 jenis serovar Salmonella sp. yang telah ditemukan. Salmonella
sp. memiliki 2 spesies, yakni Salmonella enterica dan S. bongori, dan 6
subspesies S. Enterica (subspesies I), S. Salamae (subspesies II), S. Arizonae
(subspesies III), S. Diarizonae (subspesies IIIb), S. Houtenae (subspesies IV) dan
S. Indica (subspesies V). Subspecies I secara rutin ditemukan pada manusia,
sedangkan subspesies lain sering ditemukan dari hewan poikitoterm dan
lingkungan.
Berikut adalah klasifikasi umum bakteri Salmonella sp.
Kingdom
: Bacteria
Filum
: Proteobacteria
Kelas
: Gammaproteobacteria
Ordo
: Enterobacteriales
Famili
: Enterobacteriaceae
Genus
: Salmonella sp.
3
Salmonella sp. termasuk dalam famili Enterobacteriaceae, merupakan
bakteri gram negatif yang berbentuk batang, serta tidak membentuk spora. Ratarata berukuran 1-3 µm x 0.5 µm. Bakteri ini bersifat motil dengan flagela
peritrichous. Semua spesies Salmonella sp. adalah patogen bagi manusia. Bakteri
yang ditemukan pertama kali oleh Daniel Elmer Salmon (ahli patologi veteriner
dari Amerika) ini hidup pada kisaran temperatur 5 °C sampai 47 °C (optimum
37 °C), sensitif terhadap temperatur tinggi, tidak tahan pada temperatur lebih dari
70 °C. Bakteri ini dapat mati pada suhu pasteurisasi dan sensitif terhadap pH
rendah (4.5 atau kurang) dan tidak dapat berkembang biak pada aW 0.94 terutama
dengan kombinasi pH rendah. Bakteri ini dapat bertahan pada kondisi beku dan
kering.
Salmonella sp. dapat memfermentasi sukrosa tetapi jarang adonitol, urea
negatif, indol negatif, tidak menghidrolisis urea atau deaminate phenylalamine,
membentuk dekarboksilase lisin dan ornithine, negatif uji Voges-Proskauer, dan
positif uji methyl red. Salmonella sp. membentuk gas ketika ditumbuhkan di
media yang mengandung glukosa. Secara umum, Salmonella sp. memfermentasi
non laktosa seperti dulcitol, kecuali Salmonella Arizonae. Umumnya bakteri ini
menggunakan sitrat sebagai sumber karbon, kecuali Salmonella Arizonae yang
menggunakan malonate sebagai sumber karbon utama (Ray dan Bhunia 2008).
Patogenesis Salmonellosis
Habitat bakteri Salmonella sp. adalah di dalam alat pencernaan manusia, dan
hewan. Rute penularan terjadi melalui fekal dan oral, akibat mengonsumsi
makanan atau minuman tercemar. Salmonella sp. yang berkembang biak di dalam
saluran pencernaan akan mengakibatkan radang usus (enteritis). Radang usus
terjadi karena proliferasi Salmonella sp. sehingga terjadi kerusakan lamina propria
dan menimbulkan diare. Salmonella sp. yang menginfeksi memiliki kemampuan
menghasilkan racun cytotoxin dan enterotoxin (Poeloengan et al. 2006).
Infeksi Salmonella sp. pada hewan dan manusia dapat menyebabkan
penyakit serius atau terjadinya carier. Sejumlah faktor virulensi Salmonella sp.
telah diidentifikasi untuk menyerang dan menginfeksi hospes. Mayoritas
Salmonella sp. yang motil menggunakan flagela untuk kontak dengan sel inang.
Flagela terdapat di salah satu kutub, menyebabkan bakteri dapat melakukan
aktivitas bergerak. Faktor virulensi seperti flagela ini banyak digunakan sebagai
antigen dalam uji-iji diagnostik seperti enzym linked imunnosorbent assay
(ELISA). Patogenesis Salmonella sp. sangat tergantung dari faktor virulensi
bakteri yaitu: (1) kemampuan invasi sel, (2) lapisan lipopolisakarida, (3)
kemampuan replikasi intrasel, dan (4) kemungkinan perbanyakan toksin. Setelah
bakteri masuk dalam saluran pencernaan, organisme tersebut berkoloni di ileum
dan kolon, memasuki epitel usus dan terjadi proliferasi epitel dan folikel limfoid.
