Isolasi dan Karakterisasi Bateri Penghasil Acyl Homoserine

PENDAHULUAN
Latar belakang
Bakteri fitopatogen merupakan bakteri
yang menyebabkan infeksi atau penyakit
pada tumbuhan. Pengendalian bakteri
patogen
dapat
dilakukan
dengan
menggunakan senyawa antibiotik atau
antimikrob. Masalah yang dihadapi dalam
penggunaan antibiotik adalah timbulnya
resistensi bakteri terhadap antibiotik tersebut.
Hal ini mendorong dilakukannya berbagai
penelitian tentang pengendalian bakteri
patogen yang yang lebih aman dan tidak
dikhawatirkan akan menimbulkan resistensi.
Defoirdt et al. (2004) menyatakan bahwa
ekspresi gen virulensi pada beberapa bakteri
patogen diregulasi oleh proses quorum
sensing. Quorum sensing (QS) adalah
mekanisme komunikasi bakteri sebagai suatu
pengaturan ekspresi gen yang bergantung
pada jumlah populasi bakteri tersebut dan
akumulasi senyawa autoinducer (AI)
(Rukayadi & Hwang 2009). QS terlibat
dalam regulasi fungsi biologi yang penting
seperti luminescence, produksi antibiotik,
transfer plasmid, motilitas, virulensi,
pembentukan biofilm dan berperan dalam
regulasi ekspresi gen-gen patogen pada
Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas
aeruginosa, dan beberapa spesies Erwinia
(Dong et al. 2000; Zang & Dong 2004).
Proses QS melibatkan molekul kimia
yang disebut autoinducer (AI). AI merupakan
molekul
sinyal
yang
disekresikan,
diakumulasi, diserap kembali, dan dikenali
oleh bakteri selama proses QS terjadi
(Rukayadi & Hwang 2009). Salah satu jenis
molekul AI adalah
N-acylhomoserine
lactone (AHL) yang dihasilkan oleh bakteri
Gram negatif, serta digunakan untuk
komunikasi dalam spesies yang sama
(Rukayadi & Hwang 2009).
Salah satu prinsip pengendalian virulensi
bakteri fitopatogen dengan dasar QS adalah
mencegah
akumulasi
AHL
dengan
mendegradasi molekul sinyal tersebut.
Senyawa atau molekul yang dapat
mendegradasi molekul AHL disebut senyawa
anti-QS. Anti-QS memiliki kelebihan dalam
mengontrol infeksi bakteri yaitu tidak
mempengaruhi pertumbuhan, sehingga dapat
menghindarkan timbulnya tekanan seleksi
yang sering menghasilkan generasi patogen
yang lebih resisten terhadap antibiotik (White
& Finan 2009). Beberapa enzim pendegradasi
AHL telah diidentifikasi dari beberapa
bakteri dan memiliki potensi sebagai anti-QS
(Yin et al. 2010).
Salah satu enzim pendegradasi AHL
adalah enzim Acyl Homoserine Lactonase
(AHL-laktonase) (Dong et al. 2000). Enzim
ini disandikan oleh gen aiiA yang dimiliki
oleh Bacillus dan mampu mendegradasi AHL
dengan menghidrolisis ikatan lakton yang
terdapat pada molekul AHL (Dong et al.
2000). AHL-laktonase sebagai salah satu
senyawa anti-QS dapat digunakan sebagai
alternatif dalam pengendalian bakteri
fitopatogen.
Sebagai
salah
satu
negara
megabiodiversity, Indonesia mempunyai
kekayaan dan keragaman sumberdaya
mikroba yang sangat besar dan berpotensi
sebagai penghasil AHL-laktonase. Oleh
karena itu, isolasi dan karakterisasi bakteri
penghasil AHL-laktonase merupakan langkah
awal untuk untuk memanfaatkan potensi
tersebut.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi
dan mengkarakterisasi bakteri penghasil
AHL-laktonase asal lahan pertanian di Jawa.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
November 2010 sampai dengan Mei 2011,
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi
Departemen Biologi FMIPA IPB.
Isolasi, Pemurnian, dan Penyimpanan
Bakteri
Isolasi bakteri dilakukan terhadap 27
sampel tanah dan 10 sampel daun yang
berasal dari lahan pertanian di Jawa. Isolasi
bakteri tanah dilakukan dengan metode
cawan sebar pada media nutrient agar (NA)
(Lampiran 1). Sebanyak 1 gram sampel tanah
disuspensikan dengan 9 mL larutan garam
fisiologis 0,85%. Suspensi dienceran serial
sampai pengenceran 10-6, 10-7, dan 10-8. Sisa
suspensi dipanaskan dalam penangas air
selama 10 menit pada suhu 80oC. Sebanyak
0,1 mL dari setiap pengenceran dan suspensi
yang dipanaskan tersebut masing-masing
disebarkan ke media NA, kemudian
diinkubasi selama dua hari pada suhu ruang.
