KROMATOGRAFI PARTISI

KROMATOGRAFI PARTISI
Definisi : Teknik kromatografi berdasarkan partisi
komponen/solut antara fase diam cairan pada
permukaan penyangga padat dengan fase gerak
Fase diam tidak saling campur dengan fase gerak
Komponen terpisah karena masing-masing memiliki
koefisien partisi yang berbeda
KROMATOGRAFI PARTISI
Fasa diam: Cairan yang melapisi partikel penyangga
Penyangga:
kieselguhr, selulosa, silika gel , alumina
C8, C18
Fasa gerak: Cairan yang tidak dapat campur dengan fasa diam
tidak dapat teradsorpsi pada penyangga fasa diam
Sampel: Berbeda kelarutannya dalam fasa diam
Komponen yang lebih besar kelarutannya dalam fasa diam
tertahan lebih lama
Koefisien partisi (Kd) = [X]A/[X]B
● Nisbah konsentrasi zat terlarut dalam dua pelarut yang
tidak saling campur, pada saat kesetimbangan
● Berubah bila suhu berubah
konsentrasi zat terlarut dalam fasa diam
koefisien partisi = --------------------------------------------------konsentrasi zat terlarut dalam fase gerak
Bila suatu zat mempunyai Kd = 5  diperlukan fasa gerak
sebesar 5x volume kolom untuk mengelusi seluruh senyawa
keluar dari kolom
Volume kolom dibuat sekecil
mungkin sesuai dengan yang
benar-benar dibutuhkan untuk
pemisahan komponen
Semakin sedikit fase gerak yang diperlukan, semakin
sedikit pelarut yang harus diuapkan; proses pemekatan
semakin cepat
Ilustrasi mekanisme partisi (pemisahan )
dalam kolom, Koefisien Partisi dan Teori Pelat
P
A+ P
P
A
B
P
B+P
P
Analat mengandung A (Kd=1) dan B
(Kd=0,67), fasa mobil P
P
Jika masing-masing ada 1000 molekul, ada fase
gerak  masing-masing terpartisi
Asumsi : Vd =Vg
A : 500 pada fasa diam, 500 pada fasagerak
B: 400 pada fasa diam, 600 pada fase gerak
Elusi lebih lanjut(tambahan fasa gerak segar)
Zat terpartisi lebih
lanjut
Seluruh zat A maupun B terelusi terpisah
A250-250 (fd-fg)
B: 160-240 dan 240-360 (fd-fg)
Kromatografi partisi fasa normal
Fasa diam: hidrofilik
Fasa gerak : hidrofobik
Pasangan fasa diam dan fasa gerak: daya saling melarutkan
kecil
Kromatografi partisi fasa terbalik
Fasa diam: hidrofobik
Fasa gerak : hidrofilik
Pemisahan ion-ion logam
II
I
1
2
3
4
5
Solut A (nilai (Kd=1) terdistribusi dalam fase diam
(kolom I) dan fase gerak (kolom II)
A =1
A= 0,5 0.5
0.25 0.25
0.25
0.25
0.125
0.125
0.25 0.25
0.125 0.125
Soal :
Berapa fraksi A pada saat fase gerak “mengisi “ pelat no 4
Berapa untuk solut B bila Kd B = 0.6
Perkembangan
dalam kolom saat
dua analit
dipisahkan
Konsentrasi analit
pada berbagai jarak
dari titik injeksi
Kolom partisi
• Fase diam dan fase gerak merupakan zat
cair
• Pada kolom partisi umumnya suatu pelarut
tidak campur air diadsorpsi pada suatu
padatan inert, sebagai cairan fasa diam
• Larutan analit ditempatkan pada bagian atas
kolom, kemudian dicuci dengan pelarut
kedua hingga analit keluar dari kolom
• Pelarut kedua= fase gerak = eluen =bisa
berupa campuran pelarut mungkin juga
yang mengandung bufer
KROMATOGRAFI
ADSORPSI
MK KROMATOGRAFI I
D3 ANALISIS KIMIA
kuliah minggu ke 8
KROMATOGRAFI ADSORPSI
♦ Jenis dan sifat adsorbent
♦ Jenis dan sifat eluen
♦ Kelakuan kromatografi zat
♦ Reaksi samping pada kromatografi
♦ Kromatografi adsorpsi berbagai zat
Adsorbent
• Sifat :
1. Polaritas relatif : Kekuatan untuk
mengadsorpsi spesies tertentu.
2. Kapasitas adsorpsi : jumlah gr solut yang
dapat diadsorpsi per gr adsorbent
1.Polaritas adsorbent polar tertentu
(untuk mengadsorpsi gugus polar)
-COOH > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > =C=O >
-COOR > -OCH3 > -CH=CHUntuk Arang (charcoal)?
