BAB III Metode Penelitian

16
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada lahan agroforestri yang terdapat di Desa
Selaawi, secara administrasi berada di Kecamatan Talegong, Kabupaten Garut,
Propinsi Jawa Barat. Pemilihan lokasi penelitian dilakukan secara purposive pada
lahan agroforestri yang dikembangkan oleh petani. Penelitian ini dilakukan mulai
Juni 2010 sampai dengan Mei 2011.
Metode Penelitian
Analisis Tempat Tumbuh
Pengambilan data dilakukan:
a. Penentuan petak penelitian, membuat plot lingkaran dengan luasan 0,01 ha
pada petak tegakan mindi muda, mindi tua dan hutan pinus. Pengukuran
tegakan dalam plot meliputi pengukuran diameter dan tinggi pohon secara
keseluruhan.
b. Pengukuran tegakan dalam plot meliputi pengukuran diameter dan tinggi
pohon secara keseluruhan.
c. Pengambilan sampel tanah dengan menggunakan ring tanah atau bor tanah.
Alat dan Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara lain contoh tanah utuh untuk analisis
sifat fisik tanah, contoh tanah komposit untuk analisis sifat kimia dan biologi
tanah, dan bahan–bahan kimia untuk analisis sifat tanah. Peralatan yang
digunakan dalam penelitian: peta lokasi, autoklaf, cawan petri, ayakan, ember,
polybag, gelas ukur, tabung reaksi,
botol,
oven,
mikroskop, kamera,
meteran/mistar, caliper, timbangan analitik, cangkul, kompas, GPS, sekop,
komputer, soil tester, bor tanah, oven memert, gelas ukur, tabung film, plastik,
17
kertas label, kertas saring, saringan, peralatan tulis, dan peralatan analisis
laboratorium.
Tempat Tumbuh
Untuk mendapatkan data mengenai sifat fisik, kimia tanah, diambil contoh
tanah dari 3 tegakan yang berbeda. Pengambilan data sifat fisik dan kimia tanah
maka diambil 3 ulangan dari setiap penutupan lahan pada kedalaman 0-20 cm.
Cara pengambilan contoh tanah adalah sebagai berikut :
a. Contoh tanah utuh (undisturbed soil sample)
Pengambilan contoh tanah utuh untuk analisa sifat fisik tanah seperti berat
isi (bulk density), porositas, permeabilitas. Pengambilan contoh tanah utuh hanya
pada satu kedalaman yaitu 0-20 cm . Kegiatan pengambilan contoh tanah dimulai
dengan membersihkan bagian tubuh tanah yang akan diambil dari penutupan
serasah dan batu, kemudian diratakan. Ring sample diletakkan tegak lurus di atas
permukaan tanah tersebut dan ditekan hanya tiga perempat bagian masuk ke
dalam tanah. Selanjutnya, meletakkan ring sample kedua di atas ring pertama,
kemudian ditekan kembali sampai ring pertama dan ring kedua masuk ke dalam
tanah. Ring beserta di dalamnya digali dengan menggunakan sekop/cangkul.
Kedua ring dipisahkan dengan, hati-hati kemudian kelebihan tanah yang ada pada
bagian atas dan bawah ring diiris hingga rata. Ring ditutup dengan menggunakan
kantong plastik (Purwowidodo 2004). Kemudian tanah dianalisa di laboratorium.
b. Contoh tanah biasa (disturbed soil sample)
Pengambilan contoh tanah biasa digunakan untuk analisa sifat kimia
seperti pH, KTK, kadar air, dan kandungan hara. Kegiatan pengambilan contoh
tanah dimulai dengan membersihkan permukaan tanah dari tanaman, daun dan
sisa kotoran kemudian tanah diambil secara komposit dari 3 titik dengan
menggunakan cangkul dan pisau pada kedalaman 0 – 20 cm, kemudian dicampur
menjadi tanah komposit sebanyak 1 kg. Contoh tanah dimasukan ke dalam
kantung plastik dan diberi label dan dimasukkan ke dalam cool box agar terjaga
kelembabannya. Kemudian tanah dianalisa di laboratorium (Purwowidodo 2004)
l. Sifat fisik tanah
18
Sample tanah yang digunakan merupakan sample tanah utuh sebanyak 100
gram yang diambil pada kedalaman 0 - 20 cm. Sifat fisik tanah yang dianalisis
antara lain tekstur, bulk density, porositas, kedalaman solum tanah, ketersediaan
air dan permeabilitas.
