pdf fixx - IPB Repository

PENDAHULUAN
Aril propionat dan turunannya merupakan
bahan obat kiral yang termasuk dalam
kelompok obat antiinflamasi non-steroid
(AINS). Penggunaan utama AINS adalah
sebagai anti peradangan, analgesik dan
antipiretik melalui penghambatan kerja enzim
siklooksigenase (COX) pada pembentukan
prostaglandin. Senyawa AINS secara luas
digunakan dalam pengobatan penyakit asam
urat, osteoarthritis, nyeri pada otot dan tulang
maupun penyembuhan pada pasien pasca
operasi (Nogrady 1988).
Aktivitas aril propionat sebagai senyawa
obat
sangat
dipengaruhi
oleh
sifat
kekiralannya. Secara umum S-enansiomer
lebih
efektif
sebagai
senyawa
obat
dibandingkan dengan R-enansiomer yang
cenderung bersifat toksik (Caldwell et al 1988,
diacu dalam Layh et al 1994 ). Oleh karena itu
konsumsi AINS umumnya disertai efek
samping yang tidak sedikit seperti gangguan
pada lambung, ginjal dan proses pembekuan
darah (Soelistiono 2004). Sampai saat ini,
senyawa AINS kecuali naproksen, masih
dipasarkan dalam bentuk rasemat. Sintesis aril
propionat secara kimiawi hanya mampu
menghasilkan senyawa rasemat dan bukan Senansiomer
murni,
sehingga
proses
pemurniannya memerlukan biaya produksi
yang tinggi.
Senyawa AINS secara prinsip dapat
dihasilkan melalui biotransformasi senyawa
nitril atau amida secara enansioselektif yang
melibatkan enzim nitrilase, nitril hidratase dan
amidase. Enzim nitril hidratase dan amidase
dari Rhodococcus sp C311 dilaporkan mampu
menghasilkan S-enansiomer dari rasemat
naproksen amida (Layh et al 1994). Proses ini
memiliki
kelebihan dibandingkan dengan
reaksi kimia biasa, antara lain dapat
menghasilkan
produk
dengan
tingkat
kemurnian yang lebih tinggi, kondisi reaksi
yang lebih terkendali dan lebih ramah
lingkungan.
Penelitian ini bertujuan menapis beberapa
isolat bakteri penghasil amidase, menguji
kemampuan isolat bakteri terpilih dalam
mensintesis enzim amidase, serta menentukan
karakteristik, kinetika dan kondisi optimum
enzim amidase untuk proses biotransformasi
propionamida. Hipotesis penelitian ini adalah
isolat penghasil enzim amidase dapat
diperoleh
melalui
penapisan
bakteri
berdasarkan
kemampuannya
untuk
mendegradasi propionamida. Enzim amidase
dengan karakteristik tertentu dapat dihasilkan
dari isolat bakteri terpilih.
TINJAUAN PUSTAKA
Biotransformasi
Biotransformasi
merupakan
proses
modifikasi senyawa organik yang dikatalisis
oleh enzim yang dihasilkan mikroorganisme
tertentu. Biotransformasi memiliki beberapa
keunggulan dibandingkan dengan reaksi kimia
biasa. Reaksi enzimatik bersifat spesifik
terhadap substrat, sehingga produk samping
yang dihasilkan relatif kecil. Selain itu, proses
biotransformasi bersifat stereospesifik dalam
arti jika materi awal yang digunakan berupa
campuran rasemat, maka hanya akan ada satu
enansiomer spesifik yang akan dikonversi
sehingga proses ini akan menghasilkan produk
yang bersifat optis aktif (Crueger & Crueger
1984). Keunggulan lain proses biotransformasi
adalah kondisi reaksi yang tidak terlalu
ekstrim. Pada umumnya reaksi enzimatik
berlangsung pada suhu rendah (kurang dari
40 °C) dan cakupan pH mendekati normal
(Leunberger & Kieslich 1987). Reaksi
biotransformasi terdiri dari beberapa jenis
diantaranya
reaksi
oksidasi
reduksi,
isomerisasi, hidrolisis dan kondensasi. Dalam
skala industri hidrolisis enzimatik banyak
digunakan dalam produksi L-asam amino
murni. Umumnya L-asam amino ataupun
senyawa enansiomer murni yang lain bahan
awal industri obat-obatan dan pemanis buatan
seperti aspartam (Faber 1999).