Tahap selanjutnya yaitu menginduksi membran enterosit dan menstimulasi
pinositosis organisme (Khoiriyah et al. 2013).
Infeksi oral Salmonella sp. pada mamalia ditandai dengan interaksi awal
bakteri dalam saluran pencernaan, terutama melalui sel M dan sel epitel. Setelah
organisme masuk ke hospes, Salmonella sp. memulai siklus infeksinya dengan
menginvasi jaringan limfoid. Kapasitasnya untuk menyerang sel epitel usus non
4
fagosit memberikan perlindungan seluler sehingga mikrob bereplikasi dan
bertahan dalam hospes. Salmonella sp. menghasilkan efek cicotoxic yang
mengakibatkan rusaknya sel-sel M dan invasi bakteri dalam enterosit akan
dilanjutkan ke hati dan limpa (Revolledo 2010).
Gambar 1 Mekanisme invasi Salmonella sp. (Revolledo 2010).
Salmonella sp. memiliki kemampuan untuk menghasilkan 3 tipe substansi
toxic. Thermolabile enterotoxin mengikat ganglion dan meningkatkan cyclic
adenosine monophospate (cAMP) dan sekresi cairan. Cytotoxin merupakan
komponen non-lipopolysaccharida pada membran luar yang menghambat sintesa
protein sel eukariotik. Endotoxin (lipid A) merupakan komponen
lipopolisacharida dinding sel berfungsi mengaktifkan makrofag dan limfosit
sehingga memicu serangkaian reaksi biologis seperti demam, leukositosis dan
hipotensi (Selimovic et al. 2010).
Salmonellosis pada Reptil
Salmonella sp. pertama kali di isolasi dari kadal (Heloderma suspectum)
pada tahun 1994. Sebelumnya Salmonella sp. pernah terisolasi dari ular gopher
(Pituophis catenifer deseticola) di peternakan kalkun pada tahun 1939. Namun
laporan belum dikonfirmasi oleh Organisai Biokimia Salmonella. Hasil laporan
menyatakan terdapat 3 serotypes yaitu: Salmonella Panama, S. Meleagridis dan
tipe paracolon yang belum teridentifikasi. Kemudian ular dianggap sebagai
reservoar utama dari Salmonella sp. dan penyebab terjadinya wabah salmonelosis
pada peternakan kalkun (Mitchell dan Shane 2001).
Salmonella sp. pada reptil tidak menimbulkan gejala klinis, namun dapat
menimbulkan penyakit serius pada manusia. Selama popularitas dan varietas reptil
meningkat, maka semakin tinggi salmonellosis terjadi pada manusia. Infeksi
bersumber dari hewan eksotik seperti ular, kadal, kura-kura, iguana, katak dan lain
sebagainya. Gray (2011) dalam sebuah penelitiannya menyatakan sekitar 40%
isolat Salmonella sp. ditemukan pada saluran pencernaan Iguana. Salmonella sp.
juga ditemukan pada tanah tempat iguana dipelihara dan juga ditemukan di feses.
Reptil liar memiliki prevalensi Salmonella sp. lebih rendah dibandingkan
reptil yang dipelihara dalam penangkaran. Sebanyak 88.9% isolat Salmonella sp.
5
ditemukan pada sampel reptil yang dipelihara di pet shop dan sebanyak 58.8%
ditemukan pada sampel reptil yang ditangkap dari alam liar (Geue dan Lo¨schner
2002). Salmonella sp. pada hewan reptil dapat terdeteksi di kloaka dan ulas kulit
(skin swab) (Pees et al. 2013).
METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian telah dilakukan pada bulan Januari 2015, bertempat di
Laboratorium Bakteriologi Bagian Mirobiologi Medis, Departemen Ilmu Penyakit
Hewan dan Kesmavet (IPHK), Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian
Bogor (IPB) dan dan bulan Mei 2015 di Balai Besar Penelitian Veteriner Bogor.
Desain Penelitian
Penelitian dibagi menjadi tiga tahap, yaitu (1) pengambilan sampel swab
kloaka reptil dari salah satu pet shop di Dramaga dan (2) pengujian sampel swab
kloaka reptil di laboratorium terhadap keberadaan Salmonella sp. (3) pengujian
menggunakan metode PCR di Balai Besar Penelitian Veteriner Bogor.