2. Sifat kimia tanah
Analisis sampel tanah di laboratorium dilakukan untuk penetapan: N-total,
dengan metode Kjeldahl; Nitrat, dengan metode titrasi; P tersedia, dengan metode
Bray; K tertukar, ekstrak NH4OAc dan diukur dengan flamefotometer; C-organik,
dengan metode Walkley & Black; pH H2O, dengan pH stick; tekstur, dengan
metode analisis granuler cara pipet; berat volume, dengan metode ring sampler;
porositas dengan perhitungan menurut rumus n:l- (BV/BJ); kemantapan agregat.
(Purwowidodo 2004). Parameter sifat fisik dan sifat kimia tanah disajikan pada
Tabel 1.
Tabel 1 Parameter sifat fisik dan sifat kimia tanah
No Parameter yang diambil
1. Iklim (Suhu, Kelembaban, dan Curah hujan)
2.
3.
Sifat fisik
a. Bulk density
b. Porositas
c. Air tersedia
d. Kadar air
e. Tekstur tanah
f. Struktur tanah
g. Kedalaman perakaran tanah
Sifat kimia
a. C-Organik
b. N total
c. P
d. K
e. KTK
f. pH
Metode analisis
Pengukuran lapang
dan data sekunder
Nisbah bobot tanah
Volumeter
Gravimetri
Gravimetri
Metode pipet
Pengamatan lapang
Pengamatan lapang
Kjeldahl
Kjeldahl
P-Bray II
NH4Oac pH 7, AAS
NH4OacpH 7, Titrasi
pH meter (Potentiometer)
Analisis Vegetasi
Analisis vegetasi dilakukan untuk mendapatkan data indeks nilai penting
(INP) jenis vegetasi baik tanaman hutan maupun tumbuhan bawah pada lokasi
penelitian. Untuk mendapatkan data vegetasi tanaman hutan maka akan dilakukan
19
sampling terhadap penutupan lahan. Pada penelitian ini petak contoh dibuat
dengan metode petak lingkaran (Soerianegara & Indrawan 1998).
1. Kerapatan tegakan (Jumlah pohon per hektar)
Jumlah pohon per hektar adalah jumlah pohon per petak ukur dibagi
dengan luas petak ukur dilakukan sebagai berikut:
N= n / Lp
Ket: N = jumlah pohon per hektar
n = jumlah pohon dalam petak ukur
Lp = luas petak ukur (ha)
2. Luas bidang dasar (LBDS)
Luas bidang dasar seluruh tanaman diperoleh dari jumlah luas bidang
dasar individu tanaman dalam petak ukur dibagi dengan luas petak ukur dilakukan
sebagai berikut:
dan
Bi = π / 4 (Di2 / 10000)
Ket : Di = diameter tanaman ke-I (cm)
B = luas bidang dasar seluruh tanaman (m2/ha)
Bi = luas bidang dasar tanaman ke-I (cm2)
n = jumlah tanaman dalam petak ukur
Lp = luas petak ukur (ha)
3. Volume tegakan
Volume tagakan diperoleh dari jumlah volume individu pohon dalam
petak ukur dibagi dengan luas petak ukur dilakukan sebagai berikut:
Volume individu pohon dalam petak ukur di peroleh dengan persamaan
penduga volume kayu bawang yang disusun oleh Sumadi et al. (2007):
Vi = 0,0000501Di2,13 Hi0,769
Ket : Di = diameter tanaman ke-i (cm)
20
Hi = tinggi total pohon ke-i (m)
V = volume tagakan (m3/ha)
Vi = volume pohon ke-I hingga diameter ujung 10 cm dengan kulit (m3)
n = jumlah tanaman dalam petak ukur
Lp = luas petak ukur (ha)
Analisis Data
Untuk menganalisis data kualitas tempat tumbuh pada berbagai tegakan
digunakan program komputer dengan software Microsoft Excel 2007, Minitab 15.
