4 II. TINJAUAN PUSTAKA A. Enzim Enzim adalah protein yang

4
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Enzim
Enzim adalah protein yang mengkatalisis reaksi-reaksi biokimia dalam sel dengan
konsentrasi yang sangat rendah (Kuchel and Gregory, 2002). Enzim mempunyai
berat molekul yang beraneka ragam berkisar 104 - 107 KDa (Dryer, 1993). Suatu
enzim dapat mempercepat reaksi 103 sampai 1012 kali lebih cepat dibandingkan
dengan reaksi yang tidak dikatalisis oleh katalis (Ngili, 2008). Enzim berfungsi
sebagai biokatalisator dalam sel dan sifatnya sangat khas, karena enzim hanya
bekerja pada substrat tertentu dan bentuk reaksi tertentu (Poedjiadi, 2006). Enzim
merupakan katalis biologik, yang mampu meningkatkan laju reaksi dengan cara
selektif dan efisien berdasarkan pada hukum termodinamika dan kinetika (Shahib,
2005).
1.
Klasifikasi enzim
Menurut Martoharsono (1993) enzim dapat diklasifikasi menjadi 6 kelas
berdasarkan fungsinya dan tiap kelas mempunyai beberapa subkelas
berdasarkan IUPAC:
5
a.
Oksidoreduktase, dibagi menjadi 5 sub-golongan mengkatalisis substrat
yang bergugus fungsional; >CHOH, >C=O, >C=CH-, >CH-NH2,
>CH-NH-.
b.
Transferase, enzim yang memindahkan gugus berkarbon 1, aldehidik/
ketonik, asil, fosfat dan gugus yang mengandung S.
c.
Hidrolase, enzim yang berkerja menghidrolisis substrat yang dibagi
menjadi enzim yang menghidrolisis senyawa; ester, glikosidik, peptida,
lain-lain ikatan C-N dan anhidrida.
d.
Liase, dibagi menjadi 3 sub-golongan mengkatalisis reaksi addisi
terhadap ikatan; >C=C<, C=O, C=N-.
e.
Isomerase yang mengkatalisis semua reaksi isomer dan resemase.
f.
Ligase yang mengkatalisis pembentukan ikatan karbon-oksigen, karbonsulfur, karbon-nitrogen dan karbon-atom lainnya.
Energi yang
diperlukan untuk pembentukan ikatan diperoleh dari hidrolisis ATP.
2.
Teori pembentukan enzim-substrat
Menurut Shahib (2005) ada dua teori pembentukan kompleks enzim-subtrat
yaitu :
a.
Teori lock and key (gembok dan kunci)
Substrat yang spesifik akan terikat pada sisi aktif enzim.
Substrat
mempunyai daerah polar dan non-polar pada sisi aktif yang baik bentuk
maupun muatannya merupakan pasangan substrat (Gambar 1). Hal ini
terjadi karena adanya rantai peptida yang mengandung rantai residu
menuntun substrat untuk berinteraksi dengan residu katalitik. Ketika
6
katalisis berlangsung, produk masih terikat pada molekul enzim.
Kemudian produk akan bebas dari sisi aktif dengan terbebasnya enzim.
b.
Teori induced-fit (ketetapan induksi)
Teori ini menerangkan bahwa enzim bersifat fleksibel, karena
sebelumnya bentuk sisi aktif tidak sesuai dengan bentuk substrat, tetapi
setelah substrat menempel pada sisi aktif, maka enzim akan terinduksi
dan menyesuaikan dengan bentuk substrat seperti pada Gambar 1.
Enzim
Substrat
Sisi Aktif Enzim
Active Site
Teori kunci gembok
Sisi aktif cenderung kaku
Enzim
Sisi Aktif Enzim Substrat
Active Site
Teori kecocokan induksi
Sisi aktif lebih fleksibel
Gambar 1. Teori kunci gembok dan teori induksi (Shahib, 2005).
3.
Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim
a. Suhu
Sebagian enzim mengalami denaturasi pada suhu diatas 50°C. Dengan
kenaikan suhu, maka laju reaksi enzim akan meningkat dan akhirnya
kehilangan seluruh aktivitasnya, seperti pada Gambar 2. Sebagian besar
enzim berfungsi secara optimal antara suhu 25-37oC (Page, 1997). Suhu
inkubasi yang lebih tinggi dari suhu optimum kerja enzim dapat
menyebabkan terjadinya perubahan konformasi sisi aktif enzim akibat
denaturasi protein enzim.
7
Aktivitas
Enzim
Suhu
Gambar 2. Hubungan suhu dengan aktivitas enzim (Shahib, 2005).
b. pH
pH sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim, karena sifat ionik gugus
karboksil dan gugus amino mudah dipengaruhi oleh pH. Hal ini dapat
menyebabkan daerah katalitik dan konformasi enzim menjadi berubah.
Selain itu perubahan pH juga menyebabkan denaturasi enzim dan
mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim yang dapat dilihat pada
Gambar 3 (Page, 1997).
pH optimum
Aktivitas
Enzim
pH
Gambar 3. Hubungan pH dengan aktivitas enzim (Shahib, 2005).
8
c. Konsentrasi enzim
Konsentrasi enzim secara langsung mempengaruhi kecepatan laju reaksi
enzimatik dimana laju reaksi
meningkat
dengan bertambahnya
konsentrasi enzim (Poedjiadi, 2006). Laju reaksi tersebut meningkat
secara linier selama konsentrasi enzim jauh lebih sedikit dari pada
konsentrasi substrat.
Hal ini biasanya terjadi pada kondisi fisiologis
(Page, 1997).
d. Konsentrasi substrat
Laju reaksi mula-mula meningkat dengan bertambahnya konsentrasi
substrat.
Akan tetapi setelah peningkatan substrat lebih lanjut akan
tercapai suatu laju maksimum. Pada keadaan substrat yang berlebih akan
terjadi kejenuhan pembentukan kompleks enzim substrat sehingga
sebagian besar substrat tidak diubah menjadi produk.
Penambahan
substrat lebih lanjut tidak berakibat terhadap laju reaksi (Kuchel and
Gregory, 2002). Hubungan antara konsentrasi substrat dengan laju reaksi
enzim ditunjukkan dalam Gambar 4.
Vmaks
V (laju)
½ Vmaks
Km
[S]
Gambar 4. Hubungan konsentrasi substrat dengan laju reaksi enzim
(Shahib, 2005).
9
e. Inhibitor
Inhibisi atau hambatan reaksi enzim adalah penurunan kecepatan reaksi
enzimatik akibat adanya suatu senyawa kimia tertentu dalam larutan
enzim substrat (Mara, 1999). Pada umumnya cara kerja inhibitor adalah
dengan menyerang sisi aktif enzim sehingga enzim tidak dapat lagi
berikatan dengan substrat dan fungsi katalitiknya terganggu (Winarno,
1986).
B. Bacillus subtilis
Bacillus merupakan salah satu mikroba golongan bakteri. Sebagian besar bakteri
genus Bacillus pada umumnya hidup di tanah, tumbuh pada kondisi mesofillik,
yaitu pada kisaran temperatur 25-35°C dan pH 7-8, diantaranya adalah B.subtilis,
B.lincheniformis, B.megatarium, B.pumilis dan kelompok B.spaericus. Selain di
tanah, beberapa jenis Bacillus juga ditemukan di lumpur dan di muara yaitu
B.firmus dan B.lentus.
Selain ditemukan di kedua habitat di atas, ada juga
beberapa jenis Bacillus yang hidup di laut misalnya B.marinus, B.cirroflagelosus,
B.epiphytes dan B.filicolonicus (Priest, 1993).