Pengambilan dan Jumlah Sampel
Jumlah sampel swab kloaka reptil diambil sebanyak 40 berasal dari 22
spesies reptil. Sampel diambil pada semua reptil yang ada di pet shop tersebut
dengan melakukan swab pada kulit daerah kloaka reptil. Setiap sampel
dimasukkan ke dalam buffer peptone water (BPW) sebanyak 5 mL sebagai
pre-erichment, kemudian diberi label, dan disimpan dalam cool box selama proses
transportasi.
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah sampel swab kulit daerah
kloaka reptil, BPW, tetrathionate broth/TTB (DifcoTM Tetrathionate Broth
Base), bismuth sulfite agar/BSA (OXOID CM 0201), triple sugar iron agar/TSIA
(DifcoTM Triple Sugar Iron Agar), tripsin soy agar/TSA, methyl red-Voges
Proskauer/MR-VP (OXOID CM 0043), urea broth (OXOID CM 0071), SIM
(BBLTM SIM Medium), simmons citrate agar (OXOID CM 0155) phenol red
lactose broth (DifcoTM Lactose), phenol red sucrose broth (Fluka Biochemica),
dulcitol broth (Merck 1.05990.0050), iodin solution, indikator methyl red, larutan
α-naphtol, KOH 40%, larutan herlich, aquades steril, air, sabun, Dettol®, dan
alkohol 70%. PureLink® Genomic Digestion buffer, proteinase K, PureLink®
Genomic lysis/binding buffer, etanol 96%, PureLink® Genomic washing buffer,
PureLink® Genomic elutian buffer, primers (IDT®, 10 pmol/µl), DNA template,
6
master mix (Maxima® Hot Start Green), aquadest (DNAse, RNAse free), agarose
(Promega®), ethidium bromide (Applichem®), dan DNA ladder (Vivantis®).
Alat yang digunakan ialah jas lab, sarung tangan, masker, plastik steril tahan
panas, cotton swab, cawan Petri (diameter 10 cm), tabung reaksi (volume 15 mL),
sumbat dan rak tabung reaksi, labu Erlenmeyer (volume 250 mL), gelas ukur
(volume 250 mL dan 1000 mL), pipet volumetrik (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, dan
20 mL), syringe 5 mL, botol media (volume 500 mL dan 1000 mL), gunting,
pinset, jarum inokulasi (ose), pembakar Bunsen, pH meter, timbangan, pengocok
tabung (vortex), inkubator, penangas air, autoklaf, lemari steril, lemari pendingin,
kotak pendingin, kolom spin, PCR tube, mikropipet, UV illuminator, dan freezer.
Metode Penelitian
Prinsip pengujian Salmonella sp. di laboratorium meliputi tahap
pertumbuhan Salmonella sp. pada media selektif dengan pre-enrichment
(pra-pengayaan) dan enrichment (pengayaan), dilanjutkan dengan isolasi dan
identifikasi, meliputi uji konfirmasi menggunakan metode uji biokimia dan
metode polimerase chain reaction (PCR). Setiap proses pengujian selalu disertai
dengan menggunakan kontrol positif S. Typhimurium ATCC 14028.
Tahap Pre-Enrichment (Pra-Pengayaan)
Sampel diambil dengan melakukan swab pada kulit daerah kloaka reptil,
kemudian hasil swab dimasukkan ke dalam tabung berisi 5 mL BPW kemudian
diinkubasipada temperatur 37 °C selama 24 jam.
Tahap Enrichment (Pengayaan)
Biakan pra-pengayaan dihomogenkan menggunakan vortex kemudian
dipindahkan 1 mL ke dalam 10 mL media TTB kemudian diinkubasi pada
temperatur 37 °C selama 48 jam.
Tahap Isolasi dan Identifikasi
Sebanyak satu ose TTB diinokulasi pada BSA kemudian diinkubasi pada
temperatur 37 °C selama 24 jam. Inkubasi BSA dapat diperlama 1 x 24 jam untuk
memperjelas hasil yang didapat. Koloni Salmonella sp. pada BSA terlihat
berwarna hitam dan kadang metalik, media di sekitar koloni berwarna coklat dan
semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi hitam.
