BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Pemerintah pusat dan pemerintah daerah selain berkewajiban menjamin
keamanan produk obat dan makanan, saat ini juga mulai berupaya untuk
menjamin kehalalan produk obat dan makanan. Di Indonesia, sejak tanggal 25
September 2014, telah diterbitkan Undang-undang Jaminan Produk Halal (UU
JHP). Jaminan halal merupakan syarat keamanan bagi umat Muslim. Dalam
kaitannya dengan produk obat, makanan dan kosmetika, halal berarti produk
farmasetik, kosmetika, makanan, minuman yang diperbolehkan, legal dan sesuai
hukum Islam yang dapat dikonsumsi oleh seorang Muslim. Komponen nonhalal
salah satunya adalah turunan atau derivat babi yang banyak ditemui secara luas di
banyak sediaan komersial. Derivat babi yang dimaksud adalah daging babi, lemak
babi, serta gelatin yang berasal dari tulang dan kulit babi (Rohman dan Che Man,
2011).
Gelatin adalah protein yang berasal dari hidrolisis kolagen. Sifat gelatin
yang stabil, tebal dan lengket dimanfaatkan sebagai bahan pengikat dan pengental
berbagai produk makanan seperti permen karet, permen lunak dan marshmallows
(Jones, 1977). Gelatin di industri farmasi dimanfaatkan sebagai bahan pembuat
cangkang kapsul, tablet, granul, suplemen makanan, dan lain-lain termasuk dalam
proses coating obat (Jones, 2004). Meskipun gelatin yang diproduksi pabrik telah
diberi label asal bahan utama, namun tetap dibutuhkan suatu jaminan tidak
terjadinya kontaminasi dari derivat babi. Metode analisis yang dikembangkan
1
untuk menjamin deteksi dan kuantifikasi gelatin yang berasal dari babi sangat
diperlukan. Hal ini dikarenakan raw material gelatin rawan terhadap kontaminasi
silang dan pemalsuan (Riaz dan Chaudry, 2003).
Deteksi dan kuantifikasi kandungan DNA sapi dan DNA babi sebagai
bahan baku gelatin diperlukan bukan hanya karena alasan kepercayaan agama
tetapi juga karena alasan kesehatan (Cai dkk., 2012). Alasan kepercayaan agama
karena komunitas Muslim dan Yahudi dilarang mengonsumsi produk yang
mengandung babi. Dari sisi kesehatan, adanya kekhawatiran terhadap penyakit
bovine spongiform encephalopathy (BSE) yang disebabkan oleh hewan sapi, flu
babi, dan reaksi alergi yang terjadi pada beberapa konsumen yang sensitif (Azira
dkk., 2014).
Bahan gelatin dan cangkang kapsul dalam proses produksinya
mengalami denaturasi protein marker dengan temperatur dan pH yang ekstrim.
Analisis dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) menawarkan alternatif uji
untuk bahan yang mengalami proses produksi seperti tersebut di atas karena
stabilitas DNA yang lebih baik dibandingkan metode analisis protein lainnya
seperti metode enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Analisis PCR
merupakan analisis berdasarkan sekuen DNA dengan menggunakan primer yang
spesifik untuk berbagai spesies (Tasara dkk., 2005).
Dalam analisis dengan PCR, primer berfungsi sebagai penginisiasi reaksi
polimerisasi DNA sekaligus pembatas daerah yang akan diamplifikasi. Primer
yang ideal memiliki urutan basa nukleotida yang tepat berpasangan dengan urutan
basa target DNA yang akan diamplifikasi dan tidak menempel pada tempat
2
lainnya (Muladno, 2010; Sudjadi, 2008). Susunan primer yang benar merupakan
hal yang penting bagi keberhasilan reaksi PCR (Wang dan Seed, 2006). Primer
dengan target DNA mitokondria babi untuk autentikasi makanan telah dilakukan
beberapa peneliti yaitu sekuen sitokrom b oleh Ali dkk. (2012) dan juga Sahilah
dkk. (2012), sedangkan Karabasanavar dkk. (2014) menggunakan sekuen D-Loop.
