MODUL 2 Sterilisasi dan Pembuatan Medium

MODUL
2
Sterilisasi dan Pembuatan Medium
POKOK BAHASAN :
1. Sterilisasi alat, medium/bahan, dan area kerja
2. Pembuatan medium tumbuh bakteri
TUJUAN PRAKTIKUM :
1. Mengenal persiapan dan pengerjaan teknik sterilisasi alat, bahan, dan area kerja untuk pekerjaan
mikrobiologi,
2. Mengenal persiapan, pengerjaan, dan jenis-jenis medium tumbuh bakteri laut
TINJAUAN PUSTAKA :
1. STERILISASI ALAT, MEDIUM/BAHAN, DAN AREA KERJA
Sterilisasi mikrobiologi adalah suatu proses mematikan mikrorganisme yang mungkin ada pada
atau di dalam benda. Secara umum ada empat teknik yang biasa digunakan untuk sterilisasi.
Pemilihan teknik sterilisasi didasarkan pada sifat bahan dan alat yang akan disterilisasi. Pada
teknik aseptis digunakan cara pembakaran dan bahan kimia. Cara lain adalah dengan
menggunakan panas dan penyaringan.
Sterilisasi dengan menggunakan panas dan kombinasi dengan uap air disebut sterilisasi panas
basah/lembab. Sebaliknya jika tanpa air disebut sterilisasi kering. Termasuk dalam jenis
sterilisasi kering jika digunakan sinar UV atau gas tertentu untuk sterilisasi.
Autoklaf (Autoclave)
Autoklaf merupakan alat sterilisasi yang sering digunakan. Alat ini bekerja dengan sistem
sterilisasi basah. Secara prinsip, cara kerja alat ini adalah sterilsasi dengan menggunakan uap air
pada suhu 1210C selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Atau lebih tergantung ketinggian tempat
terhadap permukaan air laut. Sterilisasi uap ini tergantung pada ; (1) sifat bahan atau alat, harus
dapat ditembus atau terkena uap secara merata tanpa mengalami kerusakan agar proses
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013
Page 1
sterilisasi berlangsung efektif, (2) kondisi sterilisasi harus bebas udara (vacuum), (3) suhu yang
terukur harus mencapai 1210C dan dipertahankan selama 15 menit.
Gambar : Proses Sterilisasi dengan Autoclave
Oven
Oven bersuhu tinggi (160 - 1700C) biasa digunakan untuk sterilisasi kering. Karakteristik
sterilisasi kering adalah suhu tinggi dan waktu sterilisasi yang lama (1-3 jam). Bahan atau alat
yang akan disterilisasi kering harus tahan panas dan tidak mengalami kerusakan pada suhu
yang digunakan dan disterilkan dengan cara membungkus, menyumbat atau meletakkannya
dalam wadah tertutup untuk mencegah kontaminasi ketika dikeluarkan dari oven.
Sterilisasi dengan Bahan Kimia
Bahan yang tidak tahan panas seperti plastik dapat disterilsasi dengan menggunakan gas etilen
oksida atau bahan kimia asam perasetat, formaldehid, dan glutaraldehid alkalin pada suhu
kamar selama 2-18 jam. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam sterilisasi kimiawi ini
adalah : (1) Bahan yang digunakan sebagai sterilisator harus benar-benar dihilangkan sebelum
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013
Page 2
alat digunakan dan biasanya memerlukan waktu yang cukup lama, (2) daya bakar bahan kimia
sterilisator, (3) persyaratan peralatan dan biaya pelaksanaan.
Penyaringan
Penyaringan merupakan teknik sterilisasi bahan cair pada suhu ruang dengan menggunakan
penyaring yang memiliki pori-pori kurang dari 0,45 atau 0,22 µm. beberapa bahan yang umum
disterilisasi dengan teknik ini adalah cairan serum, antibiotik, enzim, toksin larutan bikarbonat
dan medium sintetik tertentu.
Gambar : Perangkat Sterilisasi dengan Penyaringan
2. MEDIUM TUMBUH BAKTERI
Medium tumbuh mikroorganisme adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan
mikroorganisme di atas atau di dalamnya. Komposisi medium tumbuh bervariasi tergantung
mikrorganisme target yang diinginkan untuk tumbuh. Akan tetapi, secara umum ada
kebutuhan-kebutuhan dasar yang sama yaitu air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh.
