LAMPIRAN Lampiran 1. Pembuatan Medium MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar) Komposisi medium MRSA per 1000 ml: Peptone 10 g Lab-Lemco’powder 8g Yeast extract 4g Glucose 20 g Sorbiton Mono-oleate 1 ml Dipotasium hydrogen phosphate 2g Sodium acetate 3H2O 5g Triammonium citrate 2g Magnesium Sulphate 7H2O 0,2 g Manganese Sulphate 4H2O 0,05 g Agar 10 g pH 6,2 ± 0,2 Cara pembuatan: Sebanyak 6,2 g MRS Agar dilarutkan ke dalam 100 mL akuades dalam labu Erlenmeyer, dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer. Larutan tersebut kemudian dituangkan sebanyak masing-masing 5 mL ke dalam tabung reaksi, ditutup memakai cotton plug (sumbat kapas), dilanjutkan dengan sterilisasi menggunakan autoklaf 121 ºC tekanan 2 atm selama 15 menit. Kemudian disimpan pada cetakan papan miring sampai memadat. bio.unsoed.ac.id 25 Lampiran 2. Pembuatan Medium MRSB (deMann Rogosa Sharpe Broth) Komposisi medium MRSB per 1000 ml : Peptone 10 g Lab-Lemco’powder 8g Yeast extract 4g Glucose 20 g Sorbiton Mono-oleate 1 ml Dipotasium hydrogen phosphate 2g Sodium acetate 3H2O 5g Triammonium citrate 2g Magnesium Sulphate 7H2O 0,2 g Manganese Sulphate 4H2O 0,05 g Cara pembuatan: Sebanyak 5,2 Gram MRS broth dilarutkan ke dalam 100 mL akuades dalam beaker glass, dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer. Larutan tersebut kemudian dituangkan ke dalam labu Erlenmeyer, ditutup memakai cotton plug (sumbat kapas), dilanjutkan dengan sterilisasi menggunakan autoklaf 121 ºC tekanan 2 atmosfer selama 15 menit. bio.unsoed.ac.id 26 Lampiran 3. Pembuatan Medium SDA (Sabouraud Dextrose Agar) Komposisi medium SDA per 1000 ml: Sabouraud 200 g Dextrosa 20 g Agar 20 g Akuades 1000 ml pH: 5,6±0,2 Cara pembuatan: Akuades 1000 ml dibagi menjadi dua, Sabouraud dan Dextrose dilarutkan 500 ml akuades. Agar dilarutkan pada sebagian akuades pada kompor gas atau hot plate & stirrer. Setelah keduanya larut, kedua larutan dicampurkan dan diaduk sampai homogen. Setelah itu medium dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 1210C dan tekanan 2 atm. bio.unsoed.ac.id 27 Lampiran 4. Spesifikasi Bahan Dan Peralatan No. 1. 2. Nama Alat Autoclave Inkubator 3. 4. Timbangan analitik Labu Erlenmeyer 5. Tabung reaksi 6. Beaker glass 7. Cawan petri 8. 9. 11. Drugalsky Mikropipet dan tip Pipet ukur dan filler Jarum ose 12. 13. Kompor gas Pembakar spirtus 14. Object glass 15. 16. 17. Pipet tetes Rak tabung Lemari es 18. Statif dan buret 19. 20. Hot plate and stirrer Mikroskop 21. Gelas ukur 22. Pipet tetes No. 1. Nama Bahan MRSB 2. MRSA 3. 4. NA PDA 5. Alkohol 10. Merek/Tipe HL36AE IWAKI pyrex ®, Japan IWAKI pyrex ®, Japan IWAKI pyrex ®, Japan IWAKI pyrex ®, Japan IWAKI pyrex ®, Japan Rinnai IWAKI pyrex ®, Japan Kegunaan Sterilisasi alat dan bahan Memeram mikroba dengan suhu terkontrol Menimbang bahan-bahan penelitian Menampung larutan dan preparasi media Uji biokimiawi dan menummbuhkan mikroba Menampung larutan dan preparasi media untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme Meratakan suspensi Mengambil larutan Tempat Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Mengambil larutan atau suspensi bakteri Inokulasi bakteri pada media Memanaskan media Menciptakan kondisi aseptis Pengamatan mikromorfologi bakteri Mengambil reagen Meletakkan tabung reaksi Menyimpan media dan bakteri Mengukur kadar asam laktat Menghomogenkan media Lab. Mikrobiologi Melihat mikmorfologi sel bakteri mengukur volume suatu cairan Mengambil larutan Lab. Mikrobiologi bio.unsoed.ac.id Spesifikasi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Lingkungan Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Kegunaan Medium pertumbuhan bakteri asam laktat Medium pertumbuhan bakteri asam laktat Pengujian difusi agar Medium pertumbuhan Candida albicans Aseptis 28 No. 7. 8. 9. 10. 11. Nama Bahan Gram set Indikator phenolphthalein NaOH Bromcresol purple Medium Basal Spesifikasi 1% 1N Kegunaan Pewarnaan gram Titrasi Titrasi Indikator pH Uji fermentasi Karbohidrat bio.unsoed.ac.id 29 Lampiran 5. Dokumentasi Hasil Penelitian Hasil Isolasi BAL pada Media MRSA Hasil Pemurnian BAL Hasil Pengamatan Makromorfologi BAL bio.unsoed.ac.id Hasil Isolasi C. albicans pada Media SDA Hasil Pemurnian C. albicans 30 Hasil TPC Lac3V Hasil Pewarnaan Gram BAL bio.unsoed.ac.id 31 Lampiran 6. Hasil Pengukuran zona hambat SN, zona hambat STN, Kadar Asam Laktat, pH, dan TPC pada Kultur MRSB Lac3V Setelah Inkubasi 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32 dan 72 Jam Lama inkubasi (jam) Zona hambat netral (mm) Zona hambat tidak netral (mm) kadar asam laktat (%) pH 0 0 0 0.85 4 8 12 16 20 24 28 32 72 6 6.5 6.5 0 6 8 0 0 0 TPC 0.99 8 1.98 8 1.19 10 1.28 14.5 1.12 11.5 1.05 8 1.39 11 1.39 10 1.27 6.5 bio.unsoed.ac.id 32 (CFU/ml) (log sel) 5.78 1.67 x 106 6.22 5.73 1.76 x 10 6 2.36 x 10 6 2.78 x 10 6 2.99 x 10 6 3.27 x 10 6 3.02 x 10 6 2.92 x 10 6 2.70 x 10 6 2.56 x 10 6 5.06 4.67 4.64 4.63 4.60 4.59 4.57 4.55 6.24 6.37 6.44 6.47 6.51 6.48 6.46 6.43 6.40 Lampiran 7. Proses Biokimia Pembentukan Asam Laktat Oleh BAL Homofermentatif Glukosa Heksokinase Glukosa-6-fosfat Fosfoglukosa isomerase Fruktosa-6-fosfat Fosfofruktokinase Fruktosa-1,6-bifosfat Aldolase Gliseraldehid-3-fosfat Gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase 1,3-bifosfogiserat Fosfogliserat kinase 3-fosfogliserat Fosfogliserat mutase 2- fosfogliserat Enolase Fosfoenolpiruvat Piruvat kinase Piruvat Laktat bio.unsoed.ac.id 33 Lampiran 8. Proses Biokimia Pembentukan Asam Laktat Oleh BAL Heterofermentatif bio.unsoed.ac.id 34