BAB III Metode

18
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan April 2013 sampai dengan April 2014.
Sampel diambil dari itik dan ayam dari tempat penampungan unggas, pasar
unggas dan peternakan yang ada di 10 kecamatan di Kabupaten Subang yaitu
Binong, Ciasem, Cipeundeuy, Cipunagara, Compreng, Pagaden, Pusaka Negara,
Subang, Sukasari dan Tambak Dahan. Pengujian dilakukan di Bagian
Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesmavet, Fakultas
Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor
Alat dan Bahan
Sampel usapan orofaring dan kloaka diambil menggunakan cotton swab
steril. Media transport yang digunakan adalah brain heart infusion broth (BHIB)
dalam microtube 2 ml, larutan phosphate buffered saline (PBS) pH 7.2, sel darah
merah ayam 0.6% dan 1%, VND referensi (4 HAU) galur LaSota (koleksi FKHIPB) dan antiserum spesifik terhadap ND yaitu galur LaSota dan Komarov
digunakan untuk uji HI (koleksi BBPMSOH). Peralatan yang digunakan antara
lain biosafety cabinet (BSC) (Nuaire dan Esco), mikropipet, tips, vortex dan
alkohol.
Pengambilan Sampel
Usapan Orofaring dan Kloaka
Cotton swab dimasukkan ke dalam orofaring sambil diusap dan diputarputar, lalu dipatahkan dan dimasukkan ke microtube 2 ml yang berisi media BHIB.
Begitu juga dengan sampel usapan kloaka, terlebih dahulu daerah sekitar kloaka
yang kotor dibersihkan dengan kapas yang sudah dibasahi alkohol 70%, lalu
dengan cotton swab, kloaka diulas sambil diputar-putar kearah dorsal, kemudian
dipatahkan dan dimasukkan ke microtube 2 ml yang berisi media. Setelah itu
sampel dimasukkan ke dalam ice box dingin. Suhunya dijaga agar tetap dingin
(4–8 °C), sampai tiba di laboratorium untuk diuji.
Serum
Darah diambil pada masing-masing unggas yang telah diambil sampel
usapannya. Sebanyak 2 ml darah diambil dari vena brachialis menggunakan
syringe 3 ml, lalu didiamkan selama ± 30 menit pada suhu kamar, kemudian
disimpan selama 24 jam di dalam lemari pendingin (4 °C). Serum dipisahkan dari
19
endapan sel darah merah dan dipindahkan ke microtube 2 ml, selanjutnya
disimpan pada freezer (-20 °C).
Penggabungan (Pooling) Sampel
Penggabungan sampel usapan orofaring dan kloaka yang terdiri dari 5–7
individu per pool dilakukan berdasarkan jenis usapan, unggas, lokasi dan waktu
pengambilan sampel. Sebanyak 100 µl sampel diambil dari tiap sampel individu
dan dimasukkan ke dalam microtube 2 ml. Sampel pool selanjutnya digunakan
untuk uji rRT-PCR menggunakan primer matrix (M).
Isolasi RNA
Isolasi RNA virus dilakukan sesuai prosedur standar QIAamp® Viral RNA
Mini Kit (Qiagen). Sebanyak 0.56 ml buffer AVL dimasukkan ke dalam
microtube 1.5 ml, kemudian ditambahkan 0.14 ml sampel dan dihomogenkan
dengan vortex selama 15 detik. Lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit
dan disentrifugasi selama satu menit untuk menurunkan cairan yang menempel
pada dinding tabung. Selanjutnya ditambahkan 0.56 ml ethanol, dihomogenkan
dengan vortex selama 15 detik, lalu disentrifugasi selama 1 menit, kemudian
larutan dipindahkan ke dalam QIAamp column dan disentrifugasi dengan
kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Column dipindahkan ke dalam tabung
koleksi yang baru dan ditambahkan 0.5 ml buffer AW1 ke dalam column,
disentrifugasi 8000 rpm selama 1 menit dan column diletakkan ke dalam tabung
koleksi yang baru. Sebanyak 0.5 ml buffer AW2 ditambahkan ke dalam column
serta disentrifugasi kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 3 menit kemudian
column diletakkan ke dalam tabung microtube 1.5 ml. Langkah akhir,
ditambahkan 0.06 ml buffer AVE ke dalam column dan diinkubasi pada suhu
ruang selama 1 menit dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 8000 rpm
selama 1 menit. Hasil elusi RNA disimpan dalam microtube 1.5 ml pada suhu
-20 C.
