pendahuluan tinjauan pustaka

PENDAHULUAN
Asam urat merupakan senyawa kristal
yang memiliki kelarutan lebih kecil dari pada
senyawa alantoin. Pemeriksaan kadar asam
urat diperlukan untuk memonitor kondisi
kesehatan penderita asam urat sebagai
diagnosa terjadinya gagal ginjal. Pemeriksaan
asam urat biasa dilakukan di dalam
laboratorium dengan teknik spektrofotometri,
kolorimetri, dan elektrokimia (Lotfy 2008).
Pada umumnya pengukuran asam urat secara
klinis dilakukan dengan metode spektrofotometri Pengukuran menggunakan metode ini
berdasarkan pada oksidasi asam urat menjadi
alantoin dengan adanya enzim urikase
(Bergmeyer et al. 1974).
Urikase merupakan suatu katalis biologi
dalam reaksi oksidasi asam urat. Urikase telah
ditemukan pada mikrob, jamur, dan tumbuhan
tingkat tinggi. Beberapa mikrob dapat
menghasilkan urikase di antaranya Bacillus.
fastidiosus (Bongaerst et al. 1978) B. subtilis.
TB-90 (Huang dan Wu 2004) B.
thermocatenulatus
(Lotfy
2008),
Pseudomonas aeruginosa (Fattah et al. 2005).
Penggunaan urikase dalam pengukuran
asam urat memiliki kekurangan dari segi
penanganan enzim dan biaya. Oleh karena itu,
untuk mengatasi hal tersebut digunakanlah
mikrob penghasil urikase sebagai pengganti
enzim murni. Penggunaan mikrob memiliki
kelebihan di antaranya biaya yang dibutuhkan
lebih murah, lebih toleran terhadap pH,
mikrob lebih mudah didapat, dan diperbanyak.
Beberapa mikrob dari Bacillus telah
menghasilkan aktivitas urikase di antaranya B.
subtilis. TB-90 sebesar 11,4 Unit/mL dan B.
thermocatenulatus sebesar 1,25 Unit/mL.
Oleh karena itu, dilakukan pengembangan
untuk mendapatkan jenis mikrob lainya dari
Bacillus. Mikrob yang digunakan pada
penelitian ini adalah B. subtilis, B.
megaterium, dan B. cereus yang belum
diketahui aktivitas enzim urikase. Mikrob
tersebut dipilih karena mudah diperoleh,
diperbanyak dan menghasilkan amonia,
sehingga diharapkan mampu menghasilkan
aktivitas urikase lebih besar (Hall dan
Macvicar 1954).
Asam urat dapat digunakan sebagai
substrat dalam penentuan kinetika enzim.
Awalnya penentuan kinetika enzim dilakukan
menggunakan persamaan Michaelis-Menten,
dengan parameter yang ditentukan antara lain
Vmaks, Km, dan kkat. Akan tetapi, penempatan
data dengan persamaan ini memiliki
kelemahan, yaitu nilai Vmaks yang didapat
kurang tepat (Lehninger et al. 2004). Nilai
Vmaks yang lebih tepat dapat diperoleh dengan
transformasi aljabar persamaan LineweaverBurk, Eadie-Hofstee dan Dixon. Pada
umumnya nilai Vmaks dan Km dihitung melalui
persamaan
Lineweaver-Burk.
Hal
ini
dikarenakan persamaan Lineweaver-Burk
memiliki kelebihan, yaitu variable v dan [S]
berada pada sumbu yang berbeda (Voet et al.
2001). Kinetika urikase dilakukan dengan
memetakan variable v yaitu aktivitas enzim
urikase dan [S] yaitu konsentasi substrat asam
urat.
Penelitian ini bertujuan menentukan
kinetika urikase dari beberapa mikrob
Indonesia yang berfungsi dalam pengukuran
asam urat menggunakan metode spektrofotometri, serta mempelajari kestabilannya.
Selanjutnya penelitian ini diharapkan dapat
bermanfaat untuk aplikasi biosensor asam urat
menggunakan metode elektrokimia.
TINJAUAN PUSTAKA
Asam Urat
Asam urat adalah asam yang berbentuk
kristal yang merupakan hasil akhir dari
metabolisme purin. Kelebihan asam urat akan
menumpuk dalam darah dan urin sehingga
menghasilkan kristal natrium urat yang
menyebabkan pembengkakkan pada sendi.
Asam urat merupakan biomolekul penting
yang memperlihatkan tingkat ketidaknormalan
dan merupakan gejala penyakit gout dan
hiperurisemia (Lotfy 2008). Kondisi normal
asam urat dalam darah berkisar 0,13–0,46
mM, sementara dalam ekskresi urin berkisar
1,4–4,4 mM.