2. Kapasitas adsorpsi
Diuji dengan pewarna → jenuh
Arang aktif > silika gel > alumina asam >
alumina basa > Cr2O3 > ZnS > Al2O3 > CaF2 > CaO
Penggolongan adsorben ~ Kapasitas adsorpsi
meningkat
Lemah
Sukrosa
Pati
Inulin
Talc
Na2CO3
Medium
CaCO3
Ca3(PO4)2
Mg3(PO4)2
Kuat
Mg Silikat aktif
Alumina aktif
Arang aktif
Mg Oksida aktif
Hesse:
Charcoal > silika gel > floridin > alumina asam >
alumina basa > Cr2O3 > ZnS > Al2O3 > CaF2 > CaO
Adsorbent Anorganik
• Alumina Al2O3
- Kehalusan partikel ±7µ
- Biasa tercampur dgn Na karbonat & Nabikarbonat
Δ
Na aluminat
Na+ dapat ditukar dengan kation
Alumina basa
- Dicuci dgn asam HCl
Cl- dapat ditukar dengan anion

Bauksit Al2(OH)4
Alumina asam
Pemisahan hidrolisit chitin
gula
• Magnesia MgO
Pengganti alumina

Magnesium silikat

Kalsium hidroksida

Kalsium karbonat
Xantophyl, pigmen lain

Dikalsium fosfat
karoten

Trikalsium fosfat
enzim

Kalsium oksalat

Zinc karbonat

Silika gel
Gula, steroid
karotenoid
antraquinon
karotenoid
Sterol, asam lemak, gliserida,
karbohidrat, asam amino
Adsorbent Organik
Digunakan untuk pemisahan zat hidrofilik (asam
amino, asam nukleat, gula
●Selulosa & turunannya: Senyawa aromatik , pemanis,
asam ketokarboksilat,
antrakuinon
●Pati
● Sukrosa
● Manitol
● Dekstran
Adsorbent Spesifik
• Silika gel dengan lubang pori spesifik
Silika gel + zat (misal : metil orange)
• Kolom urea
Asam lemak rantai lurus → adsorpsi
Asam lemak bercabang → lewat
• Kolom histon
DNA teradsorpsi, RNA tidak
• Kolom selulosa + azofenols
enzim
ELUEN
Daya elusi ≈ adsorben
Adsorben polar
asam/basa > asam organik > piridin > air > metanol
> etanol > propanol > aseton > dikloroetana > etil
asetat > kloroform; dietil eter > diklorometana >
benzena; toluena > karbon tetraklorida >
sikloheksana > heksana > petroleum eter
Kemurnian eluen
Pengotor dalam eluen
Elusi terganggu
●Pelarut organik : Kering; redestilasi
●Pelarut yang mengandung peroksida:
Pada kolom alumina, peroksida tertahan
Fungsi fasa diam terganggu
●Pelarut berhalogen : Bila ada Na2CO3 /K2CO3
terbentuk HCl bebas
Kelakuan kromatografi zat
Proses kromatografi:
Interaksi fasa diam-zat-fasa gerak
Sifat adsorben (fasa diam), sifat zat,
dan sifat eluen berpengaruh
Posisi pita zat (pada kromatografi
kolom)/spot (pada KLT) bervariasi
Sifat Adsorbent dan Struktur Kimia Zat
yang diadsorpsi
Strain(1948): karotenoid
Posisi karotenoid pada kolom sukrosa, celite, magnesia
sukrosa
celite
magnesia
Zeaksantin
Zeaksantin
Rhodoksantin
Lutein
Lutein
Lycopene
Cryptoksantin
Cryptoksantin
Zeaksantin
Rhodoksantin
Rhodoksantin
Lutein
Lycopene
Lycopen
Cryptoksantin
β-carotene
β-carotene
β-carotene
α-carotene
α-carotene
α-carotene
….
β-karotena
α -karotena
……..
Likopena
OH
Zeaksantin
OH
OH
OH
Rubiksantin
OH
OH
Lutein
Sukrosa: afinitas terhadap OH- > ikt ganda berkonjugasi
Kriptoksantin (1 OH) teradsorpsi lebih kuat
daripada lycopene (+ 2 ikatan ganda) dan
rodhoksantin ( + 2 CO + 1 ikatan ganda)
Magnesia: afinitas terhadap OH- < ikt ganda berkonjugasi
α dan β-carotene (Δ posisi 1=)
Zeaksantin dan lutein (Δ posisi 1=)
terpisah
Lycopene(13=) teradsorpsi lebih kuat daripada
zeaksantin (11= , 2OH)
celite
sukrosa
magnesia
Susunan Kimia dan
Kromatografi
Kromatografi dengan media anorganik ~ adsorpsi
Daya untuk diadsorpsi : ~ ikatan ganda gugus OH
∑ Ikatan ganda ↑
∑ OH ↑
Adsorptivitas ↑
aldehid dan keton < alkohol
hidrokarbon < ester < keton/aldehid
Gugus fungsi
adsorbabilitas ↑
asam dan basa > alkohol, tiol > aldehid, keton >
zat berhalogen, ester > hidrokarbon tak jenuh >
hidrokarbon jenuh
R-COOH
R-CONH2
R-OH
R-NH2
R-NH-Ac
R-O-Ac
R-COOCH3
R-N(CH3)2R-O-B2
R-NO2
R-O-CH3
R-H
 Subtituen:
Halogen < nitro < arilamino < alkilamino < amino
<asilamina < OH rantai samping < OH inti
 Ikatan hidrogen menurunkan adsorbabilitas
H
H
O
2
H
H
O
CH3
6
O
CH3
H
CH3
O
CH3
5
O
4
O
O
HO
H3C
O
O
H
O
CH3
O
CH3
O
3
O
1
O
O
O
O
O
hidroksimetilantraquinon
Kekuatan adsorpsi 1<2; 3<4; 5<6
Zat manakah yang lebih kuat teradsorbsi pada silika:
2-nitroresorsinol dan m/p-nitrofenol
2-hidroksiantraquinon dan 1,4,5,8-tetrakudroksiantraquinon
CH3
Posisi Relatif Zona pada Kolom
• ~ adsorpsi ~ struktur kimia
sifat adsorbent
sifat eluen/solvent
1
2
3
4
• Efek solven → jenis
celite
sukrosa
petroleum/benzena klorofil b, neoksantin
p/b + 25% aseton neoksantin, klorofil b
1,2-dikloroetana
fukoksantin, violaksantin
petroleum +
0,5% metanol
violaksantin, fukoksantin
Posisi zona pada kolom
• Efek impuritis
Sedikit alkohol dalam solvent
sukrosa
petroleum
klorofil a, fukoksantin
petroleum +
0,5% amil alkohol fukoksantin, klorofil a
• Efek pH → senyawa polar
selulosa
amonia
fluorosein, bromofenol biru
asam/netral bromofenol biru, fluoroseein
• Efek konsentrasi
konsentrasi ↑
kecepatan gerak ↑
• Efek suhu
sukrosa
95O C
klorofil a, lutein
20O C
lutein, klorofil a
Reaksi Sekunder karena Adsorbent
• Alumina
Yang berisi alkali bebas reaksi sekunder
Saponifikasi
Auto oksidasi
Deasetilasi
Destruksi
Dekomposisi
Hidrasi
Transformasi
Isomerasi
gliserida
asam lemak
gula
vitamin A,K
insektisida rotenon
porifin
monosiklik keton bisiklik keton
10-nitroantron → 10-nitroantanol
Reaksi Sekunder
• Silika
Isomerasi
terpen hidrokarbon
monogliserida
sterol
• Charcoal
Aminolisis
asam amino
Oksidasi
asam amino
Dekomposisi
► PENGERTIAN
►SARINGAN MOLEKUL DAN JENISNYA
►ELUEN DAN SISTEM ELUSI
► APLIKASI KROMATOGRAFI EKSLUSI
PENGERTIAN
Kromatografi ekslusi/filtrasi/permeasi
Pemisahan molekul pada Kromatografi cairan
berdasarkan perbedaan ukuran , bentuk molekul
Sampel
Molekul kecilr
Molekul besar
Bila terlalu besar, tidak masuk
ke pori
eksklusi
awal
elusi
Ekslusi
Ditolaknya partikel karena ukurannya lebih
besar dari pori sehingga tidak masuk pori
Limit ekslusi
Batas ukuran molekul terbesar yang
dapat dipisahkan pori gel filtrasi,
(ukuran yang lebih besar serentak ke
luar kolom)
Limit inkslusi
Batas ukuran molekul terkecil yang
dapat dipisahkan pori gel filtrasi,
(ukuran yang lebih kecil dielusi
serentak ke kuar kolom)
♦ Sephadex lipofilik
○ Sephadex LH-20 dan LE-60
○ Bila diperlukan pelarut organik
○ Fasa gerak: digunakan untuk sistem buffer aq,
pelarut organik polar, campuran pelarut aq.