Mikroorganisme ini bersifat gram positif dan bersifat aerob (Schlegel and
Schmidt, 1994). B.subtilis berbentuk batang lurus gram positif berukuran 1,5 x
4,5 μ, sendiri-sendiri atau tersusun dalam bentuk rantai bergerak dan tidak
bersimpai (Gupte, 1990).
10
C. Protease
Protease merupakan biokatalisator untuk reaksi pemecahan molekul protein
menjadi oligopeptida dan asam amino (Poedjiadi, 2006). Enzim protease yang
digunakan dalam bidang industri umumnya dihasilkan oleh mikroorganisme
karena memiliki beberapa keunggulan. Adanya mikroorganisme yang unggul
merupakan salah satu faktor penting dalam usaha produksi enzim. Mikroba yang
telah dikembangkan secara komersial sebagai penghasil protease antara lain B
licheniformis, B.stearothermophilus, B.pumilus, Aspergillus oryzae dan A.niger.
Industri pengguna protease diantaranya ialah industri deterjen, kulit, tekstil,
makanan, hidrolisat protein, pengolahan susu, farmasi, makanan, bir, film dan
limbah (Wilda et al., 2013).
Enzim ini akan mengkatalis reaksi hidrolisis, yaitu reaksi yang melibatkan unsur
air pada ikatan spesifik substrat. Karena itu, enzim ini termasuk dalam kelas
utama enzim golongan hidrolase. Berdasarkan cara kerjanya, enzim protease
dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu endopeptidase (memecah ikatan peptida
dari arah dalam) dan eksopeptidase (memecah protein dan ikatan peptida dari arah
luar; arah gugus karboksil terminal atau gugus amino terminal) (Winarno,1986).
11
Mikroba endoprotease secara umum diklasifikasikan ke dalam 4 golongan
berdasarkan residu asam amino yang berada pada sisi aktifnya (Witazora, 2008),
yaitu:
1.
Protease serin
Protease yang memiliki residu serin pada sisi aktifnya dan dapat dihambat
oleh hidroksil-organofluorida reaktif, seperti diisopropilfluorofosfat dan
fenilmetilsulfonilfluorida
endopeptidase.
(PMSF).
Semua
enzim
tersebut
bersifat
Enzim yang termasuk golongan ini adalah tripsin,
kimotripsin, elastase dan subtilin.
2.
Protease sulfidril atau tiol
Protease yang mempunyai sulfidril pada sisi aktifnya yang distimulasi dengan
agen pereduksi seperti ditiotreitol dan sistein serta dapat dihambat oleh
senyawa oksidator, alkilator dan logam berat.
Enzim yang termasuk
golongan ini adalah protease dari tanaman (bromelin, papain, fisin) dan
protease mikroba. Aktivitas enzim ini optimal pada pH netral.
3.
Protease logam
Protease yang keaktifannya bergantung pada adanya ion logam (protease
netral dan protease alkali) sebagai aditif umumnya ditambahkan garam Ca2+
dalam bentuk garam klorida (Schwimmer, 1981). Kation-kation yang dapat
mengaktifkan enzim adalah Na+, K+, Rb+, Cs+, Mg2+, Zn2+, Cr3+, Cu2+, Fe2+,
Co2+, Ni2+ dan Al3+. Keaktifannya dapat dihambat oleh EDTA (Ethylene
Diamine Tetra Acetic Acid).
12
4.
Protease asam
Protease yang mempunyai dua gugus karboksil pada sisi aktifnya dan
memiliki residu aspartat atau glutamat pada titik isoelektrik sekitar pH 3,5
yang dapat dihambat oleh p-bromofenasilbromida. Enzim yang termasuk
golongan ini adalah pepsin, renin dan protease kapang.
D. Kinetika Reaksi Enzim
Pada tahun 1913 Michaelis-Menten menunjuk pada mekanisme berikut untuk
menjelaskan kekuatan reaksi-reaksi enzim.
E + S
(x) (y)
ES
(xy)
Hasil
Dimana E = enzim, ES = kompleks enzim substrat, dan S = substrat, sedangkan
[S] >> [E] dan [ES]. Transformasi persamaan Michaelis-Menten yang paling
banyak digunakan adalah “double reciprocal” Lineweaver-Burk, dengan
menggabung persamaan Michaelis-Menten.