Identifikasi dilakukan pada koloni yang diduga kemudian diinokulasikan ke
TSIA. Inokulasi dilakukan dengan cara menusuk ke dasar media agar, selanjutnya
digores pada agar miring. Kemudian media diinkubasi pada temperatur 37 °C
selama 24 jam.
7
1. Homogenisasi
dan prapengayaan
2. Seleksi
pengayaan
3. Plating
pada media
selektif
4. Identifikasi
5. Konfirmasi
• Biokimiawi
• PCR
Gambar 2 Diagram alur pengujian Salmonella sp. menurut International
Organization for Standardization 6579: 2002 dengan modifikasi minor
Uji Konfirmasi Biokimia
Konfirmasi Salmonella sp. dengan uji biokimia dilakukan dengan
menginokulasi koloni positif media TSIA pada masing–masing media uji
biokimia yaitu SIM, citrate, urease, mannitol broth, glucose broth, sucrose broth,
lactose broth, dulcitol broth, dan MR-VP kemudian diinkubasi pada temperatur
37 °C selama 24 jam. Intepretasi hasil uji biokimia Salmonella sp.dapat dilihat
pada Tabel 1.
Tabel 1 Reaksi biokimia Salmonella sp. (BSN 2008)
Uji substrat
Urease
Phenol red dulcitol
broth
Uji indol
Simmons sitrat
Phenol red lactose
broth
Phenol red sucrose
broth
Uji Voges-Proskauer
Uji methyl red
Hasil reaksi
Positif
Negatif
Merah muda sampai
Tetap kuning
Merah
Warna kuning
Tidak berubah warna
dengan/tanpa gas
dan tidak terbentuk
gas
Permukaan warna
Permukaan warna
Merah setelah
Kuning setelah
penambahan reagen
penambahan reagen
Pertumbuhan warna
Tidak ada
biru
pertumbuhan
dan tidak ada
perubahan
Warna kuning
Tidak berubah warna
dengan/tanpa gas
dan tidak terbentuk
gas
Warna kuning
Tidak berubah warna
dengan/tanpa gas
dan tidak terbentuk
setelah penambahan
gas setelah
reagen
penambahan reagen
Merah muda sampai
Tidak berubah warna
Merah setelah
setelah penambahan
penambahan reagen
reagen
Merah menyebar
Warna kuning
Menyebar
Salmonella
-
-
bervariasi
-
-
-
+
8
Uji Konfirmasi Isolat Salmonella Menggunakan Metode PCR
Prosedur PCR digunakan untuk mengonfirmasi isolat yang diduga
Salmonella dari uji-uji biokimiawi. Metode ini mendeteksi keberadaan agen
berbasiskan materi genetik berupa DNA sehingga memiliki spesifitas uji yang
tinggi. Nilai spesifitas yang tinggi mengakibatkan teknik PCR dapat digunakan
sebagai uji konfirmasi. Semua isolat yang diduga Salmonella pada uji biokimiawi
dilanjutkan dengan pengujian menggunakan teknik PCR.
Teknik PCR diawali dengan ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA yang dilakukan
mengikuti protokol pada prosedur PureLink® genomic DNA Kits. Isolat yang
diduga Salmonella pada uji biokimiawi dikultur pada 5 mL BHI selama 24 jam
pada suhu 37 °C. Sebanyak 1 mL kultur disentrifugasi 10000 rpm selama 5 menit.
Pelet diresuspensikan dengan menambahkan 180 µl PureLink® genomic digestion
buffer dan 20 µl proteinase K, kemudian diinkubasi 55 °C selama 30 menit.
Setelah itu ditambahkan 20 µl RNAase A dan diinkubasi selama 2 menit pada
suhu ruang. Suspensi ditambahkan dengan 200 µl PureLink® genomic
lysis/binding buffer dan 200 µl etanol 96% kemudian disentrifugasi 10000 rpm
selama 1 menit. Sebanyak 600 µl suspensi dimasukkan ke dalam kolom spin dan
disentrifugasi 10000 rpm selama 1 menit kemudian dicuci sebanyak 2 kali
menggunakan 500 µl PureLink® genomic washing buffer. DNA yang terdapat
pada kolom spin kemudian dilarutkan menggunakan 200 µl PureLink® genomic
elutian buffer. Hasil ekstraksi DNA digunakan sebagai DNA template untuk
proses PCR.