○ Fraksinasi lipid, steroid, asam lemak,
hormon, vitamin
MEDIA GEL FILTRASI/SARINGAN MOLEKUL
● Sephadex
♦ Cross linking (CL) dextran-epiklorohidrin
CL
Nomor G
Swelling
♦ Swelling (penggembungan) dipengaruhi oleh:
Derajat CL, Kekuatan ion,
Jumlah bahan organik modifier pH,
♦ Aplikasi: protein, peptida, asam nukleat,
polisakarida
♦ Kestabilan pada pH tertentu
G-10 sp G-25 stabil pada pH 2-13
G-50 sp G-200 satabil pada pH 2-10
♦ Fasa gerak: larutan garam aq
dekstran
Ephichlorohydrin
1kloro,2,3 ephoxypropana
● Sephacryl
♦ Dextran alil dan N,N'-metilena-bis-akrilamida
♦ Tersedia dalam bentuk pre-swollen
♦ Fasa gerak: mengandung pelarut organik,
surfaktan mis 1%SDS, urea 8M,
guanidin hidroklorida 6M
♦ sepachryl S-400 dan S-500: pemisahan polisakarida
dan makromolekul lain
♦ Sepachryl S-1000: pemisahan fragmen restriksi DNA,
polisakarida sangat besar,
proteoglikan
● Superdex
♦ agarosa dan dextran
♦ Fraksinasi protein dengan laju alir tinggi
● Biogel
♦ Biogel A: CL agarosa
♦ Biogel B: CL poliakrilamida
Kisaran
Bobot molekul
Sephadex
globular
Kisaran
Bobot molekul
linier
globular
linier
G-10
<700
<700
Sepharosa
G-15
<1500
<1500
6B/CL-6B
104 – 4x106
104 – 1x106
1000-5000
100-5000
4B/Cl-4B
6x104 – 2x107
3x104 – 5x106
2B/CL-2B
7x104 - 4x107
10x104 2x107
S-200 Spfn
5000– 25x104
1000-8x104
Medium
S-300 Spfn
10000-1.5x106
2000-4x105
Fine
S-400 Spfn
20000-8x106
10000-2x106
Superfine
S-500 Spfn
40000-2x107
S-1000 Spfn
5x105->108
G-25
Coarse
Medium
Fine
Superfine
G-50
Coarse
G-75
Sephacryl
1500-30000
3000-80000
Superfine
G-100
G-150
G-200
1000-150000
5000-150000
5000-600000
Superfine
1000-100000
4000-100000
5000-300000
Superfine
1000-50000
3000-70000
4000-150000
Superfine
500-10000
5000-250000
1000-200000
• Gel dengan kemampuan memisahkan pada
kisaran BM lebih rendah akan memiliki nomor G
lebih kecil untuk sephadex sementara untuk
sephacryl akan memiliki nomor S lebih tinggi
(benar atau salah)
• Kisaran BM pemisahan molekul untuk suatu tipe
gel tertentu lebih besar untuk molekul globular
dibandingkan molekul linier (benar atau salah)
Soal era create
Sephadex
● Ukuran partikel
40-120 μm (G-10, G-15, G75-200 bukan superfine)
100-300 μm (coarse), 50-150 μm (medium), 20-80 μm
(fine) dan 10-40 μm (superfine)
Coarse
Medium
Fine
Superfine
Untuk filtrasi yang perlu laju alir cepat
pada tekanan rendah
Untuk tujuan preparatif
Untuk kolom dengan resolusi
tinggi dan KLT
● Stabilitas kimia sephadex
○ tidak larut dalam semua pelarut (kecuali telah
terdegradasi)
○ Stabil dalam air, larutan garam, pelarut organik,
larutan basa dan asam lemah.
○ Pada larutan asam kuat, ikatan glikosida pada matrix
gel terhidrolisis
○ Tidak berubah sifat dalam HCl 0,1 M selama 1-2 jam,
dan dalam HCl 0,02M selama 6 bulan.
○ pereaksi yang bersifat oksidator merusak struktur gel
● Stabilitas fisika sephadex
○ dapat disterilisasi, 30 menit, 120oC.
