Isolasi dan efektivitas promoter B-Aktin dalam

II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Transgenik
Salah satu pendekatan untuk perbaikan genetik organisme akuatik yang
muncul sebagai suatu disiplin ilmu tersendiri baru-baru ini adalah transgenesis,
yaitu proses transfer gen-gen asing ke inang yang baru (Lutz, 2001). Teknik ini
digunakan untuk mengintroduksikan karakter-karakter genetik yang baru atau
over-ekspresi ke suatu individu melalui introduksi gen asing yang disambungkan
ke genom inang dan diharapkan dapat diwariskan ke keturunannya melalui sel
gonad (Yoshizaki, 2001). Prinsip utama dari teknik transfer gen adalah
memasukkan
DNA
asing
ke
dalam
nukleus
suatu
sel
target
dan
menggabungkannya ke genom inang. Aplikasi teknologi ini sendiri dapat
meningkatkan kualitas ikan, seperti pertumbuhan, resistensi terhadap penyakit dan
adaptasi terhadap lingkungan yang ekstrim (Sarmasik, 2002).
Teknik transgenesis pertama kali dilaporkan sukses pada ikan koki
(Carassius auratus) di Cina pada pertengahan tahun 1980-an (Hulata, 2001).
Sejak saat itu, eksperimen mengenai transgenik telah dilakukan pada berbagai
laboratorium di seluruh dunia pada 35 spesies ikan yang berbeda (Anderson,
2004). Selanjutnya akhir abad ke-19 teknik ini berkembang pada strain-strain ikan
yang bernilai komersial dan difokuskan pada peningkatan pertumbuhan.
Kemudian cDNA hormon pertumbuhan dan sekuen-sekuen genom lebih dari 40
ikan telah diisolasi, dikarakterisasi dan digunakan untuk pembuatan konstruksi
gen ”all fish” untuk transformasi pada spesies ikan lain (Teufel et al., 2002).
Langkah awal dalam teknik transgenesis adalah mendesain dan membuat
suatu konstruksi DNA. Konstruksi DNA yang dapat menyandikan suatu protein
yang spesifik harus mengandung sekuen DNA yang bertindak sebagai promoter
dan terminator untuk menghasilkan suatu protein pada suatu jaringan spesifik,
pada waktu yang tepat dan pada konsentrasi yang cukup (Beaumont & Hoare,
2003) dalam proses transkripsi gen target (Lutz, 2001). Umumnya konstruksi gen
ini dihasilkan melalui pemotongan sekuen-sekuen DNA dari sumber-sumber yang
berbeda seperti mamalia, burung, insekta, bakteri dan virus yang ditransfer ke
embrio-embrio ikan melalui mikroinjeksi (Dunham, 2004). Penggunaan
4
konstruksi DNA ini ternyata menimbulkan beberapa masalah misalnya hal yang
tidak dapat diterima untuk ikan-ikan yang dikonsumsi manusia dan meningkatnya
resiko ekologi (Rajesh & Majumdar, 2006). Konstruksi DNA yang terdiri dari
sekuen-sekuen ”all-piscine” telah dilaporkan oleh beberapa peneliti. Salah satunya
penelitian yang dilakukan oleh Du et al. (1992) dalam Rahman & Maclean
(1999),
yang
menggunakan suatu
konstruksi gen (opAFPcsGH)
yang
mengandung gen GH salmon chinook (Oncorhynchus tschawytscha) yang
dikontrol oleh sekuen promoter protein antibeku dari ikan ocean pout
(Macrozoarces americanus) untuk menghasilkan transgenik salmon Atlantik
(Salmo salar). Peningkatan pertumbuhan ikan salmon transgenik tersebut
dilaporkan 2 sampai 6 kali lipat melebihi kontrol. Contoh lainnya, ikan hias strain
baru yaitu ikan zebra memiliki warna tertentu yang dapat terlihat pada kondisi
cahaya biasa dengan mengintroduksikan gen GFP (green fluorescent protein),
YFP (yellow fluorescent protein) dan RFP (red fluorescent protein) (Gong et al.,
2002).
