KLONING GEN YANG TERLIBAT DALAM MEKANISME

KLONING GEN YANG TERLIBAT DALAM
MEKANISME PATOGENISITAS
~ a n t h o m o n a axonopodis
s
pv. glycines
oleh
ALINA AKHDIYA RUSMANA
97266/BIO
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2000
KLONING GEN YANG TERlLIBAT DALAM
MEKANISME PATOGENISITAS
Xanthomonas axonopodis pv. glycines
oleh
ALINA AKHDIYA RUSMANA
972660310
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2000
Judul
:
Kloning Gen yang Terlibat dalam Mekanisme
Patogenisitas Xanthonzonas axonopodispv. glycines
Nama
: Alina Akhdiya Rusmaua
Nomor Pokok
: 97266
Program Studi : Biologi
Menyetujni
1. Kon~isipembimbing
Dr. Ir. Antonius Suwanto. M.Sc.
Ketua
/
,I'
.,.'
,,.'
,
"
_.'
..'
2. Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dede Setiadi, MS.
Tanggal lulus :
2 0 SE?
?-on0
gram Pascasarjana
ABSTRACT
Cloning of Gene Involved in Pathogenicity Mechanism of
Xantlioinonas monopodis pv. glycines
ALINA A. RUSMANA
Supervised by ANTONIUS SUWANTO (Chairman of advisor), BUD1
TJAHJONO and MAGGY T. SUHARTONO (Coadvisor)
Phytopathogenic mechanism of Xarrtltoinonas axo~topodis pv.
glycincs (Xag) is complex and not really well understood. The objective of
this work is to clone and identify pathogenicity genes of the bacterium as one
approach to understand the mechanism. We have localized the putative
pathogenicity gene from a non-pathogenic mutant of Xag M715. Southern
hybridization analysis using 2.8 kb EcoRI from pYR103 as probe showed that
the gene involved in pathogenicity is located within 2.0 kb PstI fragment. A
0.7 kb DNA fragment has been amplified using inverse PCR technique, and
inserted into p ~ ~ M @
easy
' - vector
~
to produce a 3.7 kb recombinant plasmid
(pAAO1). Southern hybridization analysis of the wild type (YR32) with
pAAOl as a probe indicated a signal located at k 3.0 kb PstI fragment. DNA
sequence analysis indicated that the DNA fiagment has a 64% identity in 75
nucleotides overlap to a vir gene of Bacillzrs anthrcis.
Key words : Xanthomonas nxonopodis pv. glycines, non-pathogenic mutan,
pathogenicity mechanism, cloning and vir gene.
RINGKASAN
ALINA AKHDNA RUSMANA.
Boning gen yang dalam mekanisme
patogenisitas Xantltoi~zonnsmonoportis pv. glycines.
Dibawab bimbingan
ANTONIUS SUWANTO (ketua komisi pembimbing), BUD1 TJAHJONO,
dan MAGGY T. SUHARTONO (anggota komisi pembimbing).
Xanthomonas monopodis pv. glycines (Xag) mempakan bakteri penyebab
penyakit bisul pada tanaman kedelai. Penyakit ini sangat memgikan dan diduga
terdapat selumh wilayah penanaman kedelai di dunia termasuk Indonesia.
Mekanisme patogenisitas Xanthomonas axonopodis pv.
kompleks dan belum banyak dipahami.
glycines sangat
Berdasarkan data yang diperoleh dari
penelitian yang dilakukan Daniels (1988) dengan teknik mutasi, diperkirakan
terdapat 20 sampai 100 gen yang terlibat
Xmthomonas.
dalam mekanisme fitopatogenitas
Oleh karena itu walaupun berbagai penelitian telah dilakukan
untuk mengetahui patogenitas Xag, namun masih banyak informasi yang
dibutuhkan untuk menerangkan mekanismenya (Rukayadi, 1998).
Xanthomonas axonopodis pv. glycines M715 mempakan salah satu mutan
yang menarik untuk diteliti lebih lanjut karena bersifat nonpatogenik dan HRpada daun tomat (Rukayadi, 1998). Mutan ini mempakan hasil mutasi transposisi
Xag YR32 menggunakan pYR103 ( p ~ ~ m i n i - ~ n 5 ~ m R - ~ p R ) .