Pemanasan dengan T>1200C sephadex rusak
membentuk karamel
○ Derajat ikatan silang tinggi (G-10 dan G-15),
kaku, hanya untuk laju alir rendah
○ Derajat ikatan silang rendah (G-200 & G-150)
dapat dipadatkan
● Sifat kromatografis sephadex
○ selektivitas
Tiap tipe G punya batas kisaran BM berbeda
▪ Molekul dengan BM>limit ekslusi tertinggi,
tidak ditahan, keluar lebih dulu
▪ Molekul kecil masuk ke pori gel, ditahan dan
keluar lebih dulu yang berukuran besar
▪ Molekul-molekul < limit eksklusi terkecil,
masuk ke pori gel, ditahan sangat lama dan
keluar paling akhir tanpa pemisahan jelas
○ Penyimpangan sifat
• Molekul kecil pada G dengan ikatan silang tinggi
(G-10 & G-15) mengalami penyimpangan elusi,
tidak selalu seperti aturan elusi
•Ada interaksi ionik dan interaksi aromatik
Senyawa aromatik
berinteraksi dengan
sephadex & terelusi
paling akhir
(Interaksi bertambah bila
pelarutnya metanol dan
etanol)
Gugus karboksil pada
sephadex ; interaksi
dengan contoh bermuatan
Zat bermuatan positif ditahan,
negatif keluar (tidak ditahan)
Diatur dengan mengubah
kekuatan ionik dan pH,
dapat dihilangkan dg
pelarut fenol-asam asetatair & urea 8M
Dihilangkan dengan
pelarut
berkekuatan ionik
tinggi (>0,02M)
APLIKASI KROMATOGRAFI EKSKLUSI
● Analisis campuran molekul dengan BM berbeda
○ Pemisahan rafinosa, maltosa, glukosa, menggunakan
sphadex, pH 7 laju alir 5 ml/menit, eluen H2O
○ Pemisahan berbagai protein/enzim
○ Pemisahan asam nukleat dari nukleotida
● Desalting
○ Pembebasan garam dan senyawa berBM rendah dari
molekul makro
● Penentuan Bobot molekul
○ Bobot molekul protein, dextran, etilenaglikol
sukrosa
250
3,0
230
2,5
190
170
2,0
150
130
1,5
110
90
Blue dextran
70
104
105
Bobot molekul
106
Gambar: volume eluesi sebagai fungsi dari
bobot molekul protein pada
sephedex G-200, pH 7,5
1,0
Ve/V0
Volume elusi (mL)
210
Kurva kalibrasi untuk penetapan bobot molekul
pada kromatografi ekslusi
Preparasi Kolom Filtrasi Gel
● Sephacryl, superdex, superosa, sepharosa
Preswollen tapi mengandung etanol20%
sebagai pengawet
Perlu dilarutkan dalam eluen sebelum
dimasukkan ke kolom
● Sephadex, Bio-Gel-P
Harus digembungkan/dikembangkan dulu
dengan eluen dalam waktu tertentu
Jenis gel
Volume
pack
(ml/g ±10%
Waktu hidrasi (jam)
20oC
100oC
Sephadex G10
2-3
3
1
Sephadex G15
2,5-3,5
3
1
Sephadex G25
4-6
6
2
Sephadex G50
9-11
6
2
Sephadex G75
12-15
24
3
Sephadex G100
15-20
28
5
Sephadex G150
18-20*; 20-30
72
5
Sephadex 200
20-25*; 30-40
75
5
Bio-GelP-2
3
4
Bio-Gel P-4
4
4
Bio-Gel P-6
6,5
4
Bio-Gel P-10
7,5
4
Bio-Gel P-30
9
4
Bio-Gel P-60
11
4
Bio-Gel P-100
12
4
Saringan Molekul Anorganik: Zeolit
Struktur Zeolit:
○Molekul tetrahedral yang bergabung, ada rongga
rongga besar yang dihubungkan oleh saluran kecil.
○Penampang lintang saluran kecil menentukan ukuran
molekul yang dapat masuk ke rongga
○ Ukuran & posisi ion logam (mis Na, Ca) dalam kristal
zeolit & jaringan rangka tetrahedral alumina silikat zeolit,
menentukan diameter efektif saluran kecil
○Tipe zeolit
◊ tipe saringan molekular 4A: [Na12(AlO2)12(SiO2)12
molekul <4A spt H2O, CO2, H2S, SO2 dan hk 2C
masuk ke rongga
◊ tipe saringan molekular 5A: 4A yang punya K & Ca
sbg pengganti Na)
Etana, alkohol 4C, nasuk rongga
Siklopropana , senyawa aromatik tidak masuk rongga
◊ tipe 10X dan 13X: Na8(AlO2)80(SiO2)106
Soal kromatografi Ekslusi
• Waktu hidrasi dipengaruhi oleh suhu saat hidrasi
dilakukan, makin tinggi suhu makin lama waktu yang
diperlukan (benar atau salah)
• Bila ingin membuat kolom Sephadex G25 dengan
ketinggian 15 cm pada kolom gelas dengan diameter 1,5
(a) berapa gram sephadex yang dibutuhkan
• Jawab : volume = luas diameter x tinggi kolom = R2 =
3.14 x 0.75 cm x 0.75 cm x 15 cm = 26.5 ml ; volume
paking 4-6 ml/g untuk menghasilkan 26,5 ml gel jadi
diperlukan = 26,5 ml x 1 gram resin kering/4-6 ml  =
4.4-6,6 gram
• (b) berapa jumlah tersebut bila diameter kolom 3 cm
Soal era create
Soal
Polifinil standar dengan berbagai bobot molekul
dianalisis melalui kromatografi ekslusi mengasilkan
data sebagaimana pada tabel
Suatu sampel yang mengadung polyfinil dianalisis
dan menghasilkan volume retensi sebesar 8.45
Perkirakan bobot molekul sampel
Soal penetapan bobot molekul dengan
kromatografi ekslusi
• Suatu kolom sephadex
G-70 dengan dimensi 25
x 35 cm2 memberikan
hasil sebagai Tabel
berikut :
• Tentukan bobot molekul
suatu zat yang terelusi
dengan volume eluen
76.5 ml
protein
Mr
Ribonuklease 13.700
Volume
eluen
(ml)
109.5
Aldolase
158.000 55.0
Blue dextran
2 x 107
Ovalbumin
4.7 x103 71.8
53.1
Pemisahan protein dengan
kromatografi ekslusi
protein
Mr
Volume eluen (ml)
Ribonuklease
13.700
109.5
Aldolase
158.000
55.0
Blue dextran
2 x 107
53.1
Ovalbumin
4.7 x 103
71.8
KROMATOGRAFI
PERTUKARAN ION
PERTEMUAN MINGGU 12,13 14
D3 KIMIA 2009
KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION
•
•
•
•
•
PRINSIP
BAHAN PENUKAR ION
PEMILIHAN PENUKAR ION
REGENERASI PENUKAR ION
PEMBUATAN KOLOM PENUKAR ION DAN
APLIKASI SAMPEL
• PEMISAHAN SENYAWA BM RENDAH
• PEMISAHAN SENYAWA BM TINGGI
• KROMATOGRAFI PERTUKARAN LIGAN
PRINSIP KROMATOGRAFI
PERTUKARAN ION
• Pemisahan molekul bermuatan berdasarkan
kesetimbangan antar ion immobil dan ion mobil
dengan muatan berlawanan
• Ion immobil berikatan kovalen dengan matrik
polimer  fasa diam;
• counter ion
– menetralkan ion immobil
– dapat dipertukarkan dengan ion bermuatan
sejenis
• Penukar kation : ion immobil – /counter ion +
• Penukar anion : ion immobil +/ counter ion -
PRINSIP KROMATOGRAFI
PERTUKARAN ION
+
A-
A-
+
+
B+ B-
APA
+
+
3B-
+
PA
B++
PA = Penukar Anion
M+
M+
-
- N+
3A-
- N+
M+
PK
-
+ 3N+
PK = Penukar Kation
PK
-
N+
++
3M+
PRINSIP KROMATOGRAFI
PERTUKARAN ION
 PA suatu penukar anion; terdiri dari matrik yang
memiliki ion immobil (muatan + atau suatu
kation). Kation ini dinetralkan dengan cara
mengikat anion A- (suatu ion counter).