Ikan dipertimbangkan sebagai kandidat yang paling baik untuk pemasaran
hewan transgenik pertama untuk konsumsi manusia (Zbikowska, 2003). Hal ini
disebabkan karena ikan memiliki banyak keuntungan dibandingkan dengan hewan
lain seperti mamalia, yaitu fekunditas yang tinggi, pembuahannya eksternal dan
perkembangan embrio yang dapat diamati dengan mudah. Selain itu proses
embriogenesis cepat melalui pembentukan dan tahap morfologi yang jelas karena
embrio transparan (Winkler et al., 1990; Iyengar et al., 1996). Penggunaan ikan
khususnya dalam penelitian juga dapat menurunkan eksploitasi mamalia secara
signifikan, mengurangi biaya dan waktu (Zbikowska, 2003).
2.2 Teknik Mikroinjeksi
Beberapa teknik transgenesis dapat digunakan untuk mengintroduksikan
fragmen DNA asing ke dalam embrio atau gamet spesies akuatik. Saat ini teknik
yang umum digunakan adalah mikroinjeksi, elektroporasi, dan transfer gen
dengan mediasi sperma (Tsai, 2003). Masing-masing teknik ini memiliki
keuntungan dan kerugian bergantung pada spesies hewan yang digunakan untuk
5
studi transfer gen. Contohnya mikroinjeksi dan elektroporasi saat ini digunakan
untuk transfer gen pada ikan yang bertelur, sedangkan teknik lainnya seperti
transfer gen mediasi vektor retroviral digunakan pada ikan yang melahirkan anak
(tanpa bertelur) (Sarmasik, 2002).
Mikroinjeksi merupakan teknik yang dipertimbangkan paling efektif
dalam transfer gen pada vertebrata tingkat tinggi seperti tikus dan domba. Dalam
teknik ini, transgen secara langsung dimikroinjeksikan ke dalam pronukleus telurtelur yang telah dibuahi (Sarmasik, 2002). Aplikasi
mikroinjeksi pada ikan
sendiri memiliki beberapa kelemahan seperti nukleus dari telur yang telah dibuahi
sangat sulit diidentifikasi di bawah mikroskop karena nukleus telur kecil dan
volume sitoplasma yang besar, korion telur yang sangat keras seperti telur pada
ikan salmon yang menyebabkan telur sulit ditembus oleh jarum mikroinjeksi
(Yoshizaki, 2001). Untuk mengatasi masalah-masalah ini, beberapa peneliti
membuat ikan transgenik dengan cara penyuntikan gen dengan jumlah copy yang
banyak ke dalam sitoplasma telur yang telah dibuahi sebagai alternatif
penyuntikan ke inti telur (Alimuddin et al., 2003). Untuk mengatasi masalah
korion telur yang keras, korion dapat dibuang dengan menggunakan proteinase
dan selanjutnya telur dapat disuntik dengan mudah (Ueno et al., 1994 dalam
Alimuddin et al., 2003). Selain itu, perkembangan embrio yang cepat setelah
pembuahan dan sel tunggal telur yang telah dibuahi dalam beberapa jam berubah
menjadi embrio multiseluler. Ini mengimplikasikan bahwa jika injeksi transgen
tidak dilakukan secepatnya dalam beberapa jam pertama, walaupun injeksi itu
berhasil akan menghasilkan ikan dewasa yang mosaik untuk transgen (Rahman &
Maclean, 1991). Umumnya transgen yang diinjeksikan pada tahap 1 sel dapat
terintegrasi ke dalam genom semua sel. Akan tetapi integrasi ini seringkali hanya
ada setelah beberapa kali pembelahan sel yang menghasilkan embrio yang tidak
membawa transgen atau disebut mosaik (Beaumont & Hoare, 2003).
2.3 Promoter
Promoter merupakan sekuen DNA yang terletak upstream (terminal 5’)
dari titik awal transkripsi suatu gen (Toha, 2001) yang berperan dalam mengatur
letak, waktu dan tingkat ekspresi gen yang akan muncul (Beaumont & Hoare,
6
2003).
Menurut Glick dan Pasternak (2003), suatu promoter yang kuat
merupakan promoter yang memiliki aktivitas yang tinggi terhadap RNA
polimerase yang mengakibatkan daerah yang berbatasan downstream
dicetak
secara teratur. Promoter inilah yang menjadi kekuatan gen untuk mengekspresikan
ciri-cirinya pada tingkat yang sangat tinggi dan juga potensial dalam
mempengaruhi gen yang lain dalam suatu organisme (Anderson, 2004).