Air
Air merupakan komponen utama karena organisme bersel tunggal membutuhkan air sebagai
penyusun utama protoplasma dan wahana bagi masuknya nutrien ke dalam sel dan keluarnya
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013
Page 3
sekresi dan eksresi dari dalam dan luar sel. Air juga membantu berlangsungnya reaksi-reaksi
enzimatik di dalam sel. Untuk media pertumbuhan air biasa digunakan adalah air suling atau
air hasil distilasi. Air sadah kaya ion kalsium dan magnesium yang dapat mengikat ion fosfat
yang terdapat pada medium yang mengandung pepeton atau ekstrak daging.
Sumber Karbon (Carbon/C Sources)
Sumber karbon untuk pertumbuhan dapat berupa karbon organik maupun karbon dioksida.
Organisme yang menggunakan karbon dioksida sebagai sumber karbonnya disebut organisme
autotrof sedangkan organisme yang menggunakan sumber karbon organik disebut organisme
heterotrof.
Sumber Nitrogen (Nitrogen/N Sources)
Sumber nitrogen bagi organisme dapat dibagi menjadi nitrogen anorganik dan nitrogen organik.
Organisme autotrofik menggunakan karbon anorganik sedangkan organisme heterotrof
menggunakan karbon anorganik berupa asam amino atau senyawa-senyawa protein intermediet
seperti peptida, proteosa dan pepton.
Micro-nutrients
Organisme juga memerlukan unsur mikro berupa logam agar pertumbuhannya normal.
Beberapa logam yang diperlukan di antaranya natrium (Na), kalium (K), magnesium (Mg),
mangan (Mn), besi (Fe), seng (Zn), tembaga (Cu), fosfor (P), dan kobalt (Co).
Derajat Keasaman (pH)
Derajat
keasaman
mikrorganisme.
media
atau
pH
medium
juga
sangat
menentukan
pertumbuhan
Umumnya mikrorganisme hidup pada kisaran pH netral (7) akan tetapi,
mikroroganisme patogen biasanya hidup pada pH alkalin.
Medium pertumbuhan mikroorganisme dapat dibagi menjadi dua jenis, medium sintetik dan
medium komplek. Pembagian tersebut didasarkan pada komposisi kimiawi medium. Medium
sintetik dibuat dari campuran bahan kimia dengan kemurnian tinggi dan jumlah diketahui
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013
Page 4
dengan pasti. Medium kompleks dibuat dari bahan-bahan organik kompleks seperti ekstrak
daging dan pepton.
Ditinjau dari tujuan penggunaannya, medium juga dapat diklasifikasikan menjadi medium
serbaguna (sebagian besar bakteri dapat tumbuh), medi selektif (hanya mikrorganisme tertentu
yang diinginkan dapat tumbuh) dan medium diferensial (untuk klasifikasi berbagai tipe bakteri).
Mikroorganisme juga dapat ditumbuhkan dalam medium berbentuk cair, setengah padat atau
medium padat. Bahan padat medium yang umum digunakan adalah agar-agar, selain itu dapat
juga digunakan untuk gelatin atau silika gel.
PROSEDUR PELAKSANAAN PRAKTIKUM :
1. STERILISASI ALAT, MEDIUM/BAHAN, DAN AREA KERJA
Alat :
 Autoclave
 Oven
 Bunsen
 Botol Semprot Alcohol
 Cawan Petri
 Erlenmeyer
 Tabung Reaksi
 Pipet Volumetrik
 Mortar Keramik
Bahan :
 Aquadest
 Alcohol Aseptis (70%)
 Spiritus
 Kertas Pembungkus/Al-Foil
 Kapas
 Kasa
 Tissue
 Plastik Tahan Panas
 Karet Gelang
 Kertas Label
Prosedur :
1. Bungkus rapi alat-alat gelas yang akan disterilisasi dengan kertas pembungkus/Al-Foil;
2. Khusus untuk sterilisasi dengan Autoclave, tempatkan alat dan/ medium yang akan
disterilisasi ke dalam plastik tahan panas;
3. Sterilisasi dengan Autoclave : (1) Buka tutup autoclave, (2) Masukkan aquadest ke dalam
Autoclave hingga penanda batas air, (3) Tempatkan alat dan/ medium ke dalam
Autoclave, susun rapi, (4) Tutup Autoclave, (5) Nyalakan Autoclave dan tunggu hingga
suhu mencapai 121 0C dan Tekanan sebesar 1 atm/ 15 lb (Kondisi Sterilisasi), jangan lupa
menutup katup uap Autoclave, (6) Mulai sterilisasi selama 15 – 20 menit, (7) Setelah selesai,
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013
Page 5
matikan Autoclave dan buka katup uap Autoclave, (8) Tunggu hingga tekanan turun
hingga 0 atm (suhu agak dingin), (9) Buka secara hati-hati penutup Autoclave, (20)
Keluarkan alat dan/ medium dari dalam Autoclave.