DNA mitokondria diturunkan secara maternal sehingga membuat DNA
mitokondria unik dan dapat digunakan untuk membedakan antar individu
(Durham dan Chinnery, 2006; Murugaiah dkk., 2009).
SYBR Green dan probe TaqMan merupakan senyawa kimia yang paling
banyak digunakan untuk memantau amplifikasi yang terjadi pada setiap siklus
real time PCR. SYBR Green dinilai lebih mudah digunakan karena tidak perlu
merancang probe (Bio-Rad, 2006). Soares dkk. (2013) telah berhasil
mengembangkan metode SYBR Green real time PCR untuk mendeteksi dan
kuantitasi DNA babi dalam produk daging olahan.
Metode yang telah dikembangkan untuk analisis sumber gelatin adalah
sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electroforesis (SDS-PAGE) yang
dikombinasikan dengan teknik kemometrika principle component analysis (PCA)
(Azira dkk., 2014), HPLC yang digabungkan dengan principle component
analysis (PCA) dan kemometrika lainnya (Widyaninggar dkk., 2012; Raraswati
dkk.,
2013),
Fourier
transform
infrared
(FTIR)
spectroscopy
yang
dikombinasikan dengan teknik PCA (Hashim dkk., 2010), ELISA (Venien dan
Levieux, 2005), PCR dan Southern-hybridization menggunakan biochip (Sahilah
dkk., 2012). Analisis dengan Real Time PCR juga dilakukan oleh peneliti
3
Demirhan dkk. (2012) dengan menggabungkan primer spesifik DNA genom babi
dan Taq polimerase dalam satu kit (SureFood® Animal ID Pork Sens kit). Isolasi
DNA babi dilakukan dengan menggunakan kit DNA ekstraksi (SureFood® PREP
Animal system). Cai dkk. (2012) juga telah mengembangkan analisis
menggunakan TaqMan real time PCR dari primer spesifik sekuen DNA genom
sapi dan genom babi dalam gelatin dan cangkang kapsul.
Pengembangan primer yang belum pernah dipublikasikan dari DNA
mitokondria D-Loop babi menjadi salah satu tujuan penelitian ini. DNA
mitokondria D-Loop babi menjadi target yang menjanjikan untuk amplifikasi
PCR karena DNA tetap stabil meskipun telah terdegradasi (Karabasanavar dkk.,
2014). Primer didapatkan dengan cara merancang suatu primer menggunakan
software NCBI-Primer BLAST di website NCBI-Primer BLAST. Pada
perancangan primer ini didapatkan 5 kandidat primer seperti pada Tabel 1.
4
Tabel 1. Kandidat primer dari daerah D-Loop pada DNA mitokondria babi
No
1.
2.
3.
4.
5.
Template/
Urutan basa
Sekuen 5’-3’
Panjang
Produk
Tm
(°C)
%
GC
SC
S3C
AM040615/
F: 23-42
R: 157-176
F:
CGTATGCAAACCAAAACGCC
R:
TGCACGACGTACATAGGGTT
F:
CGTGCATTAACTGCTAGTCCC
R:
CAAGCGGGTTGCTGGTTTC
F:
TGCAAACCAAAACGCCAAGT
R:
TGCACGACGTACATAGGGT
F:
CGTATGCAAACCAAAACGCCA
R:
GCTTATATGCATGGGGACTAGC
F:
AGGAGACTAACTCCGCCATCA
R:
AATGCTTGTTTTGGTTGCAGGG
154
58.94
50.0
6
1
59.11
50.0
7
0
59.07
52.38
6
1
60.01
57.89
5
0
59.75
45.0
4
1
58.43
52.63
7
2
60.60
47.62
6
0
58.73
50.0
6
2
60.34
52.38
4
1
60.75
45.45
4
0
AF276935/
F: 170-190
R: 336-354
D16483/
F: 112-131
R: 243-261
D16483/
F: 108-128
R: 268-289
D16483/
F: 28-48
R: 81-102
185
150
182
75
Keterangan: F =forward, R =reverse, Tm =melting temperature, %GC =prosentase jumlah basa G
dan C, SC =self complementarity, S3C =self 3’complementarity, A =adenine, T
=thymine, G =guanine, C =cytosine.