Bakteri filosfer diisolasi dengan cara
membilas sampel daun dengan larutan garam
fisiologis 0,85% dan disebarkan pada media
pertumbuhan King’s B (Lampiran 1). Kolonikoloni
bakteri
yang
tumbuh
dan
2
menunjukkan morfologi yang berbeda
dimurnikan dengan metode cawan gores.
Setelah murni, bakteri disimpan dalam agar
miring.
Bioesei Aktivitas Degradasi AHL
Isolat-isolat murni ditumbuhkan pada
media Luria broth (LB). Setelah 48 jam,
kultur disentrifus selama 10 menit dengan
kecepatan 10000 rpm. Sebanyak 100 μL
supernatant diteteskan pada paper disk dan
diletakkan pada permukaan media cawan
Luria agar (LA) yang mengandung
Chromobacterium violaceum 1%. Cawan
tersebut kemudian diinkubasi pada suhu
ruang selama 24 jam. Media LB steril
digunakan sebagai kontrol. Paper disk yang
dikelilingi oleh zona tidak berwarna ungu
menunjukkan adanya aktivitas degradasi
AHL.
Pengamatan Morfologi Sel dan Pewarnaan
Gram
Isolat-isolat yang menunjukkan hasil
bioesei positif diamati morfologi sel (bentuk
sel, penataan sel, dan endospora) dan reaksi
terhadap pewarnaan Gram.
Amplifikasi Gen Penyandi AHL-laktonase
DNA bakteri diisolasi dengan metode
Lazo (Lazo et al. 1987). Isolat-isolat yang
menunjukkan hasil bioesei degradasi AHL
positif diamplifikasi menggunakan primer
spesifik untuk gen aiiA yaitu aiiAF (5’-ATC
GGA TCC ATG ACA GTA AAG AAG CTT
ATT TCG-3’, dan aiiAR (5’-GTC GAA TTC
CTC AAC AAG ATA CTC CTA ATG
ATGT-3’ (Dong et al. 2000). Campuran PCR
terdiri dari 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs,
0.3 µM masing-masing primer, 0.02 U/µL
Taq DNA polymerase, template DNA,
ddH2O, dan buffer DNA polymerase.
Amplifikasi dilakukan selama 30 siklus PCR
dengan kondisi pra-denaturasi (94oC, 10
menit), denaturasi (94oC, 30 detik), annealing
(52oC, 30 detik), elongasi (72oC, 1 menit),
dan post-PCR (72oC, 5 menit) (Chan et al.
2007). Produk PCR dilarikan pada mini-gel
elektroforesis (agarose 1%) pada tegangan
listrik 50 volt selama 45 menit (Sambrook et
al. 1989). Visualisasi di atas UV
Transiluminator dilakukan dengan pewarnaan
Ethidium Bromida.
Identifikasi Isolat
Isolat-isolat yang menunjukkan hasil
positif pada bioesei degradasi AHL dan
amplifikasi gen aiiA diidentifikasi secara
molekuler (16S rRNA). Amplifikasi gen 16S
rRNA menggunakan primer 63f (5’-CAG
GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan
1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA
GGC-3’) (Marchesi et al. 1998). Amplifikasi
dilakukan selama 30 siklus PCR dengan
kondisi pra-PCR (94oC, 2 menit), denaturasi
(92oC, 30 detik), annealing (50oC, 1 menit),
elongasi (72oC, 1 menit), dan post-PCR
(75oC, 5 menit).
Sekuensing
DNA
dan
Analisis
Bioinformatika
Pengurutan DNA hasil amplifikasi
dilakukan
dengan
memanfaatkan
jasa
perusahaan sekuensing 1st Base di Singapura.
Sekuen yang diperoleh dijajarkan dengan data
pada GenBank menggunakan program Basic
Local Alignment Search Tool-Nucleotida
(BLAST-N) dan Basic Local Alignment
Search Tool Nucleotide 6-frame translationprotein (BLAST-X) dari situs National Center
for Biotechnology Information (NCBI) melalui
http://www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mengetahui
tingkat kemiripan gen aiiA dan 16S rRNA dari
isolat yang dianalisa.
Konstruksi Pohon Filogenetik
Konstruksi pohon filogenetik dilakukan
dengan metode
Neighbor Joining (NJ)
dengan bootstrap 1000x menggunakan
program MEGA 5.0.
HASIL
Bioesei Aktivitas Degradasi AHL
Isolasi bakteri dari 10 sampel daun dan 27
sampel tanah asal lahan pertanian di Jawa
menghasil 261 isolat (Tabel 1). Dari 261
isolat yang diuji, 12 isolat diantaranya yang
menunjukkan aktivitas degradasi AHL yang
kuat. Aktivitas degradasi ini ditunjukan
dengan terbentuknya zona tidak berwarna
ungu di sekitar paper disk (Gambar 1).