 Pada reaksi pertukaran anion A- digantikan oleh
anion B-, anion A- suatu ion mobil, B- pun
disebut ion mobil karena kemudian dapat ditukar
lagi dengan anion yang lain
  anion lain yang kekuatan pengikatannya
terhadap ion immobil lebih besar juga
selanjutnya dapat mengusir B- dari posisi terikat
(B lepas dari), demikian seterusnya dengan
anion-anion lainnya.
BAHAN KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION
 Resin
 Bahan fase diam dalam kromatografi pertukaran
ion berupa manik terbuat dari kopolimer
polistirena yang mengandung ikatan silang
(cross linkage) divinil benzen
 Suatu gugus bermuatan (gugus fungsional)
terikat pada matrik/resin menentukan sifat
bahan : sebagai PA atau PK; kuat atau lemah.
 Jumlah ikatan silang menentukan sifat bahan
resin, untuk pemisahan molekul Mr besar atau
kecil
BAHAN KROMATOGRAFI
PERTUKARAN ION
Resin sintetik pertama
• Diaplikasikan pada proses demineralisasi,
pengolahan air, recovery ion dalam limbah
• Matriks hidrofobik
• Crosslinking tinggi porositas kecil tidak bisa
untuk protein/makromolekul
Untuk biologi:
• selulosa, hirofilik, tidak merusak protein
• Kapasitas rendah
Contoh aplikasi PA dan PK pada
pengolahan/pemurnian air
Misal : Air
dengan ion Cldan Na+
Air dengan
OH- Na+
1
3
2
PA
Air dengan
OH- Na+
PK
4
Air dengan OH- H+
(air murni)
Pemurnian air dengan resin penukar ion
1. Reaksi pada kolom
penukar anion (PA)
2. Reaksi pada kolom
penukar kation
Rz+OH- +Cl-  Rz+Cl+ OH-
Rz-H+ + Na+  Rz-Na+
+ H+
Rz+ OH- : resin penukar anion dengan
counter ion OHRz+Cl : resin penukar anion dengan counter
ion ClTerjadi pertukaran ion Cl oleh OH-, air
yang keluar kolom tidak mengadung Cl-
PK ?
Bahan penukar ion
X
X
X
Gugus fungsional bermuatan +
atau Matrix : silika, resin (polistirena,
polieter) polisakarida (selulosa,
dekstran, agarosa)
berikut
Tabel : Penukar ion yang umum, jenis penukar,
matrik, gugus fungsi dan contoh produk
Penukar ion yang umum
tipe
matrix
Gugus fungsi
Asam
lemah
(PK)
As poliakrilat
Polistiren
Selulosa
Dextran
Agarosa
-COO-CH2COO-CH2COO-CH2COO-CH2COO-
Asam
kuat
(PK)
Polistiren
Dextran
Polistiren
Polistiren
-SO3-CH2-CH2-CH2-SO3-CH2-CH2-SO3-CH2-CH2-CH2-SO3-
Produk
komersial
Amberlite,
SP-Sephad
Poros S
Poros SP
Penukar ion yang umum
tipe
matrix
Gugus fungsi
Produk komersial
Basa
lemah
(PA)
Polistiren
Dekstrosa
Dekstran
Agarose
-CH2NH+R2
-CH2CH2NH+(CH2CH3)2
-CH2CH2NH+(CH2CH3)2
CH2CH2NH+(CH2CH3)2
Amberlite IR45
DEAE Sephacryl
DEAE Sepha
DEAE Sepha
Basa
kuat
(PA)
Polistiren
Selulosa
Dextran
-CH2N+(CH2)2
-CH2-CH2N+(CH2CH3)3
-CH2-CH2N+(CH2CH3)2
CH2-CH(OH)CH3
Kuarterner ionpolietilamin
Biorad AG-1
Cellex T
ClAE sephadex
Polistiren
Poros SP
Bahan penukar ion
•
•
•
•
Gugus fungsional bermuatan
Gugus asam kuat : RSO2O-, H+
Gugus basa kuat : R-N+(R’)3,OHTerionisasi sempurna
Gugus asam lemah : RCOO-,H+
Gugus basa lemah : amina (RN+H3,OH-)
sufonat gugus fungsional
pembentuk asam kuat ;
amonium kuarterner gugus
fungsional pembentuk basa
kuat  terionisasi sempurna
Karbonil gugus fungsional pembentuk
asam lemah; amina gugus fungsional
pembentuk basa lemah  terionisasi
sebagian, tergatung pH lingkungan
Gugus Fungsional Bermuatan
Bahan penukar ion
• Sifat penting penukar ion
• Jenis gugus : menentukan Tipe, kekuatan dan Kapasitas
• Gugus fungsi Penukar Anion (PA)
– amino etil (AE)
– dietilaminoetil (DEAE)
– quarternary aminoetil (QAE)
• Gugus fungsi Penukar Kation (PK)
– karboksimetil (CM)
– phospho
– sulphoproyl (SP)
penukar ion kuat terionisasi sempurna pada kisaran pH
yang luas, kapasitas tidak bergantung pH,
Bahan penukar ion
Gugus fungsi bermuatan
• AE
--OCH2CH2NH3+
• DEAE
--OCH2CH2NH+(CH2CH3)2
• QAE
--OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3
• CM
• Phospho
• SP
--OCH2COO--PO4H2--CH2CH2CH2SO3-
•
•
Soal Bahan Penukar ion :
Diketahui informasi suatu bahan penukar sebagai
berikut: kopolimer stiren divinil benzen, gugus
fungsional sulfonat contoh nama dagang Dowex 50 W
X8 (kopolimer stiren dengan DVB 8%). Benar atau
salah atau Mana yang benar dari pilihan berikut :
1. Jenis PK atau PA
2. Gugs fungsi kuat/ lemah