Uji Real Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
(rRT-PCR) Matrix (M)
Protokol rRT-PCR yang digunakan adalah protokol National Veterinary
Services Laboratories (NVSL) (2005). Pembuatan master mix dilakukan secara
berurutan yaitu : RNAse-free dH2O 0.23 µl, buffer 2× 12.50 µl, primer forward
(20 µM) 0.5 µl, primer reverse (20 µM) 0.5 µl, probe (5 µM) 0.6 µl, detection
enhancer 1.67 µl dan yang terakhir ditambahkan enzim mix 25× sebanyak 1 µl.
Primer matrix (M) yang digunakan adalah matrix forward (M+4100), matrix
reverse (M-4220) dan probe (M+4169). Penambahan reagen uji rRT-PCR
dilakukan didalam biosafety cabinet (BSC) secara berikut : sebanyak 17 µl master
mix (MM) dimasukkan ke dalam tabung optik, kemudian ditambahkan 8 µl RNA
20
template hasil isolasi. Tabung ditutup dengan seal optik dan kemudian
dimasukkan ke mesin rRT-PCR Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
yang sudah diatur programnya sebagai berikut : (i) 1× (45 °C, 10 menit), (ii) 1×
(95 °C, 10 menit), (iii) 40× (95 °C, 10 menit; 56 °C, 32 detik; 72 °C, 10 detik).
Hasil rRT-PCR dianalisis menggunakan Applied Biosystems 7500 Real time PCR
System software version 1.4.0
Isolasi Virus Newcastle Disease dari Telur Ayam Berembrio (TAB)
Specific Pathogen Free (SPF)
Sampel usapan orofaring dan kloaka yang digunakan sebagai inokulum
adalah sampel individu unggas dari pool positif rRT-PCR matrix (M). Sebanyak
0.2 ml inokulum mengandung penicillin-streptomycin (200.000 i.u.)
diinkubasikan selama 30 menit pada suhu ruang (27 °C) disuntikkan pada ruang
alantois (allantoic cavity) TAB SPF. Telur kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C
selama 4–7 hari dan diobservasi 3 kali sehari untuk melihat viabilitasnya (OIE
2012). Isolat yang diperoleh dari cairan alantois dikonfirmasi kembali dengan
rRT-PCR matrix (M).
Uji Hemaglutinasi (HA)
Prosedur uji HA yang dilakukan adalah metode mikro (OIE 2012).
Sebanyak 25 µl PBS dimasukkan ke dalam plat mikro berdasar V pada sumuran
2–12 dari kolom A sampai kolom E. Pada sumuran 1, kolom A sampai F,
dimasukkan 50 µl suspensi virus. Pengenceran virus kelipatan dua dilakukan dari
sumuran 1 ke sumuran 2 (A–E). Pada sumur 2B dilakukan pengenceran 1/3 kali
dengan menambahkan 25 µl PBS, dihomogenkan dan dibuang sebanyak 25 µl.
Pada sumur 2C dilakukan pengenceran 1/5 kali dengan menghomogenkan dan
membuang 75 µl PBS, sumur 2D diencerkan 1/7 dengan menambahkan 127 µl
PBS dan sumur 2E diencerkan 1/9 kali dengan menambahkan 175 µl PBS.
Selanjutnya dilakukan pengenceran kelipatan dua dari sumuran ke-2 sampai ke
sumuran ke-12. Sel darah merah 1% sebanyak 25 µl dimasukkan ke setiap
sumuran. Kemudian digoyang menggunakan plat mikro shaker, didiamkan pada
suhu ruang (25–27 °C) selama 40 menit. Setelah itu diamati, hasil positif ditandai
adanya aglutinasi sel darah merah seperti butiran pasir, dan negatif jika terlihat
adanya aliran sel darah merah (running bottom/tear drop). Titer VND adalah
pengenceran tertinggi yang masih dapat mengaglutinasi sel darah merah secara
sempurna. Uji HA dilakukan pengulangan sebanyak 3×.
Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI)
Prosedur uji HI yang digunakan adalah metode mikro (OIE 2012). Uji HI
yang digunakan adalah cara beta yakni menggunakan virus tetap (tidak
diencerkan) sedangkan serum diencerkan. Phosphat buffer saline (PBS)
dimasukkan 25 µl ke dalam tiap sumuran plat mikrotiter berdasar V, kemudian 25
21
µl serum standar dimasukkan pada kolom sumuran pertama. Pengenceran
kelipatan dua dilakukan dari sumuran pertama sampai sumuran ke-12. Lalu
ditambahkan cairan alantois yang mengandung virus 4 HAU ke setiap sumuran.
Secara pelan digoyang dan plat diinkubasi pada suhu 4 oC selama 60 menit.
Suspensi sel darah merah 1% ditambahkan sebanyak 25 µl ke semua sumuran dan
dihomogenkan menggunakan mikroplate shaker dan diinkubasi pada suhu ruang
(25–27 °C) selama 40 menit. Setelah itu diamati, hasil positif ditandai adanya
hambatan aglutinasi (running bottom/tear drop) sel darah merah, dan negatif jika
terbentuk butiran seperti pasir. Titer HI ditentukan pada pengenceran serum
tertinggi yang masih terjadi pengendapan (hambatan aglutinasi). Uji HI dilakukan
pengulangan sebanyak 3×.
Uji Real Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
(rRT-PCR) Fusion (F)
Protokol rRT-PCR yang digunakan mengikuti prosedur NVSL (2005).
Pembuatan master mix dilakukan secara berurutan yaitu : RNAse-free dH2O 0.37
µl, buffer 2× 12.50 µl, primer forward (20 µM) 0.67 µl, primer reverse (20 µM)
0.33 µl, probe (5 µM) 0.45 µl, detection enhancer 1.67 µl dan yang terakhir
ditambahkan enzim mix 25× sebanyak 1 µl. Primer fusion (F) yang digunakan
adalah fusion forward (F+4829), fusion reverse (F-4939) dan probe (F+4894).
Setelah itu sebanyak 17 µl master mix (MM) dimasukan ke dalam tabung optik,
kemudian ditambahkan 8 µl RNA template hasil isolasi. Tabung ditutup dengan
seal optik dan kemudian dimasukkan ke mesin rRT-PCR Applied Biosystems
7500 Real-Time PCR System yang sudah diatur programnya sebagai berikut : (i)
1× (45 °C, 10 menit), (ii) 1× (95 °C, 10 menit), (iii) 40× (95 °C, 10 menit; 56 °C,
32 detik; 72 °C, 10 detik). Hasil rRT-PCR dianalisis menggunakan Applied
Biosystems 7500 Real time PCR System software version 1.4.0
Uji Waktu Elusi
Prosedur uji dilakukan mengikuti metode Ezeibe dan Ndip (2005).
Sebanyak 0.05 ml larutan PBS dimasukkan ke plat mikro pada sumuran 1–12,
kemudian ditambahkan 0.05 ml suspensi virus pada sumuran 1 dan diencerkan
kelipatan dua dari sumuran 1–11. Sebanyak 0.05 ml PBS ditambahkan ke
sumuran 1–12, diikuti dengan 0.05 ml suspensi sel darah merah 0.6% dan
dihomogenkan menggunakan shaker. Didiamkan pada suhu ruang (25–27 °C)
selama 40 menit, setelah terjadi hemaglutinasi, diamati lamanya waktu dari
munculnya hemaglutinasi sempurna pada pengenceran tertinggi sampai terjadinya
pengendapan sel darah merah kembali (elusi). Uji waktu elusi dilakukan
pengulangan 3×.
22
Analisis Data
Data dianalisis secara deskriptif dan statistik untuk menentukan standard
mean deviation (SD).
Rataan titer antibodi dihitung menggunakan geometric mean titre (GMT)
dengan rumus :
Log2 GMT = ( Log2 t1 )( S1 ) + ( Log2 t1 )( S1 ) + … + ( Log2 tn )( Sn )
N
Keterangan : N = Jumlah contoh serum yang diamati
t = Titer antibodi pada pengenceran tertinggi (yang masih dapat
menghambat aglutinasi sel darah merah)
S = Jumlah contoh serum yang bertiter t
n = Titer antibodi pada sampel ke-n
Koefisien variasi (coefisien variation/ CV) dari respon kekebalan
dinyatakan dengan rumus:
CV = S x 100%
Keterangan : CV = koefisien variasi,
S = simpangan standar,
= rata-rata titer antibodi