DNA barcode, 25 Oktober 2013

DNA BARCODE KERAGAMAN GENETIK,
DAN KONSERVASI FAUNA INDONESIA
Oleh
M. Syamsul Arifin Zein
Peneliti Madya Bidang Genetika Molekuler
Laboratorium Genetika
Bidang Zoologi
Pusat Penelitian Biologi
LIPI
All Birds DNA barcoding Initiative (ABBI) of Inaugural
Workshop (USA, 2005)
Second International Barcode of Life
Conference (Taiwan, 2007)
Zein MSA et al. 2007. Initiative DNA Barcoding Research in Indonesia.
Second International Barcode of Life Conference, Taipei, Taiwan.
Sutrisno H. 2007. Molecular Phylogeny of Indo-Australian Glyphodes and its Allied
Genera (Lepidoptera: Crambidae) Inferred from Mitochondrial COI and COII and
Nuclear EF-Iα Gene Sequences. Second International Barcode of Life
Conference.Taipei, Taiwan.
ILUSTRASI DNA BARCODE
Dasar pemikiran, Tujuan, dan Hasil
Apa yang disebut DNA Barcode ???
Barcoding: adalah pendekatan standar untuk
mengidentifikasi tumbuhan dan hewan dengan urutan
minimal sekuen DNA, yang disebut barcode DNA.
(Barcoding is a standardized approach to identifying plants and animals by minimal
sequences of DNA, called DNA barcodes)
Barcode DNA:
Sebuah urutan DNA pendek, dari sebuah wilayah
yang seragam pada genom, yang digunakan untuk
mengidentifikasi spesies.
(A short DNA sequence, from a uniform locality on the genome, used
for identifying species).
DASAR PEMIKIRAN STANDARISASI
DNA BARCODE


Mempercepat pembangunan perpustakaan
referensi urutan DNA yang konsisten dan
komprehensif
Mempercepat pengembangan teknologi yang
ekonomis untuk identifikasi spesies
TUJUAN
AGAR SIAPAPUN, DIMANAPUN,
KAPANPUN DAPAT
MENGIDENTIFIKASI DENGAN
CEPAT DAN AKURAT SPESIES
DARI SPESIMEN APAPUN
KONDISINYA
DNA BARCODE FAUNA....?????
DNA GENOME INTI
DNA MITOKONDRIA
DNA INTI: Exon dan intron

Exon adalah sekuens DNA yang
ditranskripsi menjadi RNA dan ditranslasi
menjadi polypeptida (coding region)

Intron adalah sekuens DNA yang tidak
diubah menjadi RNA dan protein (Non
coding region)
DNA MITOKONDRIA

Genom DNA mitokondria berbentuk sirkuler, berisi 13 gen penyandi protein, 22 gen
transfer RNA (tRNA), 2 gen ribosoma (rRNA), dan daerah kontrol (control region/DLoop) dengan panjang sekitar 16.775 pasang basa (DESJARDIN dan MORAIS, 1990).
Mengapa barcode DNA Fauna dengan DNA mitokondria ?????
Mitokondria:
Merupakan organel yang memproduksi energi dalam sel tumbuhan dan
hewan, Dua puluh tahun penelitian telah menetapkan utilitas urutan DNA
mitokondria dalam membedakan antara spesies hewan yang berhubungan
erat.
Perbedaan antara spesies lebih besar



Jumlah copy:
Ada 100-10,000 lebih banyak salinan mitokondria dibandingkan DNA
inti per sel, membuat pemulihan, terutama dari sampel kecil atau
sebagian rusak, lebih mudahdan lebih murah
Relatif sedikit perbedaan dalam spesies
Dalam kebanyakan kasus, kecilnya perbedaan intraspesifik dan
besarnya perbedaan interspesifik merupakan sinyal batas genetik yang
berbeda antara sebagian besar spesies, memungkinkan identifikasi
yang tepat dengan barcode DNA mitokondria
Gen di DNA mitokondria
Semua merupakan daerah coding ( tidak diselingi intron dan extron
seperti pada gen inti), sehingga dapat amplifikasi langsung. Sedangkan
pada gen inti sering terganggu dengan daerah non coding (intron) yang
sering amplifikasi sulit dan tak terduga.
Results so far suggest that a
mitochondrial gene will enable
identification of most animal species.
Mengapa Standarisasi DNA Barcode Fauna
menggunakan COI ?
Menggunakan Gen Protein DNA Mitokondria:


