DETEKSI SEL DONOR IKAN GURAME

III. BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2009 – Januari 2010. Tempat
penelitian adalah di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik,
Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK),
Institut Pertanian Bogor, dan Laboratorium Histologi, Departemen Anatomi
Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB.
3.2 Prosedur Kerja
Prosedur kerja dalam identifikasi sel gonad gurame pada larva nila ini
dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu menyiapkan ikan donor dan melakukan
pembedahan untuk pengambilan gonad, menyiapkan ikan resipien, transplantasi
sel, ekstraksi DNA, dan yang terakhir adalah amplifikasi DNA dengan PCR.
3.2.1 Pengambilan Gonad Ikan Donor
Ikan donor yang digunakan pada penelitian ini adalah ikan gurame
Osphronemus gouramy yang memiliki berat antara 500-600 gram. Pengambilan
ikan donor dengan berat 500-600 gram tersebut disebabkan karena ikan belum
mengalami kematangan gonad sehingga ikan masih banyak mengandung
spermatogonia di dalam gonadnya.
Ikan donor kemudian ditimbang dan dibedah untuk diambil gonadnya.
Gonad tersebut kemudian ditimbang untuk mengetahui jumlah sel yang terdapat
di dalamnya. Sebelum ditimbang, gonad terlebih dahulu dibersihkan dari lemak
yang menempel. Pembersihan gonad dilakukan di dalam laruran PBS. Setelah
dibersihkan dan ditimbang, lalu gonad didisosiasi. Disosiasi adalah suatu cara
untuk memisahkan ikatan antara sel yang satu dengan sel yang lainnya. Disosiasi
dilakukan di dalam larutan PBS yang mengandung tripsin 0,5%.
Sebelum melakukan disosiasi, terlebih dahulu menentukan kepadatan sel
per mikroliter dengan menggunakan rumus:
V = (Berat gonad x A) / Q
Ket :
V
= Volume pengenceran (µl)
Berat gonad = Berat gonad ikan donor yang digunakan (mg)
A
= Jumlah sel dalam 1 mg gonad (219.283 sel)
Q
= Jumlah sel yang diinginkan (sel/µl)
3.2.2 Pengambilan Gonad Ikan Resipien
Ikan resipien yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan nila
Oreochromis niloticus. Gonad diambil dari ikan nila dengan bobot 200 gram.
Berat gonad ditimbang dan kemudian didisosiasi menggunakan tripsin 0,5%.
Jumlah sel hasil disosiasi dihitung menggunakan haemocytometer di bawah
mikroskop. Setelah dilakukan perhitungan, sel gonad tersebut kemudian dibagi ke
dalam tabung mikro (1,5 ml) dengan kepadatan 10.000 sel/µl, 100.000 sel/µl,
1.000.000 sel/µl, 10.000.000 sel/µl, 100.000.000 sel/µl.
3.2.3 Pewarnaan Sel
Metode pewarnaan sel pada penelitian ini menggunakan PKH-26
(SIGMA). PKH-26 adalah penanda sel yang mewarnai membran sel sehingga sel
tersebut akan berpendar warna merah ketika diamati di bawah mikroskop
fluoresen filter merah. Tahap pertama dalam pewarnaan sel adalah dengan
melakukan disosiasi sel gonad yang akan diwarnai. Disosiasi dilakukan di dalam
larutan PBS yang mengandung tripsin. Setelah itu, sel dimasukkan ke dalam
tabung mikro 1,5 ml. Kemudian diluent dimasukkan ke dalam tabung mikro yang
berisi sel sebanyak 3 kali volume sel (1 sel : 3 diluent). Pewarna PKH-26
dimasukkan sebanyak 3 µl. Setelah pencampuran tersebut, sel di dalam tabung
mikro didiamkan selama kurang lebih 10 menit. Kemudian sel disentrifugasi
sebanyak dua kali dan supernatannya dibuang. Setelah itu, sel di dalam tabung
mikro tersebut diisi kembali menggunakan larutan PBS sebanyak volume awal.
3.2.4 Transplantasi Sel
Transplantasi sel dilakukan dengan menggunakan alat mikroinjektor
(mikroskop Stemi DV4, Zeiss). Sebelum melakukan transplantasi sel, terlebih
dahulu mempersiapkan ikan resipien yaitu larva nila berumur 2 hari, penyetingan
alat, dan mempersiapkan sel yang akan disuntikkan di dalam tabung mikro
(1,5ml) dengan kepadatan sel masing – masing 1.250 sel/µl, 2.500 sel/µl, 5.000
sel/µl, 10.000 sel/µl, 20.000 sel/µl, 40.000 sel/µl, 60.000 sel/µl, dan 80.000 sel/µl.