Prosedur amplifikasi PCR fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan
primers ompC, forward (OMPCF) 5′-ATC GCT GAC TTA TGC AAT CG-3′ dan
reverse (OMPCR) 5′-CGG GTT GCG TTA TAG GTC TG-3′). Primers yang
dipakai mengamplifikasi protein C pada bagian outer membrane dari
Salmonella sp. PCR dilakukan dengan total volume 20 µl larutan reaksi yang
terdiri dari 7.2 µl aquadest (DNAse, RNAse free), 10 µl 2× PCR master mix
(Maxima® Hot Start Green), 0.8 µl primers (IDT®, 10 pmol/µl), dan 2 µl DNA
template. PCR dilakukan dengan 1 siklus pada suhu 95 °C selama 3 menit (initial
denaturasi), 35 siklus pada suhu 95 °C selama 30 detik (denaturasi), 50 °C
selama 30 detik (annealing) dan pada suhu 72 °C selama m1 menit (extention),
dan dilanjutkan dengan 1 siklus pada suhu 72 °C selama 5 menit (final extention).
Produk PCR (amplikon dengan panjang 204 bp) diseparasi menggunakan 1.5 %
agarose (Promega®) yang telah ditambahkan ethidium bromide (Applichem®)
0.5 µg/mL pada tegangan 120 V selama 50 menit dengan menggunakan marker
100 bp DNA ladder (Vivantis®). Hasil elektroforesis selanjutnya dilihat dengan
menggunakan UV illuminator.
Analisis Data
Hasil pengujian laboratorium terhadap Salmonella sp. dianalisis secara
deskriptif.
9
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Tabel 2 menunjukan sebanyak 22 sampel dari 40 sampel yang diuji
memberikan hasil positif pada inokulasi di media bismuth sulfite agar (BSA).
Koloni yang diduga Salmonella sp. memiliki warna keabu-abuan atau kehitaman
(BSN 2008). Menurut BAM (2007), Salmonella sp. dapat menghasilkan koloni
yang besar dengan inti bewarna gelap mengkilap atau koloni terlihat hitam
keseluruhan (Gambar 3). Bakteri Salmonella sp. dapat memproduksi hidrogen
sulfida yang dapat menyebabkan media menghitam karena produksi ferrous
sulphides. Ferrous sulphides menyebabkan dekarboksilasi lisin dan menghasilkan
reaksi alkali (warna ungu) atau reaksi netral di dasar medium. Bakteri S.
Typhimurium ATCC 14028 digunakan sebagai kontrol positif pada penelitian ini.
Tabel 2 Sampel yang diduga positif Salmonella sp. pada BSA
No
Kode
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
1
2
3
4
5
7
8
10
12
14
19
24
25
27
28
29
31
32
33
35
36
Nama Ilmiah
Gonyosoma oxycephala
Ptyas mucosa
Ptyas mucosa
Ptyas mucosa
Ptyas mucosa
Varanus salvator
Varanus salvator
Pyton curtus
Pyton reticulatus
Pyton reticulatus
Eublepharis macularius
Ahaetulla prasina
Ahaetulla prasina
Ptyas coros
Eublepharis macularius
Pyton curtus
Boiga dendrophila
Morelia trancyae
Morelia trancyae
Boa contrictor
Varanus salvadorii
Sampel
Nama populer
Ular Hijau Bakau
Ular Jali Kembang
Ular Jali Kembang
Ular Jali Kembang
Ular Jali Kembang
Biawak
Biawak
Ular Bipong Karamel
Ular Retik
Ular Retik
Kadal Gurun
Ular Pucuk
Ular Pucuk
Ular Coros
Kadal Gurun
Ular Bipong
Ular Cincin Emas
Ular Halmahera
Ular Halmahera
Ular Boa
Biawak Papua
Jenis Hewan
Ular
Ular
Ular
Ular
Ular
Biawak
Biawak
Ular
Ular
Ular
Kadal
Ular
Ular
Ular
Kadal
Ular
Ular
Ular
Ular
Ular
Biawak
10
Gambar 3 Koloni Salmonella sp. pada media BSA
Hasil penelitian Waltman (1999) menunjukan bahwa persentase positif
cemaran Salmonella sp. pada media BSA dinilai rendah. Hal ini disebabkan
karena mikrob selain Salmonella sp. dapat tumbuh pada media ini. Koloni yang
diduga Salmonella sp. pada media BSA selanjutnya dikultur pada media TSIA.