Eksplorasi Pengetahuan Lokal Sistem Agroforestri
Pengumpulan data eksplorasi pengetahuan lokal akan dilakukan melalui
teknik wawancara mendalam (indepth interview), pengisian kuisioner, dan Focus
Group Disscussion (FGD). Dilakukan terhadap beberapa orang informan kunci
yang terlibat langsung dalam agroforestri mindi. Jumlah responden yang akan
ditentukan sesuai dengan jumlah yang terlibat dalam kegiatan ini. Teknik
penentuan sampel yang akan diwawancarai yaitu dengan snowball sampling.
Penentuan sampel mula-mula jumlahnya kecil kemudian membesar, ibarat bola
salju yang menggelinding yang lama-lama menjadi besar. Dalam penentuan
sampel, pertama-tama dipilih satu dua orang, tetapi karena dengan dua orang ini
belum merasa lengkap data yang diberikan, maka peneliti mencari orang lain yang
dipandang lebih tahu dan dapat melengkapi data yang diberikan oleh dua orang
sebelumnya. Begitu seterusnya, sehingga jumlah sampel semakin banyak
(Sugiyono 2009). Data yang dikumpulkan berupa sistem silvikultur agroforestri
mindi yaitu teknik penanganan benih, perbanyakan tanaman dan teknik
pengelolaan lahan.
21
Penggambaran Model Local Ecological Knowledge
Local Ecological Knoowledge (LEK) diperoleh dari hasil wawancara
mendalam (indepth interview) dan observasi lapangan tentang teknik pengelolaan
lahan pada sistem agroforestri, komponen-komponen dalam teknik pengelolaan
lahan pada sistem agroforestri, dan interaksi antar komponen
dalam teknik
pengelolaan lahan pada sistem agroforestri. Data yang didapatkan melalui hasil
wawancara
tersebut
kemudian
disusun
berdasarkan
rumus
(grammer)
yang
menjadi
telah
pernyataan
diterapkan
pada
(statement)
program
Agroecological Knowledge Toolkit 5 (AKT 5). Kemudian data-data tersebut
diolah dengan menggunakan program aplikasi AKT 5 dan dianalisis secara
deskriptif.
Analisis SWOT
Analisis SWOT adalah identifiksi berbagai faktor secara sistematis untuk
merumuskan strategi perusahaan. Analisis ini didasarkan pada logika yang dapat
memaksimalkan kekuatan (strengths) dan peluang (opportunities), namun secara
bersamaan dapat meminimalkan kelemahan (weakness) dan ancaman (threats).
Proses pengambilan keputusan strategis selalu berkaitan dengan pengembangan
misi, tujuan, strategi, dan kebijakan perusahaan. Dengan demikian perencanaan
strategis (strategic planner) harus menganalisis faktor-faktor strategis perusahaan
(kekuatan, kelemahan, peluang dan ancaman) dalam kondisi yang ada saat ini
(Rangkuti 2006).
Alat yang dipakai untuk menyusun faktor-faktor strategis perusahaan
adalah matrik SWOT. Matrik ini dapat menggambarkan secara jelas bagaimana
peluang dan ancaman eksternal yang dihadapi perusahaan dapat disesuaikan
dengan kekuatan dan kelemahan yang dimilikinya. Matrik ini dapat menghasilkan
empat set kemungkinan alternatif strategis (Rangkuti 2006). Tahapan analisis
SWOT disajikan pada Tabel 2.
