FARMASI FKIK UMY 1 Uji Efektivitas Kombinasi Ekstrak Etil Asetat

Uji Efektivitas Kombinasi Ekstrak Etil Asetat Buah Mengkudu (Morinda
citrifolia L.) Dan Senyawa 5-Fluorourasil Sebagai Ko-kemoterapi Kanker
Kolon Secara In Silico dan In Vitro
Combinational Effect of Ethyl Acetate Extract of Noni (Morinda citrifolia L.)
and 5-Fluorouracil Compound as Co-chemoterapy Colon Cancer by In Silico
and In Vitro Assay
Nur Oktafiyani*, Rifki Febriansyah
Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas
Muhammadiyah Yogyakarta, Jalan Lingkar Barat, Taman Tirto, Kasihan, Bantul
*Corresponding author, email : [email protected]
ABSTRACT
Colon cancer is one among the top 5 common cancers in men and women.
The exact cause of colon cancer is still unknown, but the Cyclooxygenase 2
(COX-2) enzymes has a role this cancer formation. WiDr is one of the less
sensitiveness cell for 5-FU treatment, as an antimetabolite class of
chemotherapeutic agents. WiDr cell resistance is mediated by increasing
thymidylate synthetase enzyme as the main target of 5-FU inhibition. So, we need
a compound as a combination of chemotherapy to increase the sensitivity of WiDr
cells to 5-FU. The purpose of this study is determining the effectiveness of the
ethyl acetate extract of noni fruit (Morinda citrifolia L.) as co-chemotherapy
colon cancer.
The sample was used ethyl acetate extract of noni fruit. Parameters for this
research were molecular docking, Thin Layer Chromatography (TLC), cytotoxic
assay, and apoptotic assay. Molecular docking test were done using PDB
ID:6COX as a target. TLC method used to identification of chemical compunds.
Cytotoxic test were done by using MTT assay method against WiDr cells.
Apoptotic assay done by used the best CI concentration of ethyl acetate extract of
noni fruit and 5-FU compound.
Molecular docking had ∆G -5,25 kkal/mol value from coumarin and
6COX. Rf value of coumarin with TLC method was 0,44. IC50 of ethyl acetate
extract of noni fruit was 868,69 µg/ml and 5-FU IC50 was of 795,54 µg/ml. WiDr
cells combination assay of ethyl acetate extract and 5-FU showed CI values 1,17 it
means it had antagonist effects. Apoptotic test showed the combination of ethyl
acetate extract of noni and 5-FU increased apoptotic of WiDr cell.
Keywords: ethyl acetate extract of noni; WiDr; cytotoxic; apoptotic; cochemotherapy
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 1
PENDAHULUAN
Penyakit kanker merupakan
penyakit yang menjadi salah satu
ancaman
terhadap
kesehatan
manusia. Kanker adalah penyakit
tidak menular yang prevalensinya
terus meningkat di seluruh dunia.
Kanker kolorektal adalah kanker
yang menyerang kolon sampai ke
dubur. Di dunia, kanker kolorektal
memiliki tingkat insiden dan tingkat
mortalitas yang tinggi baik pada pria
maupun wanita. Menurut National
Institute of Cancer1, pada tahun
2013 di Amerika terdapat 136.830
estimasi kasus baru dan 50.310
estimasi kematian karena kanker
kolon.
Berbagai cara pengobatan telah
dilakukan untuk mengobati penyakit
kanker kolon seperti kemoterapi,
radioterapi, dan operasi. Berbagai
kendala, efek samping dan resistensi
sel kanker yang ditimbulkan oleh
berbagai
pengobatan
kanker
memerlukan
suatu
terobosan
pengobatan kanker dengan efektifitas
tinggi dan efek samping yang
minimal2.
Pendekatan yang potensial
dalam mengatasi adanya efek
samping
pada
penggunaan
kemoterapi adalah menggunakan
agen kombinasi kemoterapi (kokemoterapi) pada terapi pasien
kanker. Ko-kemoterapi yaitu metode
yang memungkinkan penggunaan
obat dosis rendah dengan aktivitas
meningkat,
sehingga
toksisitas
terhadap
jaringan
normal
disekitarnya menurun. Salah satu
agen yang potensial digunakan
dalam kombinasi dengan agen
kemoterapi adalah berbasis bahan
alam3.