4. Sterilisasi dengan Oven : (1) Buka pintu Oven, (2) Tempatkan alat ke dalam Oven dengan
susunan yang rapi , (3) Tutup pintu Oven, (4) Setting suhu Oven : 160 – 170 0C, waktu : 60
menit, (5) mulai sterilisasi, (6) Setelah selesai, matikan Oven, (8) Keluarkan alat dari dalam
Oven.
5. Sterilisasi Area Kerja : (1) Bersihkan meja kerja dari alat/bahan yang ada di atasnya, (2)
Usap bersih dengan menggunakan tissue, (3) Semprot merata dengan Alcohol 70%, (4)
ratakan dengan tissue bersih, (5) Tunggu hingga kering, (6) Nyalakan Bunsen.
2. PEMBUATAN MEDIUM TUMBUH
Alat :
 Erlenmeyer
 Gelas Ukur
 Timbangan Analitik
 Spatula
 Batang Pengaduk Kaca
 Hot-Plate with Magnetic Stirrer
 Besi Magnet Stirrer
Bahan :
 Serbuk Nutrient Agar (NA)
 Serbuk Nutrient Broth (NB)
 Air Laut
 CMC
 Susu Skim (Skim Milk)
 Kalium Kromat (K2CrO4)
 Kertas Lakmus
 Kapas
 Kasa
 Tissue
 Plastik Tahan Panas
 Karet Gelang
 Kertas Label
Prosedur :
1. Timbang serbuk NA dan/NB sesuai dengan takaran dengan Timbangan Analitik;
2. Timbang bahan tambahan (CMC/ Skim Milk/ Kalium Kromat) sesuai dengan takaran
yang ditentukan dengan Timbangan Analitik;
3. Masukkan Serbuk Medium dan Bahan Tambahan ke dalam Erlenmeyer;
4. Masukkan Air Laut (sesuai volume takaran) ke dalam Erlenmeyer yang sudah berisi
Serbuk Medium dan Bahan Tambahan;
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013
Page 6
5. Aduk dengan menggunakan batang pengaduk kaca;
6. Stirring (di-stir) dengan bantuan Besi Magnet Stirer di atas Hot-Plate with Magnetic Stirre,
ukur pH sesuai yang ditentukan (adjusting pH dengan HCl/ NaOH), panaskan hingga
mendidih,
7. Sterilisasi dengan menggunakan Autoclave selama 15 menit.
8. Ketentuan Komposisi Medium sebagai berikut :
No
Keperluan Pengujian Bakteri
Jenis Medium
Komposisi
1
Sakarolitik
Padat/Agar
Nutrient Agar (NA) + 2% CMC
2
Proteolitik
Padat/Agar
Nutrient Agar (NA) + 2% Skim Milk
3
Absorbsi Logam Berat
Cair/ Broth
Nutrient Broth (NB) + 2 ppm K2CrO4
4
Kitinase
Padat/Agar
Nutrient Agar (NA) + koloidal kitin
PARAMATER YANG DIAMATI :
1. STERILISASI ALAT, MEDIUM/BAHAN, DAN AREA KERJA
Sterilisasi Autoclave
No
Jam Mulai Menyalakan Alat
Jam Mulai Sterilisasi
Suhu (0C)
Tekanan (lb)
Alat/ Bahan yang
disterilisasi
Sterilisasi Oven
No
Jam Mulai Menyalakan Alat
Jam Selesai Sterilisasi
Suhu (0C)
Waktu (menit)
Alat yang
disterilisasi
2. PEMBUATAN MEDIUM TUMBUH
No
Nama Medium
Komposisi Medium
Serbuk Medium
(mg)
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013
Bahan Tambahan
(mg)
Volume Akhir
(mL)
pH
Air Laut
(mL)
Page 7