Plot dari pasangan data (1/[S]0i, 1/v0i), untuk i = 1,..., n, dengan n adalah jumlah
pasangan data, akan memberikan suatu garis lurus dengan ordinat dan absis
intercept 1/Vmaks dan -1/Km pada Gambar 5 (Ngili, 2008).
V0 
Vmaks S
K M  [S]
1 K M  [S]

V0
Vmaks [S]
Persamaan Michaelis-Menten
13
1
K
1
1
 M

V0 Vmaks S  Vmaks
Persamaan Lineweaver-Burk
1
V0
Slope 
KM
Vmaks
1
Vmaks
1

KM
1
S 
Gambar 5. Diagram Lineweaver-Burk ( Suhartono, 1989).
E. Stabilitas Enzim
Stabilitas enzim dapat diartikan sebagai kestabilan aktivitas enzim selama
penyimpanan dan penggunaan enzim tersebut, serta kestabilan terhadap senyawa
yang bersifat merusak seperti pelarut tertentu (asam atau basa), oleh pengaruh
suhu kondisi-kondisi non fisiologis lainnya (Kazan et al., 1997). Stabilitas enzim
merupakan sifat penting yang harus dimiliki oleh enzim sebagai biokatalis.
Banyak faktor yang mempengaruhi stabilitas enzim, seperti pH, suhu, kofaktor
dan kehadiran surfaktan (Eijsink et al., 2005).
Terdapat dua cara yang dapat dilakukan untuk mendapatkan enzim yang
mempunyai stabilitas tinggi, yaitu menggunakan enzim yang memiliki stabilitas
ekstrim alami dan mengusahakan peningkatan stabilitas enzim yang secara alami
14
tidak atau kurang stabil (Junita, 2002).
Menurut Illanes (1999), untuk
meningkatkan stabilitas enzim dapat dilakukan dengan penggunaan zat aditif,
modifikasi kimia, amobilisasi dan rekayasa protein.
1.
Stabilitas termal enzim
Pada suhu yang terlalu rendah kemantapan enzim tinggi, tetapi aktivitasnya
rendah. Sedangkan pada suhu yang terlalu tinggi aktivitas enzim tinggi,
tetapi kemantapannya rendah. Daerah suhu saat kemantapan dan aktivitas
enzim cukup besar disebut suhu optimum (Wirahadikusumah, 2001).
Dalam industri, pada proses reaksinya menggunakan suhu tinggi bertujuan
untuk mengurangi tingkat kontaminasi dan masalah viskositas serta
meningkatkan laju reaksi. Namun, suhu tinggi merupakan masalah utama
dalam stabilitas enzim, karena enzim umumnya tidak stabil pada suhu tinggi.
Proses inaktivasi enzim pada suhu tinggi berlangsung dalam dua tahap, yaitu :
a. Adanya pembukaan partial (partial unfolding) struktur sekunder, tersier
dan atau kuartener molekul enzim.
b. Perubahan struktur primer enzim karena adanya kerusakan asam aminoasam amino tertentu oleh panas (Ahern and Klibanov, 1987).
Air memegang peranan penting pada kedua tahap di atas. Oleh karena itu,
dengan menggunakan air seperti pada kondisi mikroakueus, reaksi inaktivasi
oleh panas dapat diperlambat dan stabilitas termal enzim akan meningkat.
15
Stabilitas termal enzim akan jauh lebih tinggi dalam kondisi kering
dibandingkan dalam kondisi basah. Adanya air sebagai pelumas membuat
konformasi suatu molekul enzim menjadi sangat fleksibel, sehingga bila air
dihilangkan molekul enzim akan menjadi lebih kaku (Virdianingsih, 2002).
2.