Kultur pada media TSIA bertujuan sebagai uji presumtif dalam mengidentifikasi
Salmonella sp.
Hasil positif pada media TSIA sebanyak 5 sampel dari 21 sampel yang diuji
(Tabel 3). Sampel positif Salmonella sp. pada media TSIA menurut BAM (2007)
ditandai dengan bagian permukaan miring (slant) berwarna merah/alkalin (reaksi
basa), bagian butt berwarna kuning (reaksi basa), dan memproduksi H2S
(kehitaman pada agar hingga menutupi warna dasar agar). Warna hitam yang
muncul pada media TSIA disebabkan oleh media TSIA mengandung Fe, bakteri
Salmonella sp. menghasilkan H2S sulfur yang dihasilkan dari gas H2S bereaksi
dengan Fe pada media TSIA menjadi FeS yang berwarna hitam (BSN 2008).
Tabel 3 Sampel yang diduga positif Salmonella sp. pada TSIA
No
1
2
3
4
5
Kode
Sampel
4
19
25
31
35
Nama Ilmiah
Ptyas mucosa
Eublepharis macularius
Ahaetulla prasina
Boiga dendrophila
Boa contrictor
Asal Sampel
Nama populer
Ular Jali Kembang
Leopard Gecko
Ular Pucuk
Ular Cincin Emas
Ular Boa
Jenis Hewan
Ular
Kadal Gurun
Ular
Ular
Ular
Uji Konfirmasi Biokimiawi
Uji konfirmasi biokimiawi dilakukan untuk menguatkan dugaan bahwa
bakteri yang diisolasi merupakan bakteri Salmonella sp. Berdasarkan hasil uji
biokimia dari lima isolat yang telah diisolasi didapatkan sebanyak tiga isolat yang
memiliki karakteristik sebagai Salmonella sp. Menurut SNI 2897:2008,
Salmonella sp. tidak mampu memfermentasi sukrosa dan laktosa tetapi mampu
11
memfermentasi manitol dan glukosa. Hasil fermentasi positif ditandai dengan
perubahan warna dasar merah menjadi kuning akibat produksi asam hasil
metabolisme bakteri. Fermentasi dulcitol menunjukan hasil yang bervariasi,
karena secara umum Salmonella sp. memfermentasi non lactose seperti dulcitol,
kecuali Salmonella Arizonae yang secara rutin memfermentasi gula ini. Hasil uji
citrate pada Salmonella sp. menunjukan hasil negatif. Hal tersebut juga terjadi
pada uji Voges-Proskauer dan uji urease dengan ditandai tidak adanya perubahan
warna. Hasil uji positif didapat pada uji methyl red yang ditandai dengan adanya
penyebaran warna merah pada larutan. Gambar 4 menyajikan hasil pengamatan
uji biokimia.
Gambar 4 Hasil Uji Biokimia dari kiri ke kanan hasil uji Indol, uji citrate, uji
urease, uji phenol red manitol broth, uji phenol red glukose broth, uji
phenol red sucrose broth, uji phenol red lactose broth, uji phenol red
dulcitol broth, uji Voges-Proskauer, dan uji methyl red
Uji Konfirmasi Isolat Salmonella Menggunakan Metode PCR
Analisis hasil amplifikasi dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa yang
berperan sebagai sirkuit elektrik untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA
berdasarkan jumlah nukleotida penyusunnya. Semakin kecil ukuran pasang basa
nukleotidanya, akan semakin mudah bermigrasi dan berada di bagian gel yang
dekat dengan anoda. Pita-pita DNA yang terbentuk diamati dengan alat UV
transilluminator. Visualisasi DNA pada elektroforesis dilakukan menggunakan
pewarna yang dapat berfluoresensi yaitu etidium bromida yang merupakan
molekul planar yang dapat menyisip di antara ikatan basa DNA. Etidium bromida
yang terkonsentrasi dalam fragmen DNA dan berfluoresensi pada cahaya UV.
Sampel yang menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran sekitar 204 pasang basa
menandakan bahwa sampel tersebut positif mengandung Salmonella sp.