Senyawa
yang
memiliki
aktivitas sebagai kemopreventif
digunakan untuk meningkatkan
sensitivitas dan mengurangi efek
samping4. Salah satu bahan alam
yang dapat digunakan sebagai agen
kemopreventif kanker kolon adalah
buah mengkudu (Morinda citrifolia
L.).
Pada penelitian ini akan
dilakukan uji docking molekuler, uji
KLT, uji sitotoksik dan pengamatan
apoptosis dari kombinasi ekstrak etil
asetat buah Mengkudu (Morinda
citrifolia L.) dan senyawa 5Fluorourasil (5-FU) terhadap sel
kanker kolon WiDr. Uji dilakukan
secara in vitro melalui uji sitotoksik
dan uji apoptosis untuk mengetahui
potensi antikanker dari kombinasi
ekstrak etil asetat buah mengkudu
dan senyawa 5-FU. Penelitian ini
diharapkan mampu membuktikan
ekstrak etil asetat buah mengkudu
dapat digunakan sebagai kokemoterapi dari bahan alam.
BAHAN DAN METODE
Buah mengkudu yang sudah
berwarna kuning tetapi masih
mengkal dipanen dari daerah
Kotagede, Yogyakarta. 10 kg
mengkudu yang sudah dipanen,
dipilih berdasarkan kekerasan dan
warna kemudian dicuci bersih.
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 2
Kemudian buah mengkudu dipotong
tipis-tipis dan dijemur di bawah sinar
matahari sampai benar-benar kering.
Simplisia yang sudah kering
kemudian
diserbuk
dengan
menggunakan mortir, stamper dan
blender. Penyerbukan dilakukan
untuk mempermudah penarikan zat
aktif dari simplisia tetapi tidak terlalu
halus agar pada saat penyaringan
tidak terlalu banyak ampas yang
tersaring. Serbuk halus yang didapat
sebanyak 886,3 gram. Setelah
didapatkan serbuk halus kemudian
dilakukan maserasi.
Dalam maserasi, pelarut yang
digunakan adalah etil asetat,
maserasi dilakukan selama 5 hari.
Selama proses maserasi bejana
digojog setiap hari. Setelah 5 hari
dilakukan
penyaringan.
Sisa
penyaringan diremaserasi selama 2
hari tanpa penggojogan. Maserat
hasil penyaringan yang pertama
disimpan dalam erlenmeyer dan
dilapisi dengan kain hitam. Setelah 2
hari, dilakukan penyaringan hasil
remaserasi. Hasil dari seluruh
penyaringan kemudian dievaporasi
agar didapatkan ekstrak kental.
Didapatkan ekstrak kental sebanyak
16,6 gram.
Uji docking molekuler. Uji
Docking molekuler dilakukan dengan
menggunakan aplikasi Autodock 4.2.
Senyawa yang diuji adalah kumarin
dengan pembanding 5-FU. Reseptor
yang digunakan sebagai target
docking adalah protein COX-2 (PDB
ID : 6COX). Terlebih dahulu
dilakukan
preparasi
senyawa
menggunakan YASARA terhadap
kompleks
protein
reseptor.
Kemudian dilakukan pengaturan
Grid box, pengaturan ini bertujuan
untuk menentukan sisi aktif dari
enzim dan memberikan ruang
(spacing) terhadap ligan untuk
berotasi. Dalam Autodock ligan pada
awalnya diacak di luar protein,
kemudian
melakukan
translasi,
orientasi dan konformasi hingga sisi
yang ideal ditemukan.
Uji KLT. KLT dilakukan
setelah ekstrak kental siap. Fase
diam yang digunakan adalah Silica
Gel 60 GF254, sedangkan fase gerak
yang digunakan adalah heksan : etil
asetat dengan perbandingan 93 : 7.