Untuk mendapatkan hasil maksimal
biotransformasi dapat dilakukan dalam sebuah
bioreaktor. Bioreaktor berperan dalam
pencapaian
kondisi
optimal
untuk
pertumbuhan sel yang akan memproduksi
berbagai
metabolit.
Dalam
proses
pertumbuhannya pada sistem tertutup (batch),
bakteri umumnya melalui 4 fase pertumbuhan
yaitu fase pertumbuhan lamban (fase lag), fase
pertumbuhan cepat (fase log), fase stasioner
dan fase kematian. Waktu yang dibutuhkan
oleh sel untuk menggandakan dirinya disebut
waktu generasi (td). Kebanyakan bakteri
memiliki waktu generasi 1-3 jam. Beberapa
bakteri bahkan mempunyai waktu regenerasi
yang sangat singkat sampai 10 menit.
Beberapa protozoa dan alga memiliki waktu
generasi 24 jam atau lebih (Brock & Madigan
1988). Konstanta laju pertumbuhan (µ) untuk
mengukur banyaknya generasi per unit waktu
pada pertumbuhan eksponensial. Nilai td dan
2
µ dapat ditentukan dengan rumus (Pelczar &
Chan 1986):
td =
t
→ µ = ln2
3.3 log
td
dengan t: selang waktu pengukuran, B:
populasi awal, b: populasi setelah waktu t.
Optimasi
proses
fermentasi
perlu
dilakukan untuk mendapatkan metabolit yang
diinginkan dalam jumlah besar. Optimasi
antara lain dilakukan terhadap media
fermentasi maupun kondisi bioreaktor.
Optimasi media fermentasi dapat dilakukan
melalui penentuan komposisi nutrien meliputi
sumber karbon, sumber nitrogen, sumber air,
mineral dan bahan tambahan lain seperti
vitamin maupun keberadaan induktor atau
inhibitor. Optimasi terhadap bioreaktor antara
lain melalui pengaturan kecepatan agitasi
maupun aerasi untuk fermentasi aerobik
(Schugerl & Sittig 1987). Terdapat tiga sistem
fermentasi yaitu sistem batch, feed batch dan
continue. Sistem batch disebut juga sebagai
sistem tertutup, karena pada sistem ini tidak
ada penambahan medium maupun pemanenan
produk selama proses fermentasi. Pada sistem
feed batch terjadi penambahan medium segar
atau komponen medium selama proses
fermentasi dan pemanenan produk dilakukan
pada akhir proses fermentasi. Sistem ini
banyak digunakan pada produksi ragi roti dan
penicillin. Sedangkan pada sistem continue
terjadi penambahan media segar dan
pemanenan produk secara terus menerus
selama proses fermentasi berlangsung. Tujuan
utama sistem ini adalah memperpanjang fase
eksponensial maupun pembentukan produk
(Crueger, Crueger 1984).
Karakteristik Enzim
Enzim merupakan protein yang memiliki
aktivitas katalitik yang sangat tinggi jauh lebih
besar dari katalisator sintetik. Spesifitas enzim
sangat tinggi terhadap substratnya melalui
pengikatan pada sisi aktif sehingga enzim
dapat mempercepat suatu reaksi kimia spesifik
tanpa
menghasilkan
produk
samping.
Aktivitas katalitik suatu enzim bergantung
pada integritas strukturnya sebagai protein.
Seperti halnya protein, struktur tiga dimensi
enzim dapat berubah oleh panas, perlakuan
pH yang jauh menyimpang dari keadaan
normalnya maupun oleh perlakuan dengan
senyawa perusak lainnya. Berdasarkan jenis
reaksi yang dikatalisis enzim digolongkan
menjadi enam kelas yaitu oksidoreduktase
yang berperan dalam pemindahan elektron,
transferase terlibat dalam reaksi pemindahan
gugus fungsional, hidrolase terlibat dalam
reaksi hidrolisis, liase terlibat dalam
penambahan gugus, Isomerase yang terlibat
dalam pembentukan isomer serta enzim ligase
yang berperan dalam pembentukan ikatan
karbon (Lehninger 1982)
Kofaktor dan koenzim sering kali
diperlukan untuk aktivitas enzim secara
optimal. Kofaktor biasanya berupa ion logam
seperti ion Fe2+, Mn2+ atau Zn2+ sedangkan
koenzim biasanya merupakan molekul organik
kompleks seperti FAD, NAD atau koenzim A.