Mendefinisikan wilayah standar dan membuat perbandingan antara urutan gen penyandi
protein yang mudah, karena gen protein umumnya tidak memiliki insersi dan delesi seperti
yang ada di dalam gen ribosom.
Mitokondria Gen penyandi protein pada DNA mitokondria umumnya mengandung
perbedaan lebih tinggi dari gen ribosom dan dengan demikian lebih mungkin untuk
membedakan antara spesies yang berhubungan erat.
KESEPAKATAN INTERNASIONAL DNA BARCODE
FAUNA
Menggunakan Gen COI DNA Mitokondria:
 Gen Cytochrome c oxidase subunit I (COI)
merupakan reprensentatif dari semua gen penyandi
protein DNA mitokondria
 Segmen dekat terminus 5’ dari COI sepanjang
sekitar 650 pasang basa merupakan daerah
yang digunakan sebagai barcode DNA untuk
fauna (Herbert et al. 2003)


COI terbukti memiliki variasi intraspesifik
rendah, tetapi interspesifik divergensinya tinggi
antara taksa yang berdekatan (closely allied
taxa) (Ward et al. 2005; Hajbabaei et al. 2006a).
Primer Universal Standard: (amplifikasi muda
dan hasil sekuen baik).
An Internal ID System for All Animals
The Mitochondrial Genome
DNA
D-Loop
Small ribosomal RNA
Cytochrome b
ND1
ND6
Typical Animal Cell
COI
ND5
mtDNA
L-strand
H-strand
ND4
ND4L
ND3
Mitochondrion
COII
COIII
ATPase subunit 8
ATPase subunit 6
ND2
DNA BARCODE PADA
MAMALIA
Universal Primer Mamalia:
FORWARD:
LepF1-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATATTG G3”
VF1-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC ACA ARG AYA3”
VF1d-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC ACA ARG AYA TYG G3”
VFli-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC AAA GAA TGG3”
REVERSE:
LepR1-tl: 5”cag gaa aca gct atg cta aac ttc tgg atg tcc aaa aaa tca3”
VR1-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt ggc cra ara ayc a3”
VR1d-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt ggc caa aga atc a3”
VRli-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt gcc aaa ac3”
(Ivanova et al. 2006). Mix 1:1:1:3
Primer untuk sekuensing: (Messing 1983)
M13F: 5”tgt aaa acg acg gcc agt3”
M13R:5”cag gaa aca gct atg ac3”
Hasil amplifikasi primer universal
Capillary Sequence Read
Barcode menegaskan
kesatuan dari spesies
Homo sapiens
Perbandingan menunjukkan
bahwa kita berbeda satu sama
lain dengan hanya 1 atau 2
nukleotida dari 648, sementara
kita berbeda dari simpanse
pada 60 lokasi dan gorila di 70
lokasi.
Teknik Molekuler untuk Identifikasi Spesies Ordo Cetartiodactyla
Menggunakan DNA Barcode (Zein MSA&Fitriana YS,2012)
ZooIndonesia:21(02):1-8.

