Document

Garis Besar Tahapan Kloning dan PCR (Polymerase Chain Reaction) Beserta
Aplikasi dan Keterbatasannya
Kelompok 30
:
BIJ006143 FEFI FEBRIANI INDAH SARI
BIJ006145 APRIANA TITIK P.
BIJ006149 CITRA DEWI FEBRIANI
KODE
:
RINGKASAN
:
K30-TD-01
Upaya mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui kloning DNA melibatkan
beberapa komponen dan melalui beberapa tahapan tertentu. Komponen kloning DNA
antara lain DNA asing, DNA vektor, enzim restriksi, dan enzim ligase serta sel inang.
Adapun tahapan-tahapannya, yaitu:
1. DNA asing dipotong dengan enzim restriksi, misalnya BamH1 sehingga
mengahasilkan ujung sticky 5’-GATC-3’.
2. DNA vektor (ex: plasmid) juga dipotong dengan enzim restriksi yang sama, sehingga
plasmid sirkuler berubah menjadi linier dengan ujung sticky yang sama yaitu 5’GATC-3’.
3. DNA asing diinsersi ke dalam plasmid kemudian disambung dengan enzim ligase,
sehingga menghasilkan berbagai macam produk rekombinan.
4. Plasmid rekombinan dimasukkan kembali ke sel inang E.coli, kemudian plasmid ini
bereplikasi dalam sel inang. Hal ini dapat terjadi karena gen asing yang diinsersi tidak
mengganggu kemampuan replikasi plasmid. Ketika sel inang membelah maka plasmid
rekombinan akan ikut terbagi, sehingga akan dihasilkan koloni rekombinan E.coli
dengan masing-masing bakteri mengandung banyak ‘copy’ dari DNA asing.
Gambar 1. Garis Besar Tahapan Kloning DNA
Sumber : Figure 4.16 (Brown, 2002)
Kloning dapat digunakan untuk sequencing DNA, memodifikasi karakteristik biologi
organisme dan mensintesis protein-protein penting. Sayangnya, teknik kloning untuk
mendapatkan gen target membutuhkan waktu yang lama, dan melewati prosedur yang
rumit, khususnya dalam seleksi rekombinannya.
Oleh karena itu, dikembangkan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk
melengkapi kloning DNA agar dapat tetap memperoleh suatu fragmen DNA yang
diinginkan namun dalam waktu yang lebih singkat. PCR meliputi beberapa komponen
yang melalui tahapan-tahapan tertentu. Komponen PCR antara lain untai DNA template,
sepasang primer, dNTP serta enzim Taq DNA polymerase thermostabil. Primer yang
dibutuhkan untuk menginisiasi sintesis DNA harus dapat mensintesis urutan yang tepat.
Tahapan-tahapan PCR secara umum adalah sebagai berikut :
1. Denaturasi
PCR dimulai dengan pemanasan DNA target pada suhu 94 0C, sehingga DNA target
akan terdenaturasi dan terpisah menjadi untai tunggal karena putusnya ikatan hidrogen.
2. Annealing
Penurunan temperatur menjadi 50-60 0C menyebabkan bersatunya kembali ikatan
hidrogen antar nukleotida untai tunggal DNA target, tetapi juga membuka
kemungkinan menempelnya primer pada masing-masing untai tunggal DNA sel target.
3. Polimerisasi
Suhu kembali dinaikkan hingga 72 0C (suhu optimum bagi enzim Taq DNA
polymerase thermostabil), sehingga sintesis DNA pun dimulai.
Produk yang dihasilkan dari siklus pertama PCR belum menghasilkan fragmen DNA
yang diinginkan, sehingga siklus harus diulang. Setelah siklus ketiga barulah diperoleh
fragmen DNA target yang diinginkan. Siklus selanjutnya merupakan perbanyakan dari
fragmen DNA target yang telah diperoleh dan biasanya berlangsung hingga siklus ke-30.
Kemudian, hasil PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa.
Gambar 2. Tahap awal PCR (Polymerase Chain Reaction)
Sumber : Figure 4.28 (Brown, 2002)
Gambar 3. Sintesis fragmen pendek DNA yang diinginkan
Sumber : Figure 4.29 (Brown, 2002)
Gambar 4. Analisis hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Sumber : Figure 4.30 (Brown, 2002)
PCR dapat digunakan dalam bidang kesehatan untuk mendeteksi DNA virus dan
screening sampel DNA manusia untuk penyakit genetik seperti thallasemia dan cystic
fibrosa, serta dapat membentuk profil genetik. PCR juga dapat menghasilkan sequence
DNA pada spesimen forensik dan arkeologi. Namun, PCR memiliki keterbatasan yaitu
primer harus menempel pada posisi yang tepat sehingga urutan basa dari DNA target yang
akan diamplifikasi harus diketahui. Hal ini berarti PCR tidak akan bisa dilakukan jika gen
atau bagian dari genom tersebut tidak pernah dipelajari sebelumnya. Selain itu, PCR hanya
mampu mereaksikan segmen DNA tidak lebih dari 100 kb.
Daftar Pustaka
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.section.6035
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6036
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.section.6064
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6070
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6071
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6072
Diakses tanggal 28 Oktober 2008
Situs terkait
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf [FLASH]
http://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/cloning/cloning.swf
[FLASH]
Diakses tanggal 28 Oktober 2008