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengklon dan mengidentifikasi
gen yang terlibat dalarn mekanisme patogenisitas Xag sebagai salah satu cara
untuk mempelajari mekanismenya.
Tahapan penelitian terdiii dari Lokalisasi
DNA pengapit, kloning, dan sekuensing DNA pengapit transposon.
Lokalisasi DNA pengapit transposon dilakukan dengan teknik hibridisasi
Southern menggunakan pelacak fragmen 2,8 kb EcoRI pYR103 yang membawa
gen resistensi kanamisin dan sebagian gen resistensi trimetoprim.
..
Dari hasil
analisa hibridisasi Southern DNA genom Xag M715 yang di-digest sempuma
dengan enzim PstI dengan menggunakan fragmen pYR103 tersebut sebagai
pelacak, diperoleh fragmen DNA bemkuran 2,O kb yang membawa DNA pengapit
transposon. Mengingat diantara gen Knlr dan Tpr pada pYR103 terdapat satu situs
PstI, maka di duga ada 2 fragmen DNA berukuran hampir sama (5 2,O kb) yang
masing-masing membawa salah satu sisi DNA pengapit.
Arnplifikasi DNA menggunakan teknik Inverse PCR dengan primer
spesifik Knl-Tn903 (5'-gAATATggCTCATAACAC-3')dan primer universal
M13-Forward (5'-TgTAAAACgACggCCAgT- 3') menghasilkan fragmen DNA
pengapit berukuran 0,7 kb.
DNA pengapit tersebut diligasikan dengan plasmid
vektor pGem@-T Easy membentuk plasmid rekombinan pAAOl (3,7 kb) dan
selanjutnya diiklonkan pada E. coli TOP10.
Analisa sekuen DNA pengapit melalui Web European Bioinformatics
Institute (EBI) fasta 3, menunjukkan kemiripan dengan gen vir dari Bacillz~s
anthracis dengan nilai 64% dari 75 nukleotida yang overlap.
Hibridisasi Southern pAAOl dengan DNA genom Xag YR32 yang didigest sempurna dengan PstI menunjukkan bahwa gen Xag YR32 yang termutasi
terdapat pada fragmen berukuran 3,O kb.
Berdasarkan model hipotetik tentang hngsi protein hrp pada proses cell
signaling yang dikemukakan Fenselau et al. (1992), diduga mutasi pada Xag
M715 tejadi pada salah satu gen hrp yang menyandikan protein perangkat
ekskresi elicitor, gen regulator gen-gen elicitor atau gen penyandi elicitor
sehingga mengakibatkan kegagalan proses cell signaling. Kegagalan proses cell
signaling tersebut menyebabkan bakteri ini tidak mampu menimbulkan gejala
penyakit ataupun reaksi hipersensitivitas karena tidak dikenali lagi oleh tumbuhan
inang (compatible /incompatible).
Hasil analisa sekuen tersebut diperoleh berdasarkan analisa salah satu sisi
DNA pengapit, sehingga hasilnya bisa berbeda bila analisa dilakukan kembali
terhadap gabungan kedua sisi sekuen DNA pengapit. Oleh karena itu hasil analisa
sekuen ini belum dapat digunakan untuk mengidentifikasi secara tepat gen yang
tersisipi transposon.
Karenanya diperlukan penelitian lebih lanjut untuk
melengkapi data sekuen yang telah ada sehingga informasi yang diperoleh
menjadi lebih berarti.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jepara pada tanggal 8 Desember 1968 sebagai anak
pertama dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Zainuri Basri dan Ibu
Zulichah.
1
Pada tanggal 22 Januari 1995 penulis menikah dengan Ir. Iman
Rusmana. Dari pernikaban tersebut penulis dikaruniai seorang anak laki-laki
4
bernama Zul Fadhli yang lahir pada tanggal 20 Oktober 1995 serta dua orang
anak perempuan bernama Kamila Nur Imani Putri dan Fadhila Nur Imani Putri
yang lahir pada tanggal 8 Oktober 1999.
.-
Pendidikan dasar dan menengah diselesaikan oleh penulis di Jepara.