Baik kofaktor maupun koenzim dapat terikat
kuat pada molekul enzim yang dalam hal ini
disebut gugus prostetik. Selain itu aktivitas
enzim sangat bergantung pada konsentrasi
substrat, pH, suhu dan keberadaan inhibitor.
Seperti halnya protein, enzim memiliki pH dan
suhu optimum untuk aktivitasnya. Energi
aktivasi suatu enzim dapat ditentukan melalui
turunan persamaan Arrhenius dengan rumus
(Sadikin 2002) :
Log v = - Ea 1/T + konstanta
2.303R
Keterangan
v : Kecepatan reaksi enzim (mmol/mL min)
Ea : Energi aktivasi (kJ/mol)
R : konstanta gas (8.314 J/mol K)
T : Suhu (K)
Aktivitas enzim pada pH tertentu
menggambarkan gugus penerima atau pemberi
proton pada sisi aktif enzim berada pada
tingkat ionisasi yang diinginkan. Hubungan
konsentrasi substrat dengan kecepatan reaksi
enzim dapat digambarkan secara matematis
melalui persamaan Michaelis-Menten. Seperti
terlihat pada Gambar 1 umumnya konsentrasi
susbstrat berbanding lurus dengan kecepatan
reaksi enzimatik sampai pada titik tertentu saat
reaksi tidak akan berlangsung lebih cepat
karena sisi aktif enzim sudah jenuh berikatan
dengan substrat (Lehninger 1982).
Gambar 1 Kurva hubungan konsentrasi
substrat dengan kecepatan reaksi
enzim.
Enzim Pendegradasi Nitril
Senyawa nitril banyak disintesis oleh
tanaman, bakteri, fungi dan serangga.
3
Hidrolisis secara regioselektif sangat sulit
dilakukan dengan menggunakan katalis biasa.
Oleh karena itu, penggunaan enzim
pendegradsi nitril dari sel mikrob banyak
dipilih untuk tujuan tersebut. Seperti terlihat
pada Gambar 2, terdapat dua lintasan utama
degradasi senyawa nitril secara biokimia.
Lintasan pertama adalah degradasi nitril satu
tahap dengan menggunakan enzim nitrilase.
Pada proses ini nitril didegradasi menjadi
asam karboksilat dan amonia. Lintasan kedua
adalah degradasi nitril melalui dua tahap
dengan menggunakan enzim nitril hidratase
dan amidase. Pada tahap pertama nitril
didegradasi oleh nitril hidratase melalui reaksi
hidrolisis menjadi amida. Pada tahap
berikutnya amida yang terbentuk diubah
menjadi asam karboksilat dan amonia (Faber
1999).
Kedua jalur degradasi ini dapat terjadi
secara bersamaan pada mikrob yang memiliki
ketiga enzim tersebut. Umumnya, lintasan
degradasi satu tahap cenderung terjadi pada
senyawa nitril aromatik. Sedangkan senyawa
nitril alifatik cenderung mengalami degradasi
2 tahap melalui kerja enzim nitril hidratase
dan amidase (Tauber et al 2000).
Gambar 2 Lintasan hidrolisis senyawa
nitril secara enzimatik.
Amidase
Amidase
(EC
3.5.1.4)
merupakan
kelompok enzim hidrolase yang mengkatalisis
reaksi hidrolisis senyawa amida pada ikatan
atom C dan N menjadi asam karboksilat dan
amonia. Enzim ini memiliki nama sistematik
acylamide amidohydrolase dan banyak
berperan dalam beberapa lintasan metabolisme
diantaranya siklus urea dan metabolisme
beberapa asam amino. Amidase banyak
dihasilkan oleh organisme prokariot dan
eukariot. Saat ini diketahui bahwa amidase
memiliki peran dalam aktivasi molekul
pembawa sinyal dalam sel neuron, biosintesis
asam indolasetat yang merupakan hormon
penting pada tumbuhan. Dalam skala industri
enzim
ini
banyak
digunakan
untuk
menghasilkan berbagai senyawa organik
bernilai jual tinggi (Kobayashi et al 1997).