Hal pertama yang dilakukan adalah
penjenuhan bejana. Plat silica
kemudian diberi totolan ekstrak dan
dilakukan proses KLT. Setelah
proses KLT selesai, dilakukan
perhitungan nilai Rf.
Uji sitotoksik ekstrak etil
asetat buah mengkudu dan
senyawa 5-FU. Dalam uji sitotoksik
hal pertama yang dilakukan adalah
persiapan media. Media kultur dibuat
dengan cara mencampurkan larutan
RPMI steril dengan FBS 10%, dan
penisilin-streptomisin 1% secara
aseptis di dalam LAF.
Setelah media kultur disiapkan,
kemudian menyiapkan sel kanker
yang akan digunakan untuk uji
sitotoksik. Sel diambil dari inkubator
CO2 kemudian diamati terlebih
dahulu, untuk dapat memanen sel
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 3
harus dipastikan terlebih dahulu
bahwa sel telah 80% konfluen.
Media tempat tumbuh sel kemudian
dibuang dan sel dicuci dengan PBS,
selanjutnya ditambahkan tripsinEDTA dan diinkubasi di dalam
inkubator selama 3 menit. Setelah itu
ditambahkan media ±5 ml dan
diresuspensi
untuk
kemudian
dimasukkan kedalam conical steril,
dan dilakukan preparasi sampel.
Preparasi sampel diawali dengan
penimbangan sampel kurang lebih 5
mg
dalam
eppendorf
dan
ditambahkan 50 µl DMSO dan
dilarutkan dengan vortex. Kemudian
dibuat serikadar sampel dengan
pengenceran stok dalam DMSO
manggunakan media kultur. Setelah
itu dilakukan perhitungan sel.
Sel diambil dari inkubator CO2
kemudian media tempat tumbuh
dibuang dan sel dicuci dengan PBS
sebanyak 2 kali. Selanjutnya
ditambahkan tripsin-EDTA 1x dan
diinkubasi dalam inkubator selama 3
menit. Setelah itu ditambahkan 2-3
ml media dan diresuspensi kemudian
dimasukkan ke dalam conical steril
dan diresuspensi kembali dengan
menambahkan 2-3 ml media kultur.
Selanjutnya diambil 10 µl sel yang
sudah dipanen dan dimasukkan ke
dalam hemasitometer kemudian sel
dihitung dibawah mikroskop. Untuk
sel yang akan diberi perlakuan
dilakukan transfer sejumlah sel yang
diperlukan ke dalam conical yang
lain dan ditambahkan media kultur.
Uji sitotoksik dilakukan dengan
mengambil sel dari inkubator CO2
kemudian sel dipindahkan ke dalam
sumuran masing-masing 100µl.
Selanjutnya dimasukkan 100 µl PBS
ke dalam semua sumuran yang terisi
sel kemudian dibuang. Selanjutnya
seri konsentrasi dimasukkan ke
dalam sumuran kemudian di inkubasi
selama 24-48 jam.
Setelah
diinkubasi
sel
dikeluarkan dari inkubator dan media
sel di buang dan di cuci dengan PBS
1x kemudian ditambahkan reagen
MTT 100 µl ke dalam tiap sumuran
termasuk
kontrol
media
dan
diinkubasi selama 2-4 jam sampai
terbentuk
formazan.
Setelah
terbentuk formazan ditambahkan
stopper 100 µl SDS 10% dalam 0,1
N HCl.
Selanjutnya plate dibungkus
alumunium foil dan diinkubasi di
tempat yang gelap pada suhu kamar
selama satu malam. Hasil kemudian
di baca dengan Elisa Reader dengan
panjang gelombang 595 nm untuk
mendapatkan data absorbansinya.
Selanjutnya data absorbansi
yang telah didapatkan diolah dengan
Ms. Excell untuk mendapatkan
regresi linear yang kemudian
digunakan
untuk
menghitung
persentase sel hidup dan analisis
harga IC50 dan Combination Index
(CI).
Uji Apoptosis terhadap sel
WiDr.