112 spesimen, 4 famili, 10 marga and 15 spesies

Jarak genetik:
intraspesies :
interspesies :
intragenera :
intergenera :
intrafamily :
interfamili :

0-0,7% (0,13±0,05%)
2-28%
8,8-27,4 (1,36±0,037%)
8,8-27,4%
5,8-11,9% (7,8±2,85)
18,6-26,3%
Hasil rekonstruksi pohon filogeni Cetartiodactyla menunjukkan semua
spesies membentuk sebuah cluster kohesif yang jelas berbeda.
BARCODING DNA PADA SURVEI KOMUNITAS KELELAWAR PEMAKAN
SERANGGA DI INDONESIA
(DNA Barcoding in Surveys Microbat Communities in Indonesia)
(Zein and Fitriana)


Evaluasi pada
136 individu
6 Famili
45 spesies
Sekuen divergensi intraspesifik gen CO1 0.000 0,260.
Hipposideros papua.MG 3540
66
Hipposideros papua.MG 3542
88
Hipposideros papua.MG 3539
100
Hipposideros papua.MG 3538
100
Hipposideros papua.MG 3537
Hipposideros muscinus.MG 2967
50
Hipposideros muscinus.MG 2968
100
59
Hipposideros sabanus.MG 2745
Hipposideros cervinus.MG 2844
Hipposideros ater.MG 1687
58
Hipposideros
Hipposideros ater.MG 1685
100
75 Hipposideros ater.MG 1686
82
Hipposideros diadema.MG 1237
97
Hipposideros diadema.MG 1556
100
Hipposideros diadema.MG 3545
Hipposideros diadema.MG 3650
100
44
Hipposideros larvatus.MG 2839
64
Hipposideros larvatus.MG 2840
100 Hipposideros larvatus.MG 2847
Hipposideros larvatus.MG 3299
Pipistrellus javanicus.MG 113
35
Pipistrellus
Asseliscus tricuspidatus.MG 3551
57
Asseliscus tricuspidatus.MG 3547
100
Asseliscus
Asseliscus tricuspidatus.MG 3529
96
Asseliscus tricuspidatus.MG 3530
100
Megaderma spasma.MG 2793
100
Megaderma spasma.MG 2794
Megaderma spasma.MG 106
100
Megaderma
Megaderma spasma.MG 2897
66
18
100 Megaderma spasma.MG 2902
100 Miniopterus pusillus.MG 3378
100
Miniopterus pusillus.MG 3379
Miniopterus
100
Miniopterus schreibersi.MG 3367
Miniopterus australis.MG 1710
62 Miniopterus australis.MG 3533
86
Miniopterus australis.MG 3534
100
Miniopterus australis.MG 3711
98
100
Miniopterus
Miniopterus australis.MG 3532
Miniopterus australis.MG 2845
92 Miniopterus schreibersi.MG 3536
13
100
98
Miniopterus schreibersi.MG 3699
Miniopterus
Miniopterus schreibersi.MG 3700
78
Pipistrellus javanicus.MG 152
Miniopterus schreibersi.MG 90
100
Miniopterus
Miniopterus schreibersi.MG 1018
84
99
Pipistrellus
100
Miniopterus schreibersi.MG 1709
Miniopterus magnater.MG 3247
Miniopterus
Miniopterus medius.MG 2843
100
Miniopterus medius.MG 2841
100
79
Miniopterus medius.MG 2842
Mosia nigrescens.MG 3681
Mosia
Scotophilus kuhlii.MG 761
51
Scotophilus kuhlii.MG 763
100
Scotophilus kuhlii.MG 765
Scotophilus
69 Scotophilus kuhlii.MG 796
Scotophilus kuhlii.MG 805
Mops sarasinorum.MG 1528
48
Mops sarasinorum.MG 1529
41
Mops sarasinorum.MG 1513
81
Mops
Mops sarasinorum.MG 1519
100
Mops sarasinorum.MG 1511
Hipposideros diadema.MG 543
100
Hipposideros
Chaerephon plicata.MG 2851
100
70
Chaerephon plicata.MG 2852
Chaerephon
48 Chaerephon plicata.MG 2850
70 Chaerephon plicata.MG 2853
Otomops formosus.MG 2539
Otomops
76 Emballonura alecto.MG 2895
92
100
Emballonura alecto.MG 2894
Emballonura alecto.MG 2482
Emballonura alecto.MG 2498
100
Emballonura
99 Emballonura alecto.MG 2521
Emballonura alecto.MG 2795
26
100 Emballonura alecto.MG 2801
15
Taphozous melanopogon.MG 2368
Phoniscus atrox.MG 3787
Phoniscus
2
100 Phoniscus atrox.MG 3788
Kerivoula hardwickei.MG 3759
Harpiocephalus
Kerivoula intermedia.MG 3798
47
Kerivoula hardwickei.MG 4127
44
Pipistrellus javanicus.MG 2469
96
6
Kerivoula
Kerivoula papillosa.MG 3797
51
Pipistrellus
Tylonycteris robustula.MG 1081
99
Tylonycteris
Pipistrellus javanicus.MG 3295
25
Pipistrellus
100
Pipistrellus javanicus.MG 3301
19
Nyctophilus sp.MG 2671
Nyctophilus
Tylonycteris robustula.MG 1653
Harpiocephalus harpia.MG 3767
27
Myotis muricola.MG 3290
48
100
Myotis muricola.MG 2462
58
70
Myotis muricola.MG 1712
Myotis muricola.MG 2439
Myotis muricola.MG 472
100
Myotis
93 Myotis muricola.MG 2747
100
Myotis muricola.MG 2748
51
78
Myotis muricola.MG 474
Myotis muricola.MG 464
73 Myotis muricola.MG 471
0.02
Tylonycteris
Harpiocephalus
Taphozous
Hasil Koreksi Identifikasi Lapangan dengan
DNA Barcode
No. Spesimen Identifikasi lapangan