Pengukuran asam urat dapat dilakukan
secara enzimatik dengan menggunakan
urikase. Beberapa metode telah digunakan
dalam penentuan asam urat, salah satunya
yang umum digunakan adalah metode
spektrofotometri. Kecepatan reaksi pada
metode spektrofotometri ditentukan dengan
mengamati perubahan konsentrasi asam urat
menjadi alantoin yang dideteksi dengan
penurunan konsentrasi asam urat pada panjang
gelombang 293 nm dengan adanya enzim
urikase (Bergmeyer et al. 1974).
Asam urat dapat digunakan sebagai
substrat dalam penentuan kinetika enzim
urikase (Liao et al. 2006). Linearitas
konsentrasi asam urat menurut Zang et al.
(2005) memperlihatkan garis linear pada
konsentrasi asam urat 0,005–1,000 mM
dengan nilai Km 0,238 mM, sementara pada
2
biosensor menggunakan immobilisasi urikase
pada kulit telur memperlihatkan respon linear
pada 0,004–0,640 mM (Zang et al. 2007).
Urikase
Urikase adalah suatu enzim yang menjadi
bagian penting dalam metabolisme nitrogen.
Enzim ini secara spesifik berperan sebagai
katalis dari reaksi oksidasi asam urat menjadi
alantoin. Urikase mengkatalisis oksidasi
pembukaan cincin purin pada asam urat
menggunakan oksigen sebagai oksidator
untuk menghasilkan alantoin dan karbon
dioksida. Sementara oksigen terlarut menjadi
hidrogen peroksida yang dihasilkan setara
dengan kadar asam urat dalam darah (Fattah
2005; Arslan 2008).
O
(a)
NH
+ O2 + H2O
N
H
N
H
urikase
O
O
HN
O
asam urat
+ CO2 + H2O 2
O
N
H
(b)
(c)
Gambar 1 (a) B. subtilis, (b) B. megaterium,
dan (c) B. cereus.
H
N
O
penghasil enzim proteotik dan amilase (Toldar
2008). B. megaterium umumnya bersifat
mesofilik dengan suhu optimal antara 30–45
°C dan merupakan penghasil amidase
penisilin (Toldar 2009). B. cereus merupakan
bakteri yang bersifat fakultatif anaerob dengan
suhu optimum pertumbuhan berkisar 30–40
°C dan kadang memperlihatkan reaksi gram
negatif. B. cereus pada umumnya bertindak
sebagai penghasil antibiotik dan enzim
(Hatmanti 2000).
N
H
NH2
alantoin
Urikase sangat luas ditemukan dalam
vertebrata tetapi tidak ditemukan dalam
manusia (Zhou 2005). Menurut Alfredo et al.
(1988) urikase yang berasal dari spesies yang
berbeda memperlihatkan kesamaan berat
molekul dan jaringan yang identik.
Pertumbuhan urikase dipengaruhi oleh
penambahan asam urat pada media, sumber
nitrogen, sumber karbon, dan waktu inkubasi.
(Lotfy 2008).
Urikase dapat dihasilkan dari bakteri.
Bakteri penghasil urikase di antaranya adalah
P. aeruginosa memiliki aktivitas sebesar 7,1
Unit/mL (Fattah et al. 2005), Microbacterium
10 Unit/mL (Zhou et al. 2005), B.
thermocatenulatus 1,25 Unit/mL (Lotfy
2008). Pada umumnya aktivitas tersebut yang
dilakukan dengan metode spektrofotometri.
Bacillus
B. subtilis, B. megaterium, dan B. cereus
(Gambar 1) termasuk ke dalam kerajaan
Bakteria, filum Firmicutes, kelas Bacilli, Ordo
bacillales, famili Bacillaceae, dan genus
Bacillus. Bacillus merupakan bakteri gram
positif, berbentuk batang, hidup di tanah dan
air. Beberapa jenis Bacillus menghasilkan
enzim ekstraselular yang dapat meghidrolisis
protein dan polisakarida (Hatmanti 2000).
B. subtilis tumbuh di berbagai daerah
mesofilik dengan suhu berkisar 25–37 ºC pada
kondisi terdapat oksigen dan merupakan
Penelitian sebelumnya memperlihatkan
bahwa Bacillus merupakan sumber urikase
yang potensial. Menurut Rouf et al. (1968) B.
subtilis memiliki kemampuan untuk hidup
pada media asam urat sebagai satu-satunya
sumber karbon, nitrogen, dan energi dengan
menambahkanya secara berkala selama waktu
inkubasi. Asam urat sebagai media pertumbuhan
bersifat
sebagai
induser.
Penambahan sumber glukosa memperlihatkan
pertumbuhan yang lebih baik. B. subtilis
mengakumulasikan sedikit asam urat secara
intraselular. Sementara B. megaterium dan B.
cereus tidak dapat tumbuh baik pada media
minimal.