3. Lebih tinggi porositasnya dibandingkan kopolimer
yang sejenis dengan 20%DVB
4. Dapat menukar Mg2+, tidak menukar Cl5. Afinitas terhadap Cd2+> K+
6. Kapasitas total ~ jumlah HSO3-/ gram bahan
7. Suatu bahan hidrifob/hidrofil
8. Matrik penukar bahan alami/ bahan sintetik
9. Kapasitas total pada pH 5 = kapasitas pada pH 10
Kapasitas Pertukaran
• Kemampuan untuk mengambil counter ion yang
dapat ditukar
• Jumlah gugus bermuatan/gram penukar ion
(kapasitas total)
• Kapasitas tersedia = kapasitas yang benar-benar
ada saat perlakuan  dipengaruhi oleh
– Gugus fungsional (ascessibility)
– Konsentrasi eluen
– Sifat counter ion
– Selektifitas gugus fungsi
– pH eluen (terutama untuk penukar ion lemah)
Kapasitas Pertukaran
• Kapasitas break through = kapasitas satu
kolom, dipengaruhi oleh laju eluen,
kapasitas meningkat dengan menurunnya
laju.
• Ukuran butir juga mempengaruhi
kapasitas
Kapasitas Pertukaran
• PA atau PK kuat
– Kapasitas tak bergantung pH
– Kapasitas pertukaran tetap
– Sulfonat dan amonium quarterner
• PA atau PK lemah
– Kapasitas bergantung pH
– COO- (CM) : penukar kation bila pH cukup tinggi untuk
disosiasi –COOH  kisaran kerja pH 5 -14
– Amina tersier : penukar anion bila pH rendah (asam)
 gugus bermuatan + pada N  kisaran kerja pH 1 - 9
Kapasitas pertukaran
Ilustrasi Kapasitas tersedia dan kapaitas total:
• Suatu PK akan ditentukan kapasitas penukarannya
terhadap ion Cd2+ yang terdapat dalam dua contoh yang
berbeda, (1) air laut dan (2) larutan kadmium nitrat 50 ppm
• Kapasitas PK terhadap Cd2+ pada (1) > (2) sebab contoh 2
selain mengadung Cd2+ juga mengandung kation lain yang
sama-sama dapat terikat pada gugus fungsional, (PK tidak
selektif pada kation Cd)
• Bila digunakan PK lemah, kapasitas pada keduanya lebih
besar pada pH 10 dibandingkan pada pH 3 (pada pH
rendah ionisasi gugus fungsional pada matrik tidak
sempurna
• Asam sangat lemah tidak ditahan oleh resin penukar anion
dengan basa lemah
Kapasitas pertukaran
• Jumlah total ekivalen H+ yang
dipertukarkan per unit volume atau unit
massa resin
• Nilainya bergantung tahanan zat terlarut
sehingga hanya ion dengan kapasitas
tinggi saja yang digunakan untuk
pemisahan campuran yang kompleks/
karena kenaikan tahanan zat terlarut
Kesetimbangan pertukaran ion
• resin-H+ + K+
larutan
resin-K+ + H+
larutan
• Koefisien selektivitas kK/H
+
+
K K/H = (K )r (H )
(H+)r (K+)
• Afinitas (pengikatan K oleh resin) 
– muatan ion ( )
– ukuran ion tersovatasi (
– polarisabilitas ion ( )
)
Kesetimbangan
pertukaran ion
Faktor pemisahan (retensi relatif) = 
Misalnya K+ dan Na+ dengan resin-H+
K/Na
=
K/Na =
kK/H
kNa/H
kd1
kd2
= kK/Na
,
1, 2 = ion-ion
dalam campuran
Kasetimbangan pertukaran ion
Resin-H
NaCl
Resin-Na
HCl
Resin-H + NaCl  Resin-Na + HCl
Donnan : Kesetimbangan antara bagian
dalam resin dengan larutan di luar 
penggantian ion  swelling
Kesetimbangan pertukaran ion
Kation anorganik
• Afinitas gol IA dan IIA meningkat dengan
meningkatnya BA
• Hidrasi ion mengurangi afinitas
Anion Anorganik dan Organik
• Pada amberlite (poliamina) daya pertukaran
hidroksida>sulfat>kromat>sitrat>tartrat>nitrat>arse
nat>fosfat>molibdat>asetat=iodida=bromida>klori
da>fluorida
• Reaksi resin-Cl + Na-borat  semua Cl
terdesorpsi tanpa diganti borat
Aturan umum afinitas pertukaran ion
• Pada C rendah dan T biasa, berlangsungnya pertukaran
meningkat dengan meningkatnya valensi ion
Na+<Ca2+<Al3+<Th4+ (Th4+ tertinggi peluang diikatnya oleh
suatu PK)
• Pada C rendah dan T biasa, dan valensi ion sama,
pertukaran meningkat dengan meningkatnya nomor atom
ion  Li+<Na+<K+= NH4+<Rb+<Cs+<Ag+<Be2+<Mn2+<Mg2+=
Zn2+<Cu2+=Ni2+< Cs2+<Ca2+<Sr2+<Ba2+
• Pada C tinggi, perbedaan potensial pertukaran ion yang
berbeda valensi, berkurang bahkan adakalanya terbalik
• Pada T tinggi, dalam media non aq, atau C tinggi potensial
pertukaran ion yang bermuatan sama akan sama
Aturan umum afinitas pertukaran ion
• Potensial pertukaran oleh ion H+ dan OHbervariasi sesuai dg sifat gugus fungsi dan
kekuatan asam/basa yang terbentuk antara
gugus fungsi dan ion tsb. Semakin kuat asam/
basa, semakin rendah potensial pertukaran.