Stabilitas pH enzim
Semua reaksi enzim dipengaruhi oleh pH medium tempat reaksi terjadi
(Suhartono, 1989). Stabilitas enzim dipengaruhi oleh banyak faktor seperti
suhu, pH, pelarut, kofaktor dan kehadiran surfaktan (Eijsink et al., 2005).
Dari faktor-faktor tersebut, pH memegang peranan penting. Diperkirakan
perubahan keaktifan pH lingkungan disebabkan terjadinya perubahan ionisasi
enzim, substrat atau kompleks enzim substrat. Enzim menunjukkan aktivitas
maksimum pada kisaran pH optimum enzim dengan stabilitas yang tinggi
(Winarno, 1986).
Pada reaksi enzimatik, sebagian besar enzim akan kehilangan aktivitas
katalitiknya secara cepat dan irreversibel pada pH yang jauh dari rentang pH
optimum untuk reaksi enzimatik.
Inaktivasi ini terjadi karena unfolding
molekul protein sebagai hasil dari perubahan kesetimbangan elektrostatik dan
ikatan hidrogen (Kazan et al., 1997).
F. Isolasi dan Pemurnian Enzim
Enzim dapat diisolasi secara ekstraseluler dan intraseluler. Enzim ekstraseluler
merupakan enzim yang bekerja di luar sel, sedangkan enzin intraseluler
16
merupakan enzim yang bekerja di dalam sel. Ekstraksi enzim ekstraseluler lebih
mudah dibandingkan ekstraksi dari intraseluler, karena tidak memerlukan
pamecahan sel, dan enzim yang dikeluarkan dari sel mudah dipisahkan dari
pengotor lain serta tidak banyak bercampur dengan bahan-bahan sel lain (Pelczar
and Chan, 1986).
Proses pengisolasian dan pemurnian enzim berlangsung beberapa tahapan sebagai
berikut:
1.
Sentrifugasi
Proses ini bertujuan untuk memisahkan enzim dari sisa-sisa dinding sel,
dimana molekul yang memiliki berat molekul tinggi dapat mengendap
didasar tabung dengan cepat bila disentrifugasi dengan kecepatan tinggi.
Kecepatan pengendapan molekul bergantung pada beberapa faktor, yaitu
berat molekul, bentuk molekul dan viskositas larutan.
Proses ini akan
menimbulkan panas, sehingga dapat mendenaturasi enzim.
Untuk
menghindarinya maka sentrifugasi dilakukan pada suhu 2-4oC (sentrifugasi
dingin). Sel-sel mikroba biasanya mengalami sedimentasi pada kecepatan
5000 rpm selama15 menit (Scopes, 1982).
Prinsip sentrifugasi berdasarkan pada kenyataan bahwa setiap partikel yang
berputar pada laju sudut yang konstan akan memperoleh gaya keluar (F).
Besar gaya ini tergantung pada laju sudut ω (radian/detik) dan radius
pertukarannya (cm) ( Sariningsih, 2000)
17
2.
Fraksinasi dengan ammonium sulfat [(NH4)2SO4]
Cara pemurnian enzim yang umum dilakukan adalah dengan proses
pengendapan bertahap atau biasa disebut sebagai fraksinasi. Fraksinasi yang
sering dilakukan adalah dengan senyawa elektrolit menggunakan garam
ammonium sulfat, natrium klorida atau natrium sulfat (Suhartono et al.,
1992).
Menurut Wirahadikusumah (2001), meningkatnya kekuatan ion akan
menyebabkan kelarutan enzim semakin besar yang disebut dengan salting in.
Jika kandungan ion semakin tinggi akan menyebabkan kelarutan enzim
menurun dan mengendap yang disebut dengan salting out.
Ammonium sulfat sering dipakai untuk mengendapkan enzim karena
kelebihannya, yaitu: kebanyakan enzim tahan terhadap garam tersebut (tidak
terdenaturasi), memiliki kelarutan yang besar, mempunyai daya pengendapan
yang cukup besar dan mempunyai efek penstabil terhadap kebanyakan enzim.