Tahun 1982 lulus dari SD Sultan Agung 5, tahun 1985 lulus dari SMP Sultan
Agung 3, d m tahun 1988 lulus dari SMA Sultan Agung 2.
Tahun 1988
penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui program Penulusuran
Minat d m Kemampuan (PMDK).
Tahun berikutnya penulis masuk ke
Jurusan Biologi FMIPA dan memperoleb gelar Sajana Sains pada tahun 1994.
Pada tahun 1997, penulis melanjutkan pendidikan pada Program Studi
Biologi, Sub-program Mikrobiologi, Program Pascasarjana Institut Pertanian
Bogor.
UCAPAN TERIMA KASIH
Alhamdulillahi robbil a'lamin atas rahmat dan kanmia Allah SWT penulis
dapat menyelesaikan tesis yang berjudul Kloning Gen yang Tedibat dalam
Mekanisme Patogenisitas Xantlzomonas avonopodis pv. glycines.
Pada kesempatan ini penulis menghaturkan terima kasih dan penghargaan
yang setinggi-tingginya kepada Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. atas perhatian,
bimbingan, serta dorongan semangat sejak awal penelitian hingga penulisan
tesis ini.
Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga penulis sampaikan
kepada Dr. 11. Budi Tjahjono, M.Agr. atas bimbingan dan kesempatan yang
diberikan kepada penulis untuk turut serta dalam tim penelitian proyek RUT
VII.
Kepada Prof Dr. Ir. Maggy T. Suhartono sebagai anggota komisi
pembimbing dan Kepala Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Antar
Universitas (PAU) Bioteknologi IPB, penulis ucapkan terimasih atas bimbingan
dan kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menggunakan fasilitas
laboratorium selama pelaksanaan penelitian.
Terimakasih kepada Dr. Drs. Yaya Rukayadi, M.Si., dan semua anggota
tim penelitian Xanthomonns (Rina, Mbak Etty, Pak Heru dan Bu Ila), Irawan,
Pak Dwi, Mbak Nisa, Bu Yus, Pak Bowo, Esti, Puji, rekan-rekan lain serta para
teknisi di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia PAU Bioteknologi IPB dan
Laboratorium Biologi Molekuler SEAMEO BIOTROP atas persahabatan dan
bantuannya selama penulis melakukan penelitian.
Kepada Bapak dan ibunda tersayang, suami tercinta Iman Rusmana dan
anak-anakku tersayang Fadhli, Mila, dan Dila penulis sampaikan teriinakasih
yang sedalam-dalamnya atas doa, kasih sayang, pengertian, serta dukungannya
selarna ini.
Semoga semua arnal kebaikan tersebut mendapat imbalan yang sepadan
dari Allah SWT. Amin.
Bogor, September 2000
DAFTAR IS1
Halaman
ABSTRACT
........................................................................
.....................................................
........................................................................
UCAPAN TERIMA KASIH
DAFTAR IS1
..................................................................
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan
...............................................................
............................................................
..................................................................
...............................................................
........................................................................
TINJAUAN PUSTAKA
............................................................
Taksonomi dan Biologi Xnnthontonru nxonopodis pv. glycines ......
Genetika Molekuler Xnnthomonas amnopurlis pv .g$cines
.........
Biologi Molekuler Patogenisitas Xnnthotnonas .............................
Aplikasi Teknik PCR dalam Genetika Moleknler ........................
METODOLOGI
..................................................................
Waktu dan Tempat Penelitian
.............................................
Tahapan Penelitian
.........................................................
Bahan dan Metode
..........................................................
Galnr bakteri dan plasmid
.............................................
Media dan kondisi pertumbuhan
....................................
Isolasi DNA kromosom
.................................................
Isolasi DNA plasmid
......................................................
Pemotongan DNA dengan enzim restriksi dan ligasi fragmen DNA
..........
Isolasi dan pemurnian fragmen DNA dari gel agarosa
Analisa hibridisasi Southern
..........................................
Transformasi
.............................................................
Amplifikasi fragmen DNA dengau PCR
............................
.........................................................
Sekuensing DNA
Analisa sekuen DNA
......................................................
vii