Promoter pertama yang digunakan dalam bioteknologi ikan diisolasi dari
genom virus (misalnya Rous Sarcoma Virus (RSV), Simian Virus (SV40) atau
Cytomegalovirus (CMV)), mamalia (misalnya mouse metallothionein-1 (mMT1)), burung (misalnya promoter β-aktin dari ayam) atau katak Xenopus laevis (1αenhanced promoter). Tingkat ekspresi gen yang dihasilkan ternyata rendah
sehingga pencarian promoter-promoter ikan yang lebih efektif tetap dilakukan
secara intensif selama 15 tahun terakhir (Teufel et al., 2002).
Promoter β-aktin dari berbagai spesies ikan telah dilaporkan sebagai
promoter ubiquitous yang efisien dalam penelitian ikan transgenik. Promoter βaktin dari ikan medaka telah diisolasi dan dengan menggunakan gen reporter lacZ
menunjukkan ekspresi yang kuat pada ikan medaka, promoter β-aktin dari ikan
zebra juga menunjukkan hal yang sama setelah diinjeksikan pada ikan zebra
(Hwang et al., 2003). Kedua promoter di atas disebut sebagai promoter homolog
yaitu promoter yang menggunakan konstruksi gen homolog spesies yaitu donor
dan penerima berasal dari spesies yang sama, sedangkan promoter heterolog
adalah promoter yang menggunakan konstruksi gen heterospesies yaitu donor dan
penerima donor berasal dari spesies yang berbeda dengan ikan transgenik yang
dihasilkan (Rajesh & Majumdar, 2006). Berdasarkan beberapa penelitian
penggunaan promoter
homolog
menghasilkan ekspresi gen lebih
baik
dibandingkan dengan promoter heterolog. Seperti pada ikan zebra menggunakan
promoter β-aktin dari ikan kakap merah menunjukkan tingkat kelangsungan hidup
hanya 63% dibandingkan dengan penggunaan promoter ini pada spesies yang
sama tingkat kelangsungan hidupnya mencapai 95% (Kato et al., 2007). Menurut
Palmiter et al. (1982) dalam Nam et al. (2008), bahwa suatu promoter yang
berasal dari spesies yang berbeda (heterolog) kemungkinan tidak mengenal RNA
polimerase inang yang mengendalikan ekspresi gen. Selain itu, penggunaan
7
promoter heterolog secara potensial mengakibatkan regulasi ”feedback negative”.
Namun, beberapa promoter β-aktin heterolog yang telah digunakan dalam
penelitian transgenesis dapat menghasilkan ekspresi gen yang baik pada ikan uji
seperti penelitian yang dilakukan oleh Yoshizaki (2001) dengan menggunakan βaktin dari ikan medaka ternyata mampu mengekspresikan gen GFP yang kuat
pada ikan rainbow trout.
Faktor-faktor transkripsi yang mempengaruhi aktivitas promoter β-aktin
adalah boks TATA, boks CCAAT dan CC(A/T) 6GG atau motif CArG. Motif
CArG berperan dalam pengaturan ekspresi transgen (Takagi et al., 1994).
Menurut Liu et al. (1990), motif CArG berada pada 2 tempat, yang pertama ada di
antara boks CCAAT dan boks TATA, dan yang kedua berada pada intron 1. Motif
CArG ysng terletak pada intron 1 berfungsi sebagai peningkat (enhancer) dalam
aktivitas transkripsi. Boks TATA merupakan elemen yang umum dijumpai pada
sekuens promoter yang berperan sebagai tempat melekatnya (binding) RNA
polimerase pada saat transkripsi RNA akan berlangsung (Glick & Pasternak,
2003). Secara in vitro penghapusan boks TATA membuat promoter tidak aktif
dan pada in vivo aktivitasnya menurun (Quitschke et al., 1989). Selanjutnya
dikatakan aktivitas promoter β-aktin tergantung pada keberadaan elemen CCAAT,
dengan adanya elemen ini tingkat aktivitas tertinggi promoter β-aktin tercapai
(Quitschket et al., 1989).