Perlakuan penambahan ammonium sulfat dilakukan dengan meningkatkan
kejenuhan dari larutan enzim, dengan pembagian fraksi : (0-20)% jenuh, (2040)% jenuh, (60-80)% jenuh, dan (80-100)% jenuh. Pengendapan ini dikenal
sebagai salting out (Judoamidjojo et al.,1989).
3.
Dialisis
Dialisis adalah proses pemisahan molekul terlarut berdasarkan ukuran
molekulnya menggunakan membran semipermeabel berdasarkan difusi
partikel zat terlarut. Membran yang biasa digunakan adalah selofan yang
18
berbentuk selang. Difusi zat terlarut bergantung pada suhu dan viskositas
larutan. Pada suhu tinggi laju difusi meningkat, tetapi sebagian besar protein
dan enzim akan terdenaturasi. Proses dialisis harus dilakukan pada suhu 48°C dalam ruang dingin, karena protein dan enzim stabil pada suhu tersebut
(Pohl, 1990).
Molekul dengan berat molekul lebih kecil dari 20.000 Dalton dapat melalui
membran, sedangkan yang berat molekulnya lebih besar akan tertahan di
dalam membran (Baehaki et al., 2011). Jika membran berisi larutan protein
atau enzim dimasukkan dalam larutan buffer, maka molekul kecil dalam
larutan protein atau enzim akan keluar dari pori-pori membran seperti garam
anorganik dan molekul protein atau enzim yang berukuran besar tetap dalam
membran.
Keluarnya molekul menyebabkan distribusi ion-ion tidak
seimbang di dalam dan di luar membran. Untuk memperkecil pengaruh ini
digunakan larutan buffer dengan konsentrasi rendah di luar membran
(Lehninger, 1982).
Molekul yang lebih kecil akan terus terdifusi keluar
membran hingga ion-ion dalam membran seimbang atau dapat diabaikan
(Boyer, 1993).
G. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry.
Penentuan kadar protein bertujuan untuk mengetahui bahwa protein enzim masih
terdapat pada tiap fraksi pemurnian dengan aktivitas yang atau tetap baik.
Penentuan kadar protein dengan Metode Lowry didasarkan pada pengukuran
serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang berwarna ungu. Ini terjadi karena
19
protein bereaksi dengan tembaga dalam lingkungan alkali yang mudah larut,
dimana kompleks Cu2+ dengan ikatan peptida akan tereduksi menjadi Cu+. Cu+
akan mereduksi folin-ciocalteuo yang mengikat protein sekitar pH 10. Sehingga
komplek
fosfomolibdat-fosfotungstat
menghasilkan
tungesteen
blue
atau
heteropolymolybdenum dari warna kuning menjadi biru. Ini disebabkan karena
oksidasi gugus aromatik terkatalis Cu, sehingga menghasilkan komplek berwarna
biru dalam derajat yang berbeda tergantung pada komposisi triftofan dan
tirosinnya. Karena itu, protein yang berbeda akan memberikan tingkat warna
yang berbeda (Alexander and Griffith, 1993).
Metode ini relatif sederhana dan dapat diandalkan serta biayanya relatif murah.
Namun, metode ini mempunyai kelemahan yaitu sensitif terhadap perubahan pH
dan konsentrasi protein yang rendah. Untuk mengatasinya adalah dengan cara
menggunakan volume sampel yang sangat kecil sehingga tidak mempengaruhi
reaksi ( Lowry et al., 1951).
H. Modifikasi Kimia
Modifikasi kimia adalah salah satu metode yang dapat digunakan untuk
meningkatkan stabilitas enzim yang larut dalam air. Menurut Mozhaev et al.,
(1990), modifikasi kimia enzim dengan senyawa berbobot molekul rendah
merupakan metode yang paling sederhana dapat dilakukan. Proses modifikasi
dilakukan dengan cara menginkubasi larutan enzim dengan larutan pemodifikasi.