Amidase
murni
yang
diisolasi
dari
mampu
Rhodococcus
erytrhopolis
menghasilkan S-naproksen murni dari rasemat
naproksen nitril [2-(6-methoxy-2-naphthyl)
propionitrile] atau rasemat naproksen amida
[2-(6-methoxy - 2- naphthyl)propionamide]
melalui kerja secara berkesinambungan
dengan nitril hidratase (Trott et al 2002).
Pereaksi Nessler dan INT
Pereaksi Nessler merupakan suatu pereaksi
yang banyak digunakan untuk menentukan
amonia dalam konsentrasi kecil. Komposisi
pereaksi Nessler adalah larutan kalium
tetraiodomerkurat
(K2HgI4)
dengan
konsentrasi 0.09 mol/L dalam kalium
hidroksida 2.5 mol/L. Prinsip penentuan
amonia dengan metode Nessler adalah dalam
suasana basa amonia akan diubah menjadi
suatu senyawa kompleks berwarna merah
kecokelatan
oksi-dimerkuri(I)-aminoiodida.
Jika konsentrasi amonia cukup tinggi, endapan
berwarna cokelat mungkin terbentuk pada
produk hasil reaksi (Bergmeyer, Beutler
1985).
NH4++ 2[HgI4]2− + 4OH− → HgO·Hg(NH2)I + 7I− + 3H2O
Garam tetrazolium merupakan senyawa
aromatik yang sering digunakan sebagai
indikator dalam berbagai pengujian aktivitas
sel. Perubahan warna yang terjadi pada garam
tetrazolium merupakan indikasi terjadinya
reaksi oksidasi reduksi secara enzimatik. INT
(iodonitrotetrazoliumchloride)
merupakan
salah satu contoh senyawa dari golongan
garam tetrazolium. Seperti terlihat pada
Gambar 3, INT merupakan bentuk teroksidasi
dari formazan suatu senyawa kompleks
berwarna merah. Secara prinsip reduksi INT
menjadi formazan berkaitan dengan terjadinya
transfer elektron akibat oksidasi NADH
menjadi NAD+ pada reaksi oksidasi reduksi
secara enzimatik. Seperti
terlihat pada
Gambar 4, elektron yang dilepaskan dari
oksidasi NADH akan ditangkap oleh INT,
sehingga senyawa ini akan tereduksi
membentuk formazan (Ishiyama et al 1996).
(a)
(b)
Gambar 3 Perbandingan struktur formazan
(a) dan INT (b).
4
Gambar 4 Mekanisme reaksi reduksi INT.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam
penelitian ini adalah 12 isolat bakteri, pereaksi
Nessler, pereaksi iodonitrotetrazoliumchloride
(INT), NaOH 0.5 N, HCl 4 N, NaOH 4 N,
bufer fosfat pH 6-8, bufer asetat pH 3-5.5,
bufer Tris-HCl pH 8-10, glukosa, NH4Cl,
propionamida, benzamida, nikotinamida,
asetamida, adipamida dan standar asam
propionat 50 ppm. Sebagai media peremajaan
bakteri digunakan media NA (nutrien agar)
sedangkan media fermentasi menggunakan
media mineral dengan komposisi sebagai
berikut
(Stringfellow
al
2003):
et
Na2HPO4.2H2O (0.4475 g), KH2PO4 (0.1g),
MgSO4.7H2O (0.1 g), CaCl2.2H2O (0.01g),
yeast extract (0.01 g), FeSO4.7H2O (0.001 g)
yang dilarutkan dalam 1000 mL akuades
kemudian ditambah dengan 1 mL mikro
elemen dengan komposisi sebagai berikut:
ZnSO4.7H2O (0.1 g), MnCl2.4H2O (0.03 g),
H3BO3 (0.3 g), CoCl2.6H2O (0.2 g),
CuCl2.6H2O (0.01 g), NiCl2.6H2O (0.02 g),
Na2MoO4.2H2O (0.9 g), Na2SeO3 (0.02 g)
dalam akuades 1000 mL. Bahan yang
digunakan dalam pengujian aktivator dan
inhibitor logam adalah HgCl2, CoCl2.6H2O,
CuCl2,
NiCl2.6H2O,
MgSO4.7H2O,
ZnSO4.7H2O, CaCl2.2H2O dan FeSO4.7H2O
dengan konsentrasi 10 mM. Bahan yang
digunakan untuk menentukan kadar protein
adalah bovine serum albumin (BSA), pereaksi
biuret, NaOH 2 N dan larutan TCA 4 N.