Pembuatan konstruksi gen memerlukan promoter dengan elemen CCAAT,
boks TATA, motif CArG, ekson 1 dan intron 1 (Higashijima et al., 1997). Dalam
proses transkripsi mula-mula pra-mRNA yang besar disintesis, disebut
heterogenous nuclear RNA (hnRNA) yang di dalamnya terkandung bagian intron
yaitu ruas-ruas gen yang akan hilang pada mRNA fungsional (mature) dan ekson
yaitu ruas-ruas gen yang ditranskripsikan ke dalam mRNA fungsional (mature)
dan akan ditranslasi menjadi protein (Jusuf, 2001). Berdasarkan penelitian yang
dilakukan oleh Hwang et al. (2003), dari penderetan, ukuran dan variasi sekuen
antara ikan nila, ikan mas dan ikan medaka dalam intron, elemen promoter dan
ekson ternyata promoter β-aktin antara ketiga ikan ini terdapat kemiripan
nukleotida. Persentase homologi sekuen genom β-aktin ikan nila termasuk intron
1 adalah 54,7% dengan ikan medaka dan 48,9% dengan ikan mas. Namun, jika
8
dibandingkan dengan ekson 1 persentase homologi sekuen genom β-aktin ikan
nila adalah 86,8% dengan ikan medaka dan 74,1% dengan ikan mas. Hal ini
menunjukkan bahwa promoter β-aktin dari ikan nila memiliki homologi yang
lebih tinggi pada ikan medaka dibandingkan dengan ikan mas.
2.4 Gen Target GFP (Green Fluorescent Protein)
Promoter dikatakan efektif apabila gen target yang disambungkan ke
promoter dapat terekspresi dengan level yang tinggi. Menurut Iyengar et al.
(1996), gen penanda yang biasa digunakan dalam pengujian aktivitas promoter
yaitu
gen
chloramphenicol
acetyl
transferase
(CAT),
neomycin
phosphotransferase (NEO), -galactosidase (lacZ), luciferase, green fluorescent
protein (GFP), tyrosinase, dan melanin concentrating hormone.
Gen GFP
merupakan gen yang mengkodekan protein yang berpendar hijau dan dapat
divisualisasikan ekspresinya pada sel hidup dengan menggunakan sinar ultraviolet
(Chalfie, 1994 dalam Iyengar et al., 1996). Selain itu, gen ini tidak memerlukan
substrat tambahan untuk ekspresinya (Chalfie, 1994 dalam Iyengar et al., 1996).
Berdasarkan penelitian Yoshizaki et al. (2000) dalam Dunham (2004),
GFP pertama kali dapat diamati dengan menggunakan promoter rainbow trout
vasa-like gene pada tahap blastula, tetapi ekspresinya pada sel spesifik tidak
terdeteksi. Pada tahap pembentukan bintik mata, kira-kira 30% embrio transgenik
yang dapat mengekspresikan GFP dalam sel-sel bakal gonad dan meningkat
hingga 70% setelah penetasan. Sel-sel yang mengekspresikan GFP terletak pada
daerah genital. Selain itu ekspresi GFP dengan menggunakan promoter vasa
medaka dapat juga terdeteksi pada daerah ventrolateral usus halus pada tahap
sirkulasi darah, tetapi setelah penetasan pindah ke daerah gonadal (Kinoshita &
Tanaka, 2002 dalam Dunham, 2004).
Gen GFP awalnya diisolasi dari ubur-ubur (Aequorea victoria) yang
memancarkan cahaya hijau berpendar dengan kuat dan stabil. Perkembangan saat
ini, GFP telah dimutasi dan pendarannya menjadi lebih kuat, yaitu enhanced GFP
(EGFP) (Arai et al., 2001). Varian lain dari GFP juga telah diisolasi oleh Felts et
al. (2001), yaitu hrGFP (humanized Renilla reniformis Green Fluorescent
Protein) yang berasal dari Anthozoa (soft coral). Kelebihan dari hrGFP
9
dibandingkan dengan EGFP adalah memiliki intensitas pendaran lebih tinggi,
lebih konsisten, lebih rendah tingkat sitotoksisitasnya, kisaran stabilitas pH yang
lebih luas dan lebih resisten terhadap pelarut organik, detergen serta protease. Gen
GFP ini dinamakan humanized hrGFP karena dalam gen ini terjadi modifikasi
satu atau lebih kodon yang tidak sesuai menjadi susunan kodon yang cocok untuk
sel manusia.
10