22
Tabel 2 Tahapan Analisis SWOT
INTERNAL
EKSTERNAL
OPPORTUNITIES (O)
Tentukan 5 sampai 10
faktor peluang eksternal
TREATHS (T)
Tentukan 5 sampai 10
faktor ancaman eksternal
STRENGTHS (S)
Tentukan 5 sampai 10
faktor-faktor kekuatan
internal
Strategi SO
Ciptakan strategi yang
menggunakan kekuatan
untuk mengatasi ancaman
WEAKNESSES (W)
Tentukan 5-10 faktor-faktor
kelemahan internal
Strategi ST
Ciptakan strategi yang
menggunakan kekuatan
untuk mengatasi ancaman
Strategi WT
Ciptakan strategi yang
meminimalkan kelemahan untuk
memanfatkan peluang
Strategi WO
Ciptakan strategi yang
meminimalkan kelemahan untuk
memanfaatkan peluang
a. Strategi SO
Strategi ini dibuat berdasarkan jalan pikiran perusahaan, yaitu dengan
memanfaatkan seluruh kekuatan untuk merebut dan memanfaatkan seluruh
kekuatan untuk merebut dan memanfaatkan peluang sebesar-besarnya.
b. Strategi ST
Ini adalah strategi dalam menggunakan kekuatan yang dimiliki
perusaahaan untuk mengatasi ancaman.
c. Strategi WO
Strategi ini diterapkan berdasarkan pemanfaatan peluang yang ada dengan
cara meminimalkan kelemahan yang ada.
d. Strategi WT
Strategi ini di dasarkan pada kegiatan yang bersifat defensif dan berusaha
meminimalkan kelemahan yang ada serta menghindari ancaman (Rangkuti 2006).
Mikrosatelit
Analisis DNA pada M. azedarach L. dilakukan dengan menggunakan
metode mikrosatelit. Secara umum metode mikrosatelit terdiri dari:
a. Ekstraksi DNA
23
Ekstraksi DNA atau isolasi DNA merupakan metode pemisahan DNA dari
bahan-bahan yang tidak diperlukan. Metode ekstraksi DNA yang digunakan
metode CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide). Sebagian besar metode
untuk ekstraksi DNA dari jaringan tanaman menggunakan larutan buffer CTAB
sebagai pelisis dinding sel karena memiliki kelebihan dibandingkan dengan
metode lain, yaitu mudah dilakukan, kemungkinan adanya enzim pendegradasi
DNA lebih kecil dibandingkan metode lain (Rogers and Bendich 1994 dalam
Aritonang et al. 2007), dan dapat diterapkan pada segala jenis jaringan tanaman
seperti daun, benih, endosperm, dll.
b. Elektroforesis
Komponen bahan kimia terpenting yang digunakan dalam proses
elektroforesis adalah gel yang sudah terbentuk sumur. Elektroforesis bertujuan
untuk melihat migrasi DNA. Agar DNA dapat terlihat berpindah, maka DNA
dicampur dengan Blue Juice. DNA sebanyak 3 mikro liter dicampur dengan 2
mikro liter Blue juice 10 X. Campuran tersebut dimasukkan kedalam lubanglubang gel dalam bak elektroforesis yang mengandung larutan buffer dan dialiri
dengan arus listrik. DNA akan bermigrasi dari arah negatif (katode) ke arah
positif (anode) (Aritonang et al. 2007).
c. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30
kali. Setiap siklus terdiri dari tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR
dalam satu siklus:
1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada
suhu tinggi, 94–96°C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA
menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini
dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas
DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap
menjadi template ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA
template yang komplementer dengan urutan basanya. Ini dilakukan pada
suhu antara 45–60°C. Primer biasanya terdiri dari 10-20 nukleotida dan
dirancang berdasarkan daerah konservatif dalam genom tersebut. Makin
24
panjang primer, makin spesifik daerah yang diamplifikasi (Suryanto 2003).
Primer ini berperan sebagai opposite strand ketika double helix DNA
terpisah pada tahap denaturation dan penempelan ini bersifat spesifik. Suhu
yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer
menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari
jenis DNA-polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini
biasanya dilakukan pada suhu 72°C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit
(Aritonang et al. 2007).