(Radji et al 2010). Hasil elektroforesis terhadap produk yang dihasilkan melalui
amplifikasi PCR ditunjukkan pada Gambar 5.
12
Gambar 5 Hasil elektroforesis sampel yang diduga Salmonella sp.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode PCR menggunakan primers
ompC, forward (OMPCF) 5′-ATC GCT GAC TTA TGC AAT CG-3′ dan reverse
(OMPCR) 5′-CGG GTT GCG TTA TAG GTC TG-3′) dapat mendeteksi
Salmonella sp. yang ditunjukkan dengan hasil amplifikasi fragmen DNA
berukuran sekitar 204 pasang basa. Sebanyak lima sampel yang diperiksa,
terdeteksi Salmonella sp. sebanyak tiga sampel yaitu sampel 4, 19, dan 35. Hasil
positif yang diuji pada metode PCR menunjukan hal yang sama pada hasil uji
biokimiawi. Penelitian ini menunjukan bahwa uji biokimiawi memerlukan waktu
yang cukup lama dibandingkan menggunakan metode PCR.
Tabel 4 Persentase prevalensi Salmonella sp. pada reptil
Asal Sampel
Ular
Kadal
Biawak
Labi Labi
Total
Total Sampel
24
11
4
1
40
Sampel Positif
3
0
0
0
3
Persentase Prevalensi
12.5%
0%
0%
0%
7.5%
Prevalensi keberadaan Salmonella sp. pada 40 sampel reptil yang diuji pada
penelitian ini didapatkan 7.5% mengandung bakteri Salmonella sp. Berdasarkan
hasil penelitian, sampel positif Salmonella sp. yang didapatkan pada penelitian
ini, berasal dari reptil jenis ular (Ptyas mucosa, Ahaetulla prasina, dan
Boa contrictor). Menurut Schröter (2004), prevalensi kejadian Salmonella sp.
pada ular sangat tinggi terutama pada sampel fecal. Penelitian lainya telah
dilaporkan Scheelings et al. (2011) bahwa prevalensi Salmonella sp. pada ular di
dunia mencapai 92.5% dan 69.2% di Australia.
Persentase kontaminasi Salmonella sp. pada sampel swab disekitar kulit
kloaka reptil cukup rendah. Hal ini dapat disebabkan lingkungan kandang yang
bersih. Rendahnya persentase paparan juga dapat disebabkan oleh
ketidakmampuan Salmonella sp. berkompetisi secara baik dengan mikrob-mikrob
umum oleh karena itu pertumbuhannya terhambat dengan adanya bakteri-bakteri
13
lain (Saptarini 2009). Potensi kompetisi antar bakteri sering terjadi terutama
dalam mendapatkan nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan
perkembangan.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian, prevalensi keberadaan Salmonella sp. pada
sampel swab kulit di sekitar kloaka reptil khususnya pada reptil yang berada di
pet shop sebanyak 7.5%. Hasil positif didapatkan pada sampel yang berasal dari
ular.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi serotype
bahkan sub serotipe Salmonella sp. yang ditemukan pada reptil menggunakan
teknik labolatorium yang lebih mutakhir seperti sekuensing.
14
DAFTAR PUSTAKA
[BAM] Bacteriological Analytical Manual. 2007. Salmonella. [diunduh 2015 Mei
06]. Tersedia pada :
http://www.fda.gov/downloads/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/
Bacteriological%20AnalyticalManualBAM/UCM244774.pdf
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2008. Metode pengujian cemaran mikroba
dalam daging, telur, dan susu, serta hasil olahannya. SNI 2897:2008.
Jakarta (ID): Badan Standardisasi Nasional.
Geue L, Löschner U. 2002. Salmonella enterica in reptiles of German and
Austrian origin. Veterinary Microbiology. 84(1-2):79–91.
Gray TZ. 2011. Update: Reptile and Salmonella. Journal of Exotic Pet Medicine.
20(1):14–17.
Halliday T, Adler K. 2000. The Encyclopedia of Reptiles and Amphibians. New
York (USA): Facts on File Inc.
Harris JR, Neil KP, Behravesh CB, Sotir MJ, Angulo FJ. 2010. Recent multistate
outbreaks of human Salmonella infections acquired from turtles:
a continuing public health challenge. Clinic Infection Diseases. 50:554–559.