Pengamatan
apoptosis
dilakukan dengan menggunakan
metode Double staining. Sel diambil
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 4
dari inkubator CO2 kemudian
dilakukan panen sel dan perhitungan
sel. Selanjutnya membuat seri
pengenceran suspensi sel sehingga
didapatkan konsentrasi sel akhir
5x104 sel/1000 μl MK kemudian
disiapkan 24 well plate dan cover
slip.
Selanjutnya 1000 μl suspensi sel
dipindahkan ke atas cover slip yang
telah dimasukkan ke dalam sumuran
untuk kemudian diinkubasi dalam
inkubator
selama
semalam.
Kemudian dibuat satu konsentrasi
sampel yaitu pada nilai CI terbaik
untuk perlakuan dan satu kontrol sel,
masing-masing sebanyak 1000 μl.
Kemudian sel yang telah diinkubasi
diambil dan buang semua MK secara
hati-hati dan dicuci dengan PBS
masing-masing 500 µl dan kemudian
PBS dibuang perlahan. Selanjutnya
sampel dengan konsentrasi tertentu
dimasukkan sebanyak 1000 µl ke
dalam sumuran, kemudian plate
diinkubasi dalam inkubator selama
10 jam.
Setelah inkubasi selesai plate
dikeluarkan dari inkubator dan
semua media dikeluarkan dari
sumuran
secara
perlahan.
Selanjutnya sel dicuci dalam
sumuran dengan PBS masing-masing
500 µl kemudian PBS dibuang
dengan hati-hati. Setelah PBS
dibuang
cover
slip
diambil
menggunakan pinset dengan bantuan
ujung jarum dengan hati-hati.
Selanjutnya di atas object glass
diletakkan cover slip dan diberi
label. Selanjutnya sel ditetesi dengan
reagen campuran etidium bromidaakridin oranye di atas cover slip dan
digoyang perlahan untuk meratakan.
Selanjutnya hasil diamati di bawah
mikroskop flouresen.
HASIL DAN DISKUSI
Uji pendahuluan dilakukan
secara in silico atau secara komputasi
menggunakan uji docking molekuler
Autodock 4.2. Dari uji docking
molekuler didapat nilai binding
energy antara senyawa kumarin dan
protein target COX-2 sebesar -5,25
kkal/mol. COX-2 dipilih sebegai
protein target karena karakteristik
dari sel kanker WiDr adalah
tingginya ekspresi COX-25. Hasil uji
docking molekuler dapat dilihat pada
tabel 1.
Tabel 1. Hasil Docking Dan Potensi Ikatan Senyawa Uji Terhadap Enzim COX-2
No
Senyawa Uji
Nilai ∆G
- 8,51
kkal/mol
1.
Potensi Ikatan Asam Amino
GLN 461, PRO 153, GLU
46, ASN 39, CYS 36, MET
48, CYS 47
Damnachantal
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 5
- 5,25
kkal/mol
2.
MET 522 dan ALA 527
Kumarin
- 5,07
kkal/mol
3.
TYR 130, ALA 151, LEU
123, ILE 124, ASP 125,
ARG 469, THR 149, THR
129
5-FU
Dalam uji potensi ko-kemoterapi
ini digunakan ekstrak etil asetat buah
mengkudu dimana yang diduga
memiliki aktivitas antikanker adalah
senyawa kumarin. Ekstraksi buah
mengkudu dilakukan menggunakan
penyari etil asetat yang bersifat non
polar untuk menarik senyawa
kumarin yang juga bersifat non
polar. Dari hasil uji pendahuluan
analisis kandungan senyawa kimia
pada ekstrak menggunakan metode
KLT diketahui bahwa ekstrak
mengandung senyawa kumarin yang
ditunjukkan dari bercak yang
menunjukkan
adanya
senyawa
tersebut dengan niali Rf 0,44. Hasil
pengamatan uji KLT dapat diamati
pada gambar 1.