Enzim yang telah termodifikasi dapat dipisahkan dari campuran melalui dialisis
atau kromatografi kolom penyaringan molekul. Berdasarkan struktur enzim,
20
gugus fungsi yang kemungkinannya paling besar bereaksi dengan zat
pemodifikasi adalah gugus fungsi yang terletak pada permukaan. Sedangkan
gugus ε-amino dari lisin merupakan gugus paling banyak dilibatkan, karena gugus
ini paling melimpah dan paling mudah didekati dari rantai samping asam amino
suatu enzim (Janecek, 1993).
Untuk mendapatkan enzim hasil modifikasi kimia dengan ikatan kovalen yang
stabil adalah dengan melakukan :
1.
Modifikasi dengan menggunakan pereaksi bifungsional (pembentukan ikatan
silang antara gugus-gugus fungsi pada permukaan protein).
Modifikasi ini memungkinkan terbentuknya ikatan silang dengan gugus
fungsional pada permukaan enzim.
Pereaksi bifungsional merupakan
senyawa yang memiliki dua gugus fungsional yang berikatan silang dengan
pereaksi penyambung silang (cross-linking reagents). Pereaksi penyambung
dibuat dengan menghubungkan dua gugus spesifik pereaksi modifikasi kimia
bersama dengan rantai karbon sederhana. Panjang penyambung bervariasi
untuk
memudahkan
pengukuran
jarak
dan
pembelajaran
topologi.
Kebanyakan penyambung memiliki penyambung yang sederhana, rantai inert,
dan reaksi ikatan silang yang ireversibel.
Pereaksi penyambung berupa
homobifungsional (mengandung dua gugus reaktif yang sama) atau
heterobifungsional (mengandung dua gugus reaktif yang berbeda).
21
2. Modifikasi kimia dengan menggunakan pereaksi non polar (meningkatkan
interaksi hidrofobik)
Modifikasi dengan pereaksi nonpolar yang menambah ataupun menguatkan
interaksi hidrofobik dapat dilakukan dengan anhidrida asam. Sejalan dengan
reaksi umum antara anhidrida asam dengan nukleofil, maka rantai samping
asam amino yang reaktif (sebagai nukleofil) adalah gugus amina primer dari
lisin (Mozhaev and Martinek, 1984).
3. Penambahan gugus polar bermuatan atau polar baru (menambah ikatan ionik
atau hidrogen)
4. Hidrofilisasi permukaan protein (mencegah terjadinya kontak antara gugus
hidrofobik dengan lingkungan berair yang tidak disukainya)
Hidrofilisasi ini dapat dilakukan dengan dua cara modifikasi langsung
berbagai asam amino hidrofobik yang membentuk tapak-tapak hidrofobik
pada permukaan enzim dengan pereaksi hidrofilik, atau hidrofilisasi terhadap
asam amino yang berada dekat dengan tapak hidrofobik sehingga tapak
tersebut terlindungi dari lingkungan berair pada gambar dibawah ini
(Nubarov et al. 1987).
22
Gambar 6. Reaksi sitrakonat anhidrida dan gugus amina
(Nubarov et al. 1987).
Molekul dengan
ikatan amina
Sitrakonat
anhidrida
Cincin terbuka
dan membentuk
ikatan amida
Gambar 7. Modifikasi gugus amina suatu residu lisin dalam protein oleh
sitrakonat anhidrida (Khajeh et al., 2004).
Sitrakonat anhidrida merupakan reagen spesifik yang digunakan untuk memblok
gugus amino pada residu lisin, modifikator ini menghasilkan dua produk ikatan
peptida yang dibentuk dari kedua gugus karbonil pada struktur molekulnya.
Reaksi modifikasi ini diawali dengan pembukaan cincin sitrakonat anhidrida
dengan suasana basa yakni pada pH 8 dan kemudian gugus karbonil dari
sitrakonat anhidrida berikatan dengan gugus amino pada residu lisin (Khajeh et
al., 2004).