Untuk konfirmasi apakah primer tersebut spesifik terhadap mitokondria
D-Loop babi atau tidak, maka dilakukan BLAST ulang seperti pada Lampiran 1.
Tahap selanjutnya dipilih 2 primer yang akan dipergunakan seperti pada Tabel 2,
dan dilakukan pemesanan ke PT. Genetika (Jakarta). Primer D-Loop 112 adalah
sepasang primer spesifik yang dapat mengamplifikasi fragmen mitokondria DLoop babi pada urutan basa ke 112-261, sedangkan sepasang primer D-Loop 108
adalah primer spesifik yang dapat mengamplifikasi fragmen mitokondria D-Loop
babi pada urutan basa ke 108-289.
5
Tabel 2. Primer hasil rancangan dari daerah D-Loop pada DNA mitokondria babi
Target
fragmen
Mitokondria
D-Loop
Primer
Sekuen
D-Loop 112
F: 5’-TGCAAACCAAAACGCCAAGT-3’
R: 5’-TGCACGACGTACATAGGGT-3’
D-Loop 108
F: 5’-CGTATGCAAACCAAAACGCCA-3’
R: 5’-GCTTATATGCATGGGGACTAGC-3’
Panjang
Produk
150
182
Keterangan: F =forward, R =reverse, A =adenine, T =thymine, G =guanine, C =cytosine.
Berdasarkan latar belakang tersebut di atas maka dapat dibuat rumusan
masalah sebagai berikut:
1. Perumusan Masalah
1. Apakah dua pasang primer yang telah dirancang dari daerah D-Loop
mitokondria dan telah dilakukan prosedur BLAST dapat mengidentifikasi
secara spesifik adanya DNA babi di antara DNA lainnya (sapi, ayam, tikus,
kambing, dan ikan lele) dengan metode real time PCR?
2. Apakah primer yang dirancang dari daerah D-Loop mitokondria tersebut
dapat digunakan untuk analisis DNA babi dalam cangkang kapsul
komersial?
2. Keaslian Penelitian
Penelitian untuk mendeteksi sumber gelatin yang pernah dilakukan
diantaranya adalah kajian penggunaan metode FTIR spectroscopy yang
dikombinasikan dengan teknik PCA. Model yang dikembangkan mampu untuk
membedakan sumber gelatin dari sapi maupun babi. Karakterisasi komponen
gelatin menggunakan daerah spektra FTIR 3290-3280 cm-1 dan pembuatan
model kalibrasi untuk analisis kuantitatif dilakukan pada daerah spektra 16601200 cm-1. Hasil PCA terlihat dari plot Cooman’s yang menunjukkan
6
perbedaan yang jelas antara sampel gelatin yang berasal dari sapi maupun babi
(Hashim dkk., 2010). Penelitian ini menggunakan gelatin murni dan tidak
dalam cangkang kapsul.
Metode PCR yang telah dikembangkan untuk analisis sumber gelatin dan
produk-produknya dilaporkan oleh Sahilah dkk. (2012) yang meneliti
kandungan DNA babi pada kapsul lunak dan kapsul keras yang dibeli di daerah
Selangor, Malaysia pada bulan Juni tahun 2009 sampai dengan bulan Juli tahun
2010. Penelitian dilakukan dengan metode PCR dan juga metode multiplex
PCR menggunakan tiga pasang primer yang selanjutnya dikonfirmasi dengan
analisis southern hybridization. Primer diperoleh dari OLIPRO dengan target
DNA mitokondria sitokrom b (cytb) dan gen actin. Dari hasil PCR, hanya
terlihat amplifikasi daerah sitokrom b dengan sensitivitas sebesar 1 ng DNA
genom per sampel. Hibridisasi dilakukan menggunakan OLIPRO porcine gene
biochip, dan hasil yang diperoleh mempunyai tingkat sensitivitas sebesar 0,1
ng DNA genom per sampel.