3
3
3
2
1
1
(a)
1
(b)
(c)
Gambar 1. Hasil Kromatogram Identifikasi Senyawa Kumarin seraca KLT. (a)
UV 254 nm, (b) UV 366 nm dan (c) UV 366 nm sesudah disemprot
KOH-etanolik
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 6
Selanjutnya untuk menguji
potensi ekstrak etil asetat mengkudu
dan senyawa 5-FU sebagai kokemoterapi kanker kolon dua uji in
vitro
yaitu
uji
sitotoksik
menggunakan metode MTT assay
dan
uji
induksi
apoptosis
menggunakan metode pengecatan
etidium bromide-akridin oranye.
Dari hasil perhitungan uji
sitotoksik didapat 2 hasil yaitu nilai
IC50 tunggal masing-masing senyawa
dan nilai IC50 kombinasi yang
kemudian
digunakan
untuk
menghitung nilai CI. Dari hasil
perhitungan uji sitotoksik tunggal,
diketahui bahwa ekstrak etil asetat
buah mengkudu memiliki potensi
cukup rendah dalam menghambat
pertumbuhan sel kanker kolon WiDr
ditunjukkan dari harga IC50 sebesar
868,69 µg/ml (Tabel 2). Suatu
senyawa dinyatakan aktif dan
memiliki potensi besar untuk
dijadikan agen antikanker apabila
nilai IC50-nya kurang dari 100 µg/ml.
Senyawa 5-FU yang merupakan obat
sitostatik golongan antimetabolit
memiliki nilai IC50 sebesar 795,54
µg/ml (Tabel 3).
Tabel 2. Persen Hidup Sel WiDr (IC50) Perlakuan Tunggal Ekstrak Etil Asetat
Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L.)
Kadar
(µg/ml)
46,87
93,75
187,5
375
750
1500
Rata-rata
Absorbansi
0,297
0,268
0,237
0,198
0,162
0,090
Viabilitas sel ± SD
119,263 ± 0,004
104,523 ± 0,012
89,112 ± 0,004
69,347 ± 0,003
51,424 ± 0,004
14,908 ± 0,003
Persamaan
y = -0,0658 + 107,16
r = 0,962
IC50 = 868,69 µg/ml
Tabel 3. Persen Hidup Sel WiDr (IC50) Perlakuan Tunggal Senyawa 5-FU
Kadar
(µg/ml)
15,62
31,25
62,5
125
250
500
Absorbansi
Viabilitas sel ± SD
0,410
0,406
0,341
0,321
0,278
0,267
175,712 ± 0.028
173,869 ± 0.029
141,206 ± 0.019
130,988 ± 0.036
109,548 ± 0.019
104,020 ±0.018
Uji sitotoksik kombinasi ekstrak
etil asetat buah mengkudu dan
senyawa 5-FU mempunyai efek
antagonis karena mempunyai nilai CI
Persamaan
y = -0,1413x + 162,41
r = 0.852
IC50 = 795,54 µg/ml
> 1,1 (Tabel 4). Dimana nilai CI
terbaik adalah kombinasi ekstrak etil
asetat buah Mengkudu dengan
konsentrasi
260
µg/ml
dan
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 7
konsentrasi senyawa 5-FU sebesar
50
µg/ml.
Nilai
tersebut
menunjukkan
bahwa
dengan
konsentrasi kombinasi memberikan
efek
antagonis
sebagai
kokemoterapi pada sel kanker kolon
WiDr.
Tabel 4. Tabel Nilai CI Perlakuan Kombinasi Ekstrak Etil Asetat Mengkudu dan
Senyawa 5-FU
Konsentrasi
ekstrak (µg/ml)
130
260
390
520
Konsentrasi Senyawa 5-FU (µg/ml)
50
100
150
200
1.54
1.77
1.57
1.58
1.17
1.50
2.44
1.80
1.18
1.61
1.90
2.06
1.32
2.33
3.94
4.86
Pengamatan kematian sel dapat
dilihat dari hasil uji induksi
apoptosis. Apoptosis merupakan
kematian sel yang terprogram yang
tidak
menyebabkan
terjadinya
inflamasi dan luka pada jaringan. Uji
induksi apoptosis kombinasi ekstrak
etil asetat buah mengkudu dan
senyawa 5-FU terhadap sel WiDr
dilakukan
dengan
penambahan
etidium bromida-akridin oranye
(double staining). Konsentrasi yang
digunakan pada uji apoptosis dilihat
dari nilai CI terbaik dari uji
(a)
sitotoksik kombinasi ekstrak etil
asetat mengkudu dan senyawa 5-FU.