• Pada penukar basa lemah, urutan pertukaran
OH-> SO42-, CrO42->sitrat, tartrat > NO3-> AsO43>PO43->MoO4->asetat > I-, Br- = Cl-> F-.
Elusi
• Ion yang terikat pada resin dielusi dengan cara
– Displacement, oleh ion yang teradsorpsi lebih kuat
– Larutan pekat ion lain
– Pengkompleks
• Konstanta kesetimbangan distribusi ion antara larutan dan
resin  Kd Koefisien distribusi
Kd =
Ms/massa resin
=
Ml/vol. larutan
Ms
Ml
V-larutan
X
massa-resin
Ms dan Ml fraksi M dalam resin dan larutan
Faktor pemisahan  =
Kd1
Kd2
Regenerasi Resin
• Proses mengembalikan resin yang telah
digunakan ke kondisi semula/sebelum
digunakan
• Jumlah bahan organik yang tetap berasosiasi
dengan penukar ion setelah elusi: kolom dicuci
dengan buffer atau garam kuat mis (NaCl)
setimbangkan lagi
• Kontaminan yang terikat kuat/ permanen pada
resin  bagian tersebut dibuang
• Sisa resin dikeluarkan  cuci
Pengepakan kolom
Perhatikan bahan penukar ion :
1. Resin bekas jangan dibuangregenerasi 
simpan dalam wadah tertutup dan jaga tetap
lembab
2. Pre Swell resin sebelum dipakai.
3. Resin kering akan mengembang dalam air
(terutama 2x dan 4 x). Semakin tinggi derajat CL
makin rendah pengembangannya
4. Resin direndam dalam air sampai volumenya
tampak tidak bertambah lagi  udara terjebak,
lepas
5. Untuk pemisahan yang baik, gunakan resin yang
kecil, semakin kecil  pertukaran makin cepat.
Pengepakan kolom
6. Resin yg baru (dari botol) harus dibersihkan agar
didapat hasil yang reproducible. Resin Pa. tidak
perlu dibersihkan
Cara
Resin diekstraksi dalam soxhlet,
Mula-mula dengan HCl 2-3M, sampai ekstrak
jernih  dilanjutkan dengan NaOH 2-3 N, sampai
ekstrak jernih, dengan etanol 95% sampai
ekstrak jernih  bilas resin dengan air sampai air
bilasan netral dan bebas garam  jaga
kelembaban.
resin
3
Cara 1
Kolom diletakkan vertikal
1. Glasswool pd bagian bawah
2. Diisi air ½ kolom
2
air
3. Resin dimasukkan sedikit2
1
5
4
air
4. Air dialirkan balik udara
terusir
5. Aliran air dihentikan
6. Air yang berlebih
dikeluarkan  sisakan
setinggi 2 mm
Bubur resin
Cara 2
1. Glasswool pada
dasar kolom
2. Bubur kental resin 
15-30 ml pelarut/ g
resin kering, 6 ml
pelarut/ g resin basah
1
3. Pelarut bubur
dikeluarkan
3
Cara penyiapan Sampel
• Sampel padat bebas garam larutkan
dalam starting buffer  atur pH
• Sampel padat bergaram  larutkan dalam
starting buffer  dialisis atau lewatkan
pada media permeasi gel  molekul
besar bebas, garam terikat
• aplikasi
Aplikasi sampel
• Cara mengaplikasikan sampel ke kolom dapat
memengaruhi pemisahan
• Sampel tidak dalam kesetimbangan dengan
buffer awal bisa terjadi gradien garam  pola
elusi non reproducible
• Penambahan sampel tidak tepat puncak tidak
simetris & recovery berkurang
• V dan C tidak sesuai dg kapasitas kolom 
resolusi buruk
• Cara :
Aplikasi
Pemisahan senyawa ber-Mr tinggi
• Contoh pada pemisahan protein
– Mr besar,
– kestabilan ?
– Buffer anion (fosfat/asetat) bila pakai penukar
kation; buffer kation (tris) untuk penukar anion
• Elusi
– Gradien pH, bila pH > pI  protein lepas / utk PK
– Gradien garam selanjutnya perlu desalting
Aplikasi
Pemisahan senyawa ber-Mr rendah
Senyawa Mr rendah dengan muatan sama
• Kolom polistiren
• Kolom dengan partikel kecil
• Elusi  pompa
– Isokratik
– Gradien
• Eluen 
– ion
– gradien pH
Aplikasi
Pemisahan dan analisis asam amino dengan
Amino Acid Analyzer
•
•
•
•
Digunakan kolom penukar kation asam kuat
Cuplikan pada pH awal 2  asam amino +
Elusi gradien, pH naik,
Pada pH < pI asam amino sebagai kation, terikat
pada resin PK
• Pada pH ≥ PI a.amino netral atau negatif (anion)
maka tidak terikat lagi pada PK, terelusi
– Asam amino asam & netral keluar berurutan  pKa1.