Menurut Kim dan Patterson (2003) bakteri
penghasil urikase ditandai dengan pengeluaran gas amonia dari bakteri tersebut. Hal ini
dikarenakan asam urat yang lebih dominan
dalam bentuk nitrogen diubah menjadi
alantoin oleh bakteri yang memiliki urikase.
Alantoin ini lebih lanjut dipecah menjadi
amonia oleh enzim lain di dalam bakteri
(Bacharach, 1957). B. subtilis, B. megaterium,
dan B. cereus menghasilkan gas amonia yang
dikeluarkan pada sistem ekskresi (Hall dan
Macvicar 1954) sehingga ada kemungkinan
bakteri tersebut memiliki urikase.
Kinetika Enzim
Enzim merupakan protein yang berfungsi
sebagai biokatalisator di dalam sel.
Mekanisme regulasi enzim dilakukan melalui
kontrol ketersediaan enzim dan kontrol
aktivitas enzim. Dalam kontrol ketersediaan
enzim, keberadaan enzim diatur oleh sel.
3
Pengaturan sintesis dan degradasi enzim
bergantung pada ketersediaan substrat dan
produk. Proses ini dapat berlangsung dalam
hitungan menit (pada bakteri) hingga jam
(pada organisme tingkat tinggi). Pada kontrol
aktivitas, aktivitas katalitik enzim dipengaruhi
oleh struktur sisi aktif tempat enzim dan
substrat berikatan (Voet et al. 2001).
Diketahui bahwa [E] adalah konsentrasi
enzim bebas dan [S] adalah konsentrasi
substrat bebas. Namun karena konsentrasi
substrat total lebih besar dari konsentrasi
enzim total, sehingga seluruh substrat adalah
bebas. kkat adalah tetapan reaksi orde pertama
(Turn Over Number) yang menunjukkan v
akan menaik terus sampai nilai maksimum
bila [S] meningkat (Voet et al. 2001).
[ ] ×[ ]
..........1)
=
Gambar 2 Pengaruh konsentrasi substrat
pada kecepatan awal reaksi
enzimatik.
[ ]
Vmaks akan diamati bila seluruh enzim
dalam bentuk kompleks ES. Vmaks akan sama
dengan kkat.[E]0 sehingga persamaan dapat
ditulis sebagai.
×[ ]
=
.........2)
[ ]
Peningkatan
konsentrasi
substrat
cenderung meningkatkan aktivitas enzim.
Persamaan 2 disebut juga persamaan
Michaelis-Menten. Kurva tersebut menunjukkan
aktivitas
urikase
menurut
persamaan Michaelis-Menten. Km merupakan
konstanta Michaelis yang menyatakan
konsentrasi suatu substrat pada saat reaksi
enzimatis mencapai setengah Vmaks. Sangat
sulit menentukan batasan harga dari Vmaks
secara langsung dari hasil plot v terhadap [S]
(Gambar 2), sehingga nilai Km tidak dapat
langsung ditentukan dengan cara ini. Nilai Km
dan Vmaks lebih tepat dapat diperoleh dengan
memanfaatkan transformasi aljabar persamaan
Linewaever-Burk (Persamaan 3) (Lehninger et
al. 2004).
=
+
...…3
[ ]
Persamaan 3 diperoleh dengan melakukan
kebalikan dari dua bagian persamaan 2.
Sehingga plot 1/v terhadap 1/[S] memberikan
garis lurus dengan slope Km/Vmaks dan intersep
terhadap sumbu x adalah –1/Km dan terhadap
sumbu y adalah 1/Vmaks (Gambar 3).
Gambar 3 Kurva Linewaever-Burk.
Kinetika enzim urikase dapat ditentukan
dengan metode spektrofotometri. Nilai Km
urikase pada ekstrak kasar B. fastidiosus
menggunakan metode spektrofotometri pada
panjang gelombang 293 nm sebesar 0,18 mM
(Bongaerts et al. 1978). Ekstrak kasar enzim
B. thermocatenulatus memperlihatkan nilai
Vmax sebesar 0.99 Unit/mL dan nilai Km
sebesar 0.25 mM (Lotfy 2008). Menurut Zang
et al. (2004), nilai Km urikase dari C. utilis dan
A. flavus berturut-turut sebesar 0,238 mM dan
0,05 mM menggunakan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 520 nm. Hasil
penelitian tersebut dapat disimpulkan bahwa
perbedaan nilai Km dipengaruhi oleh metode
pengukuran, sumber urikase dan media
pertumbuhan.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah
enzim urikase (EC 1.7.3.3 dari Arthrobacter
globiformis Sigma-Aldrich), sel B. subtilis, B.
megaterium, dan B. cereus (ketiga sel tersebut
merupakan koleksi laboratorium Genetik
Mikrobiologi, Puslit Biologi, LIPI), asam urat,
bufer borat (Lampiran 1), dan media
heterotrof (Lampiran 2).
Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis berkas ganda, pH meter,
sentrifuse.