Khoiriyah A, Triyana, Ngatini. 2013. Bahaya Salmonella bagi kesehatan. Buletin
Laboratorium Veteriner (Velabo). 30(2):1-44.
Mitchell MA, Shane SM. 2001. Salmenella in reptiles. Seminars in Avian and
Exotic Pet Medicine. 10(1):25-35.
O’Shea M, Halliday T. 2001. Reptiles and Amphibians. London (UK): Dorling
Kindersley.
Pees M, Rabsch W, Plenz B, Fruth A, Prager R, Simon S, Schmidt V, Münch S,
Braun PG. 2013. Evidence for the transmission of Salmonella from reptiles
to children in Germany, July 2010 to October 2011. Euro Surveill. 18(46):110. [diunduh 2015 Jan 12]. Tersedia pada :
hhttp://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=20634.
Poeloengan M, Komala I, Noor SM. 2006. Bahaya Salmonella Terhadap
Kesehatan. Lokakarya Nasional Penyakit Zoonosis.
Radji M, Puspaningrum A, Sumiati A. 2010. Deteksi cepat bakteri Escherichia
coli dalam sampel air dengan metode polymerase chain reaction
menggunakan primer 16e1 dan 16e2. Makara Sains. 14(1):9-43
Ray B, Bhunia A. 2008. Fundamental Food Microbiology 4th Edition. Florida
(USA): CRC Press Tylor & Franciss Group.
Revolledo L. 2010. Salmonella, Colonization of gastrointestinal tract. Veterinary
Portal [Internet]. Veterinay digital [diunduh 2015 Jan 12]. Tersedia pada:
http://www.veterinariadigital.com/uk/noticia.php?id=14.
Saptarini K. 2009. Isolasi Salmonella spp. pada sampel daging sapi di wilayah
bogor serta uji ketahanannya terhadap proses pendinginan dan pembekuan
[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Selimovic BM, Babic T, Stojanovic P. 2010. Salmonella Enteritidis-Actualities
and Importance. Journal of Acta Medica Medianae. 49(3):71-75.
Scheelings TF, Lightfoot D, Holz P. (2011). Prevalence of Salmonella in
australian reptiles. Journal of Wildlife Diseases 47(1):1-11.
15
Schröter M. 2004. Pet snakes as a reservoir for Salmonella enterica subsp.
Diarizonae (serogroup IIIb). Applied and Environmental Microbiology.
70(1):613-615
Waltman WD. 1999. Methods for isolating Salmonella from poultry and the
poultry environment. dalam: A.M. Saeed edt. Salmonella enteric serovar
Enteritidis in Humans and animals. Iowa State University Press. Ames. US
pp. 419-432.
16
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama Erfiandini Eka Puspita dilahirkan di Baturaja Sumatera
Selatan tanggal 28 April 1993 dari ayah A Kohar Lutfi dan ibu Erna Hastuti.
Penulis adalah putri pertama dari tiga bersaudara. Penulis menempuh pendidikan
mulai jenjang TK Sandy Putra Telkom (1997-1999), Sekolah Dasar Negeri 08
OKU (1999-2005), Sekolah Menengah Pertama Negeri 01 OKU (2005-2008), dan
Sekolah Menengah Atas Negeri 04 OKU (2008-2011).
Tahun 2011 penulis melanjutkan pendidikan S1 di Fakultas Kedokteran
Hewan Institut Pertanian Bogor melalui jalur SNMPTN undangan. Semasa
perkuliahan, penulis aktif di beberapa organisasi diantaranya Himpunan Minat
dan Profesi Hewan Kesayangan dan Satwa Akuatik (2013-2014), dan Ikatan
Mahasiswa Kedokteran Hewan Indonesia (2013-2014). Penulis pernah menjadi
asisten praktikum Histologi Veteriner II pada tahun ajaran 2014/2015. Penulis
juga pernah meraih sebagai 10 besar mahasiswa berprestasi Fakultas Kedokteran
Hewan. Bulan Januari–Mei penulis melaksanakan Penelitian di Laboratorium
Bakteriologi Bagian Mirobiologi Medis, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan
Kesmavet (IPHK), Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (IPB)
dan di Balai Besar Penelitian Veteriner Bogor dengan judul Isolasi dan
Identifikasi Salmonella sp. pada Reptil.