– Asam amino basa keluar terakhir
• Deteksi : reaksi ninhidrin
Aplikasi
Pemisahan aldehida, keton, alkohol
• ~CO + ion H-sulfit senyawa lainterikat
kuat pada anion ex,
• alkohol + H-sulfit 
keton dan aldehid terpisah dari alkohol
• + air panas keton terpisah
• + NaCl, (aldehida keluar kolom terahir)
Aplikasi
Pemisahan asam
• kekuatan terhadap anion ex kuat  elusi
dengan asam kuat atau elusi gradien buffer &
pH menurun  asam paling lemah keluar paling
cepat
• Asam2 amino  kation ex  as amino pH < pI
 kation
• Asam dengan kekuatan berbeda
• Anion ex lemah  asam dengan Ka kecil 
sedikit terikat: bila Ka < K ex  asam bebas,
HCN, borat, fosfat, sulfat, HCl
Aplikasi
Pemisahan sakarida/gula
• Gula + ion borat kompleks (kestabilan =)
monosakarida > disakarida  terpisah,
mono-sk (heksosa, pentosa, tetrosa)
dipisah buffer borat gradien pH 7-10
•
Aplikasi
Kromatografi pertukaran ligan
• Bentuk lain aplikasi kromatografi pertukaran ion 
contoh pemisahan macam2 kafein sbb :
• Resin-Cu2+ pertama mengikat ligan NH3  ResinCu(NH3)42+
• Analat suatu ligan yg membentuk kompleks lebih
kuat lalu dialirkan  ligan NH3 terganti
• R-Cu(HN3)42+ + 4kaf  R-Cu(kaf)42+ + 4NH3
• Elusi dengan NH3 berlebih  pengusiran kafein
lagi : kafein yang kekuatan kompleksnya paling
lemah akan terelusi paling dulu
• R-Cu(kaf)42+ + NH3 (berlebih) R-Cu(NH3)42+ +
Kaf …
Polimer/matrik penukar ion
dengan gugus sulfonat
CH=CH2
CH-CH
n
n
SO3-
SO3-
Polistiren dg
gugus sufonat
Bahan Penukar Ion
Bahan Penukar Ion
Contoh Polimer /matrik
CH=CH2
CH-CH
n
n
stiren
polistiren
Bahan Penukar Ion
CL = Cross linkage
(= ikatan silang)
• Diperoleh dari kopolimerisasi
• Misal : divinil benzen (DVB) dan polistiren (PS)
CH
CH=CH2
CH
C2H
CH
CH2
CH
CH=CH2
+
stiren
CH2
CH2
CH=CH2
divinilbenzen
Dowex…X4 = polistiren
dengan 4% DVB
H2C-CH
HC-----CH2
C2H
Aplikasi pertukaran ion
• 3 kelompok aplikasi ; pengolahan air,
pemekatan dan pemisahan:
• Contoh terapan pemisahan:
• Dowex 2 untuk memisahkan campuran anion
halogen dengan urutan F-,C-l,Br-, I- dengan
NaNO3 pH 10,4 sebagai eluen
• Dowex 50 dan amberlite120 sulfonated untuk
pemisahan golongan alkali dan alkali tanah;
Li+,Na+,K+ dengan eluen HC l0,7 M
• Ca2+, Sr2+, Ba2+ eluen dengan eluen 1,2 M asam
laktat
Aplikasi pertukaran ion
• Pengaruh pH terhadap pemisahan asam amino
• Tiga bentuk asam amino saling berkesetimbangan yang
dipengaruhi pH, pada kondisi lebih basa dari PI asam
amino bermuatan negatif, sebaliknya pada pH < PI
• Asam amino bermuatan negatif dipertukarkan dengan
PA
H
R-C-C=O
ONH2
H
H
R-C-C=O
-H+
pH > pI
Bentuk anion pada pH .
> PI
NH3+
O-
+H+
R-C-C=O
NH3+
OH
pH < pI
pI
Bentuk kation pada
suasana lebih asam
Muatan bersih protein
+
PA
2
4
6
8
10
pH
PK
TITIK ISOELEKTRIK
PA penukar Anion
PK penukar Kation
Larutan contoh yang mengandung ion-ion: Mn2+, Ni2+, Co2+, Cu2+,
Fe3+, Zn2+.dilalukan pada kolom penukar anion Dowex 1. Ion ion
Co2+, Cu2+, Fe3+, Zn2+ membentuk kompleks bermuatan negatif
dengan ligan Cl-, Mg2+ dan Ni2+ tidak. Diketahui koefisien distribusi
berbagai ion kompleks tersebut sebagai fungsi konsentrasi larutan
HCl seperti gambar berikut (Gambar 16.7, Cristian,ed 4):
Bagaimana urutan pemisahan kation-kation bila campuran
tersebut dimasukan ke dalam kolom berisi Dowex 1 yang direndam
dalam HCl 10 M dan dielusi menggunakan eluen larutan HCl
dengan konsentrasi yang semakin kecil (elusi bergradien)
Fe
4 8
[HCl]
Co
4
Cu
8
4
Zn
Ni
8
[M]s
D = koefisien distribusi,
Mn
D=
[M]m
[M]s, konsentrasi ion logam
terikat di fase diam
[M]m konsentrasi ion logam
di fase gerak.
Jawab
• Ni2+ bukan anion, akan terelusi paling dulu
dalam HCl 12 M, kemudian Mn2+ terelusi dalam
HCl 6M, Co2+ pada HCl 4M, Cu2+ pada HCl
2,5M, Fe3+ terelusi pada HCl 0,5M dan Zn2+
pada konsentrasi 0,05 M.
Kesetimbangan pertukaran ion
[K+] pada resin
Koefisien distribusi, D
atau Kd =
[K+] pada larutan
[RSO3-B+]s[H+]
Kex = konstanta pertukaran = --------------------
[RSO3-H+]s[Na+]
Kex >>> afinitas resin terhadap B+ besar B+ diikat H+,
dilepas
Informasi label pada bahan penukar ion
• Contoh : Strongly acidic, sufphonic acid, Na +,
20-50 mesh, medium porosity/8X, 4, meq/g dry.
• Penukar kation, asam sulfonat, kation untuk
ditukar Na+, ukuran melewati 20 mesh, tidak
pada 50 mesh
• 8X  derajat ikatan silang, 8% DVB  porositas
medium
• Kapasitas pertukaran: 4,4 meq/g resin
Detektor kromatografi penukar ion
• Luaran suatu kolom penukar ion adalah
ion- ion analat  dapat dideteksi dengan
konduktometer
Asam, amino basa asam amino basa
•
•
•
•
•
•
•
Asam amino asam
Asam aspartat : R = CH2COOAsam glutamat : R = CH2-CH2COOAsam amino basa
Lisinina : R = (CH2)4NH2
Arginina : R = (CH2)3NHC(NH2)(=NH)
Histidina : R = CH2-C=CH
\ asama amino asam dan basa //
CH