Penelitian mengenai analisis DNA babi dalam gelatin dan cangkang
kapsul menggunakan metode real time PCR juga dilakukan oleh Cai dkk.
(2012) yang meneliti DNA genom babi dan sapi dalam campuran gelatin dan
cangkang kapsul menggunakan probe Taq Man yang mempunyai target daerah
yang diamplifikasi spesifik pada DNA genom babi (forward: 5’-ATT TCC
ATC CCA CAG CCC-3’, reverse: 5’-AAC AGA TGC TGA CTC ACA GAC3’, probe: 5’-CCC AAC CCC CAA ACT GTC TCC T-3’) dan genom sapi
(forward: 5’-CTA AGA TCA TGG CAT CAG GTC C-3’, reverse: 5’-CCC
7
CAA AAT AAA GTC AGC CAC-3’, probe: 5’-TCC ACT GTT TCC CCA
TCT ATT TGC CA-3’). Terdapat pula penelitian Demirhan dkk. (2012) yang
menggunakan metode real time PCR untuk analisis asal gelatin dan gelatin
dalam makanan dengan menggabungkan primer spesifik genom babi dan Taq
polimerase dalam satu kit (SureFood® Animal ID Pork Sens kit). Penelitian ini
mengembangkan primer baru.
Pada penelitian ini akan dikembangkan primer baru pada sekuen
mitokondria D-Loop yang spesifik hanya untuk babi saja. Optimasi hasil
rancangan primer dan pengembangan metode SYBR Green real time PCR
dengan primer baru selanjutnya dilakukan konfirmasi pengujian spesifitas
primer terhadap gelatin yang berasal dari babi, sapi, dan ikan lele. Pengujian
sensitivitas dilakukan pada cangkang kapsul yang terbuat dari gelatin babi
100% dan campuran gelatin babi-sapi berbagai konsentrasi (sampai batas
deteksi terendah yang masih dapat teramplifikasi). Uji keterulangan dilakukan
pada cangkang kapsul yang terbuat dari campuran gelatin babi-sapi.
3. Urgensi Penelitian
Penelitian ini sangat penting dalam kaitannya dengan metode analisis
yang mampu mendeteksi dan mengkuantifikasi adanya DNA babi dalam
sediaan farmasetik terutama cangkang kapsul untuk menjamin kehalalannya.
Hampir 90% gelatin yang diproduksi berasal dari babi. Meskipun gelatin yang
diproduksi harus berlabel namun tetap diperlukan jaminan kemurnian dan
kemungkinan adanya kontaminasi silang dari bahan yang digunakan. Metode
8
analisis yang aplikatif sangat diperlukan untuk menjamin keaslian cangkang
kapsul terutama dari kontaminasi silang maupun pemalsuan.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini secara umum adalah untuk mengembangkan
metode analisa real time PCR untuk menentukan adanya DNA babi dalam
cangkang kapsul. Secara rinci tujuan penelitian ini adalah:
1. Untuk menguji dua pasang primer dari daerah D-Loop mitokondria yang
dirancang secara spesifik dan telah dilakukan prosedur BLAST untuk
mengidentifikasi adanya DNA babi di antara DNA lainnya (sapi, ayam, tikus,
kambing dan ikan lele) dengan metode real time PCR.
2. Untuk analisis DNA babi dalam cangkang kapsul komersial menggunakan
primer yang telah dirancang dari daerah D-Loop mitokondria secara real time
PCR.
9