PCR-Mikrosatelit
Prinsip proses PCR adalah suatu siklus berjangka pendek (dengan tiga
perubahan suhu yang berubah secara cepat. Reaksi PCR-Mikrosatelit dilakukan
dengan menggunakan 15 µl volume larutan yang terdiri dari H 2O 2,5 µl, primer
forward dan primer reserve masing-masing. Komposisi bahan-bahan yang
digunakan untuk PCR dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Komposisi bahan-bahan yang digunakan untuk PCR
No
1
2
3
4
5
Komponen
Cetakan DNA
Forward primer
Reserved primer
Nucleus free water
Green Go Taq Master Mix Kit
Jumlah
Volume (µl)
2,5
1,5
1,5
2,5
7,5
15,5
Untuk tahapan-tahapan dalam proses PCR-Mikrosatelit secara rinci dapat
dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Tahapan-tahapan dalam proses PCR-Mikrosatelit
No Tahapan
Suhu (0C)
Waktu (Menit)
1
2
3
4
5
Pre-denaturation
Denaturation
Annealing
Extention
Final Extention
(Aritonang et al. 2007).
95
95
55
72
72
2
2
1
2
5
Jumlah
siklus
1
39
1
25
Adapun primer yang digunakan dalam penelitian ini secara rinci dapat
dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5 Primer yang digunakan dalam analisis genetik PCR-Microsatelit
Locus
Ai_5
Repeat
motif
(CA)15
Ai_34
(GA)18
Ai_48
(CA)10
Primer sequences
F: GAAAGGAGGGTTTTCAAATCA
R: TCGGCCGAACACAATTTTA
F: ATTTGTGTGTGCGTGCTAGG
R: CGAGGAACTGAGACTCCTGAA
F: TCCCAGTTATTCAACGTAGGC
R: TCTTAATCATGGATTGCTTCACA
Ta
(0C)
55
Allele size
range (bp)
130–182
55
146–168
55
105–125
(Boontong et al. 2008).
Akrilamid
Untuk menguji kualitas DNA hasil PCR mikrosatelit, dilakukan
elektroforesis dengan menggunakan gel poliakrilamid hasil campuran dari larutan
akrilamid, TEMED dan Ammonium Persulfat (APS). Campuran gel poliakrilamid
dipanaskan, dan untuk selanjutnya gel diinjeksikan ke dalam cetakan berupa dua
lembar kaca yang direkatkan dengan bahan perekat yang berisi sisir untuk
membuat lubang elektroforesis. Buffer yang digunakan untuk elektroforesis
adalah buffer TBE 1 x. Elektroforesis dilakukan denga menggunakan aliran listrik
sebesar 120 W selama 1-3 jam. Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan
pewarnaan menggunakan shaker selama 30 menit. Selanjutnya pita DNA hasil
PCR mikrosatelit dilihat dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera
digital (Yunanto 2010).
Analisis Hasil PCR
Hasil dari kegiatan mikrosatelit difoto dan dianalisis dengan melakukan
scoring pola pita yang muncul. Pola pita yang muncul disajikan pada Gambar 2.
Hasil perhitungan kemudian dianalsis dengan menggunakan software POPGENE
32 Versi 1.31 dan NTSYS Versi 2.02 (Rohlf 1998 dalam Yunanto 2010).
26
Gambar 2 Cara Scoring DNA-Mikrosatelit.
Parameter genetik yang diukur dalam penelitian ini adalah variasi genetik
di dalam populasi dan antar populasi. Untuk keragaman genetik di dalam populasi
parameter yang diukur adalah:
1. Persentase Lokus Polimorfik (PLP)
2. Jumlah alel yang diamati (na)
3. Jumlah alel efektif (ne)
4. Heterozigositas harapan (He)
Sedangkan parameter yang diamati untuk keragaman genetik antar populasi
digunakan cluster analysis untuk menduga ada tidaknya hubungan kekerabatan
berdasarkan jarak genetik yang diperoleh (diadaptasi dari Kholik 2008).