Nilai CI terbaik dipilih untuk
perlakuan induksi apoptosis ini,
konsentrasi ekstrak etil asetat
mengkudu yang digunakan 260
µg/ml dan konsentrasi senyawa 5-FU
sebesar 50 µg/ml. Hasil perlakuan
induksi apoptosis ini menunjukkan
bahwa kombinasi kedua senyawa
terbukti dapat meningkatkan induksi
apoptosis sel kanker kolon WiDr.
Gambar 2 merupakan foto dari uji
induksi apoptosis terhadap sel WiDr.
(b)
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 8
(c)
(d)
Gambar 2. Efek Apoptosis Kombinasi Ekstrak Etil Asetat Buah Mengkudu dan
Senyawa 5-FU Terhadap Sel WiDr. (a) Kontrol Sel, (b)
Konsentrasi Ekstrak 260 µg/ml, (c) Konsentrasi 5-FU 50 µg/ml,
dan (d) Kombinasi Kedua Sampel; Sel Hidup ( ); Sel Mati (
)
Multidrug resistance (MDR)
dan efek samping yang ditimbulkan
agen kemoterapi dapat dicegah
dengan
metode
kombinasi
kemoterapi atau ko-kemoterapi yang
merupakan pengembangan strategi
dalam pengobatan kanker. Kokemoterapi dapat dilakukan dengan
kombinasi senyawa sitostatika dan
senyawa
baru
dari
tanaman.
Kombinasi ini dapat meningkatkan
respon sel kanker terhadap senyawa
antikanker
namun
tidak
menimbulkan resistensi.
Resistensi sel kanker WiDr
terhadap agen kemoterapi 5-FU
diketahui berhubungan dengan enzim
timidilat sintetase dan protein p53
pada DNA. Mekanisme agen
sitotoksik 5-FU terhadap kanker
kolon adalah sebagai anti metabolit
yang menghambat timidilat sintetase.
Peningkatan ekspresi enzim timidilat
sintetase
menjadi
salah
satu
penyebab resistensi sel WiDr
terhadap 5-FU6. Enzim timidilat
sintetase bertanggung jawab untuk
mengubah deoksiuridilat menjadi
asam timidilat. 5-FU mengganggu
sintesis DNA dengan menurunkan
availabilitas asam timidilat.
Mekanisme lain resistensi sel
WiDr terhadap 5-FU adalah terjadi
mutasi p53 G pada posisi 273
sehingga terjadi perubahan residu
arginin menjadi histidin7. Tumor sel
yang memiliki mutasi pada p53 akan
mengalami
penurunan
respon
terhadap proses apoptosis sel.
Resistensi sel kanker ini akan
menghambat kerusakan DNA dan
mekanisme
apoptosis
yang
merupakan target agen kemoterapi8.
Buah mengkudu (Morinda
citrifolia L.) menjadi salah satu
tanaman yang dapat digunakan
dalam ko-kemoterapi. Salah satu
senyawa yang terkandungan dalam
buah mengkudu adalah senyawa
kumarin, senyawa ini diketahui
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 9
mempunyai efek kemopreventif.
Kumarin
merupakan
senyawa
polifenol yang memiliki mekanisme
spesifik
untuk
menghambat
pertumbuhan sel kanker.
Pada penelitian ini dilakukan
uji pendahuluan senyawa kumarin
terdahap COX-2 secara molecular
docking. COX-2 dipilih sebagai
enzim target dalam uji docking
molekuler karena menurut Palozza,
et al9, kanker kolon memiliki
karakteristik ekspresi COX-2 yang
tinggi, sehingga jika suatu senyawa
dapat menghambat ekspresi dari
enzim COX-2 maka senyawa
tersebut berpotensi sebagai agen
kemopreventif.