Blast DNA barcode
Kofirmasi
MG 3786
Rhinolophus philippinensis Rhinolophus trifoliatus
R. trifoliatus
MG 3367
Miniopterus scheibersi
Minioterus australis
M. australis
MG 3379
Miniopterus pussilus
Miniopterus australis
M. australis
MG 3378
Miniopterus pussilus
Miniopterus australis
M. australis
MG 472
Myotis adversus
Myotis muricola
M. muricola
MG 474
Myotis adversus
Myotis muricola
M. muricola
MG 464
Myotis adversus
Myotis muricola
M. muricola
MG 464
Myotis adversus
Myotis muricola
M. muricola
MG 2747
Myotis ater
Myotis muricola
M. muricola
MG 2748
Myotis ater
Myotis muricola
M. muricola
MG 2895
Emballonura monticola
Emballonura alecto
M. alecto
MG 2894
Emballonura monticola
Emballonura alecto
M. alecto
___________________________________________________________________________
Barcoding DNA Kelelawar Pemakan Buah
(Chiroptera: Pteropodidae) Berdasarkan Sekuen Gen COI DNA Mitokondria
(Zein MSA & Fitriana YS)






Evaluasi pada: 120 spesimen, 17 genera, 43 species
Hasil menunjukkan intraspesific divergensi sekuen gen CO1 0- 13.4%.
Ada 3 spesies menunjukkan divergensi sekuen yang tinggi : Rousettus celebensis
(13.4%), Chironax melanocephalus (7.9%), dan Thoopterus nigrescens (2.9%),
Yang lain sekuen divergensinya rendah
Spesies pada genus Dobsonia (Dobsonia viridis, Dobsonia moluccensis, Dobsonia
crenulata); Cynopterus (Cynopterus minutus, Cynopterus brachyotis, Cynopterus
titthaecheilus, Cynopterus sphinx), dan genera Rousettus (Rousettus celebensis
Rousettus amplexicaudatus) menunjukkan closely allied taxa/kesalahan identifikasi
spesies.
Harus ada konfirmasi ulang diskripsi spesies yang telah dilakukan
DNA BARCODE PADA BURUNG
Interspesifik Lebih rendah dari 1%
Anas puna and Anas versicolor. Distance: 0.43 - 0.72%
Anas cyanoptera 1
Anas cyanoptera 2
Anas platalea
Anas puna 1
Anas puna 2
Anas versicolor 1
0.25%
Anas versicolor 2
Intraspesifik lebih besar dari 2%
Upucerthia dumetaria
(up to 5%)
Troglodytes aedon
(up to 4,5%)
Myophobus fasciatus
(up to 4,35%)
M. tuberculifer
COI also discriminates between closely
related cryptic species. E.g. Myarchus spp.
Criptic species
M. ferox
M. tyrannulus
M. tuberculifer 1
M. tuberculifer 2
M. tuberculifer 3
M. swainsoni 1
M. swainsoni 2
M. swainsoni
1%
M. tyrannulus 1
M. tyrannulus 2
M. tyrannulus 3
M. tyrannulus 4
Lessonia rufa
Urutan sekuen
COI pada
geografis
terpisah,
membenarkan
perlakuan
sebagai spesies
yang berbeda.
Misalnya
Lessonia spp.
Lessonia oreas
1%
L. oreas 1
L. oreas 2
L. oreas 3
L. oreas 4