Hal ini didasarkan pada penelitian Okutsu et al. (2006a) yang menyuntikkan
10.000 sel PGC ke dalam larva ikan. Jumlah sel yang disuntikkan ke dalam
masing-masing larva adalah 1.250 sel, 2.500 sel, 5.000 sel, 10.000 sel, 20.000 sel,
40.000 sel, 60.000 sel, dan 80.000 sel.
Sel-sel yang berada di dalam tabung mikro sebelumnya sudah diberi
penanda fluoresen yaitu PKH-26. Setelah tahapan tersebut, larva siap untuk
disuntik. Jumlah larva yang disuntik sebanyak 10 ekor untuk masing-masing
perlakuan. Penyuntikan dilakukan pada bagian antara kuning telur dan dorsal. Hal
ini dilakukan karena diperkirakan pada bagian tersebut akan terbentuk gonad.
Larva yang sudah disuntik kemudian dipelihara di dalam akuarium
berukuran (20x20x30)cm dengan penambahan aerasi. Satu hari setelah
transplantasi, kolonisasi sel donor diamati menggunakan mikroskop fluoresen.
Selanjutnya DNA diekstraksi dari larva tersebut untuk digunakan dalam proses
amplifikasi PCR untuk deteksi sel donor.
3.2.5 Ekstraksi DNA
Pada penelitian ini ada beberapa sampel digunakan untuk ekstraksi DNA
yaitu sampel sel gonad gurame dengan kepadatan sel 1.250 sel/µl, 2.500 sel/µl,
5.000 sel/µl, 10.000 sel/µl, 20.000 sel/µl, 30.000 sel/µl, 40.000 sel/µl, 60.000
sel/µl, dan 80.000 sel/µl, kemudian larva yang sudah disuntik dan dicek di bawah
mikroskop fluoresen, dan yang terakhir adalah ekstraksi DNA dari campuran sel
gonad gurame dengan sel gonad nila dengan perbandingan 1:1 (10.000 sel
gurame: 10.000 sel nila), 1:10 (10.000 sel gurame : 100.000 sel nila) , 1:102
(10.000 sel gurame : 1000.000 sel nila), 1:103 (10.000 sel gurame : 10.000.000 sel
nila), dan 1:104 (10.000 sel gurame : 100.000.000 sel nila).
Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan kit isolasi DNA (Gentra,
Minneapolis, USA) sesuai dengan prosedur dalam manual. DNA hasil ekstraksi
dilarutan dengan 30 µl Sterille Destillated Water (SDW). DNA disimpan dalam
freezer suhu -20 ºC hingga akan digunakan.
Analisa kandungan DNA dilakukan dengan dua cara yaitu secara
kuantitatif dengan spektrofotometer GeneQuant (Pharmacia Biotech) dan
kualitatif menggunakan
elektroforesis. Absorbansi diukur pada panjang
gelombang 260 (λ260) nm. Kemurnian DNA diketahui dengan melihat rasio DNA
pada perbandingan absorbansi panjang gelombang 260 nm dengan 280 nm.
Kandungan DNA ditentukan dari pengukuran pada panjang gelombang 260 nm.
3.2.6 Amplifikasi DNA dengan PCR
Primer yang digunakan dalam proses PCR adalah primer spesifik GH, dan
primer β-aktin sebagai kontrol internal. Sekuen untuk primer GH adalah F1GH
(5’-TGTTCTCTGACGGCGTGGTT-3’)
dan
R1GH
(5’-GCAACAAA
AAACCACCAGAAAGAG-3’), sedangkan sekuen primer β-aktin adalah FBPA
(5’-GTGCCCATCTACGAGGGTTA-3’) dan RBP1 (5’-TTTGATGTCACGC
ACGATTT-3’) (Marlina, 2009).
Pada proses PCR, jumlah volume total yang digunakan adalah 10 µl yang
mengandung 1 µl 10x Ex Taq buffer, 1 µl dNTPs mix, 0,05 µl Ex Taq polymerase
(Takara Bio, Shiga, Japan), 1 µl DNA templat, 1 µl primer setiap primer, dan
volume sisanya adalah SDW (Marlina, 2009). Program PCR yang digunakan pada
penelitian ini adalah pre-denaturasi 94ºC selama 3 menit, denaturasi 94ºC selama
30 detik, annealing 58ºC selama 45 detik (untuk GH), annealing 63ºC selama 30
detik (untuk β-aktin), dan ekstensi akhir 72 ºC selama 3 menit (Marlina, 2009).