Alat-alat
adalah
yang
digunakan
spektrofotometer UV-Vis Shimadzu 1770,
microtitter plates (24 & 96 wells), laminar air
flow cabinet, sentrifus Kubota (6500 & 5910),
sentrifus eppendorf 5415C, penangas air
memmert, neraca analitik, mikropipet, pH
meter, bioshaker BR 300 LF, inkubator, oven,
autoklaf, HPLC Shimadzu tipe 20A dan
peralatan gelas.
Metode Penelitian
Penapisan Isolat Bakteri Pendegradasi
Propionamida (Ellof modifikasi 1998)
Penapisan bakteri penghasil amidase
dilakukan
dengan
menggunakan
dua
parameter yaitu pertumbuhan dan aktivitas
dari 12 isolat bakteri pendegradasi nitril.
Sebanyak 1 ose dari setiap isolat ditumbuhkan
dalam microplate (24 wells) steril yang berisi
1 mL propionamida 100 ppm. Suspensi sel
kemudian diinkubasi pada bioshaker selama 3
hari pada suhu 30 °C. Sel yang dihasilkan
Selanjutnya
digunakan untuk pengujian
pertumbuhan
dan
aktivitas.
Pengujian
pertumbuhan dilakukan secara kualitatif
dengan menggunakan reagen INT. Sebanyak
100 µµL
L suspensi direaksikan dengan 14 µL
pereaksi INT di dalam microplate. Larutan
kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama
30 menit. Intensitas warna merah yang
terbentuk selanjutnya diamati. Pengujian
aktivitas dilakukan dengan metode Nessler.
Sebanyak 2 µL suspensi sel dalam microplate
(96 wells) ditambahkan dengan 198 µL NaOH
0.5 N dan 4 µµL
L pereaksi Nessler. Kemudian
larutan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30
menit. Intensitas warna kuning yang terbentuk
diamati secara kualitatif. Dari hasil pengujian
aktivitas dan pertumbuhan ditentukan isolat
bakteri yang memiliki aktivitas dan
pertumbuhan tertinggi.
Produksi Biomasa Isolat Bakteri Terpilih
Produksi biomasa diawali
dengan
pembuatan starter sel bakteri terpilih di dalam
erlenmeyer 500 mL yang berisi 250 mL media
mineral yang mengandung asetamida 100 mM.
Kultur diinkubasi di atas mesin pengocok
(shaker) pada suhu ruang selama 96 jam.
Secara periodik kultur diambil untuk diamati
petumbuhannya pada OD 436 nm dan
perubahan pH. Selanjutnya 125 mL starter
diinokulasikan dalam 1500 mL media
fermentasi yang mengandung asetamida 100
mM. Kultur diinkubasi di atas shaker pada
suhu ruang selama 3 hari. Setelah 3 hari sel
dipanen dengan cara mensentrifus kultur
selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm
dan suhu 4°C. Pelet yang diperoleh dicuci
dengan bufer fosfat pH 7 sebanyak 2 kali.
Pelet yang didapat digunakan untuk
karakterisasi enzim pada sel utuh.
Penentuan Aktivitas Enzim
Campuran reaksi yang terdiri dari 3%
suspensi sel dan propionamida dalam bufer
fosfat diinkubasi pada suhu 37 °C selama 10
menit. Aktivitas enzim selanjutnya dihentikan
dengan penambahan HCl 4 N lalu dinetralkan
dengan NaOH 4 N. Campuran kemudian