L. oreas 5
L. oreas 6
L. rufa 1
L. rufa 2
L. rufa 3
L. rufa 4
Genus Cinclodes
C. fuscus
1%
C. fuscus 1
C. fuscus 2
C. fuscus 3
C. fuscus 4
C. fuscus 5
C. atacamensis 1
C. atacamensis 2
C. atacamensis 3
C. patagonicus 1
C. patagonicus 2
Genus Leptasthenura
L. fuliginiceps
L. platensis
L. aegithaloides
L. aegithaloides
1%
L. fuliginiceps 1
L. fuliginiceps 2
L. fuliginiceps 3
L. aegithaloides 1
L. aegithaloides 2
L. aegithaloides 3
L. aegithaloides 4
L. aegithaloides 5
Straneck 1993
Serpophaga munda
Serpophaga subcristata Serpophaga griseiceps
1%
Serpophaga subcristata
S. subcristata 1
S. subcristata 2
S. griseiceps 1
S. griseiceps 2
The Data Barcode Standard
1. Minimum 500 bp, <1% ambiguous base calls
2. Double stranded sequence
3. Trace files and associated quality scores
4. Primers used to generate sequence
5. Linkages to:
•
•
•
•
•
•
A morphological voucher specimen
Structured reference to collections
Geospatial reference information
Valid species name
Who performed the identification
Literature citations
How Barcoding is Done
From specimen to sequence to species
C
NO
DI
3I
I
Collecting
Voucher Specimen
DNA extraction
CO1 gene
N
N
D
1D
2
DNA sequencing
Trace file
Database of Barcode
Records

Membangun perpustakaan referensi barcode :
Spesimen voucher diidentifikasi dengan
baik
 Sampel Jaringan
 Ekstrak DNA
 Amplifikasi PCR
 Sekuensing DNA
 Data submission to GenBank

Pengawetan Jaringan Sampel:
1. Nitrogen cair (paling baik)
2. DMSO
3. Alkohol absolut (pure grade)
Ekstraksi DNA
PCR
Sekuensing
Mamalia
Burung
Insekta
Fauna
Lainnya
Kekuatan






Penawaran alternatif alat identifikasi taksonomi untuk
situasi di mana morfologi tidak meyakinkan.
Fokus pada satu atau sejumlah kecil gen memberikan
efisiensi yang lebih besar
Biaya sekuensing DNA juga menurun karena kemajuan
teknis.
Potensi kapasitas yang tinggi dan dapat memproses
sampel dalam jumlah besar.
Setelah database referensi didirikan, dapat diterapkan
oleh non-spesialis
Beberapa aspek yang paling menarik mengandalkan
teknologi masa depan, misalnya, sequencer genggam
What barcode users would do with the
reference libraries




Inspection stations at every port and international airport for:
 Agricultural pest control
 Illegal trade in endangered species
 Violations of trade quotas
Water quality surveys
Food inspection
Public health monitoring and diagnoses
Beberapa Hasil Penelitian
Menggunakan DNA Barcode
Peta lokasi koleksi material DNA
diberbagai tempat di Indonesia

Terima Kasih