Kumarin
dapat
menjadi agen kemopreventif dengan
penghambatan invasi sel kanker
melalui mekanisme inhibisi COX-2
secara tidak langsung dan sebagai
anti angiogenesis. Adanya radikal
bebas akan menyebabkan kerusakan
DNA yang memacu produksi dari
COX-2.
Hasil docking menggunakan
Autodock 4.0 dapat melihat potensi
ikatan kumarin pada enzim COX-2,
yaitu metionin dan mlanin. Metionin
merupakan suatu asam amino yang
berperan penting dalam sintesis
protein, dalam proses transkripsi dan
penerjemah basa nitrogen di DNA
sebelum membentuk RNA. Alanin
merupakan asam amino non-esensial
yang
berperan
dalam
proses
pengenalan substrat, khususnya
dalam interaksi dengan atom
nonreaktif (karbon). 5-FU memiliki
beberapa
kemungkinan
ikatan
dengan COX-2 antara lain, tirosin,
alanin, leusin, isoleusin, asam
aspartat, arginin, treonina. Ikatan
senyawa antikanker dan asam amino
merupakan
suatu
mekanisme
penghambatan metabolisme
sel
10
kanker . Dilihat dari hasil docking
yang telah dilakukan, kumarin dan 5FU masih mempunyai efek yang
lebih rendah dibandingkan dengan
damnachantal. Hal ini dapat dilihat
dari residu asam amino yang
berikatan dengan damnachantal lebih
banyak jika dibandingkan dengan
residu asam amino yang berikatan
dengan kumarin.
Efek toksik masing-masing
senyawa diketahui melalui uji
sitotoksik. Ekstrak etil asetat buah
mengkudu mempunyai nilai IC50
sebesar 868,69 µg/ml. Rendahnya
nilai IC50 ekstrak etil asetat
mengkudu dikarenakan banyaknya
senyawa yang tersari dalam ekstrak,
dengan penyari yang bersifat non
polar maka senyawa-senyawa non
polar yang terkandung dalam buah
mengkudu akan ikut tersari. Senyawa
non polar lain yang terkandung
dalam buah mengkudu seperti
Scopoletin dan Seronin yang
merupakan golongan alkaloid11.
Menurut Wang, et al12,
mengkudu memberikan efek selektif
dalam menghambat COX-2, aktivitas
COX-2 yang berlebih diketahui
berperan dalam promosi tumor dan
proses karsinogenesis pada kanker
payudara, kanker kolon dan kanker
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 10
paru-paru. Ekspresi berlebih COX-2
pada sel kanker diketahui berkaitan
dengan aktivasi NF-κB yang sangat
berkontribusi dalam proses inflamasi
sel13. Aktivasi NF-κB berkaitan erat
dengan terjadinya kemoresistensi
pada sel kanker14. Pada inflamasi
yang terjadi, NF-κB mempengaruhi
ekspresi dari produk gen proinflamasi seperti TNF-α, IL-1, IL-6,
IL-8, IL-18, IL-17, kemokin, MMP9, VEGF, COX-2 dan 5-LOX15.
NF-κB
menjadi
faktor
transkripsi yang mengatur ekspresi
gen yang dapat menekan kematian
sel ganas, merangsang proliferasi sel
ganas, metastasis sel ganas dan
angiogenesis. Penghambatan NF-κB
terbukti
dapat
menekan
tumorigenesis dan metastasis serta
menurunkan
ekspresi
vascular
endothelial growth factor (VEGF)
pada beberapa sel kanker16.
COX-2 dapat menyebabkan
kanker kolon dengan beberapa
mekanisme
yaitu
dengan
menghambat apoptosis, menekan
sistem imun, mencetuskan terjadinya
angiogenesis, dan meningkatkan
invasif
sel
malignan17.
Penghambatan COX-2 oleh kumarin
didasarkan
pada
mekanisme
peredaman radikal bebas. Radikal
bebas akan menyebabkan terjadinya
inflamasi pada DNA dan akan
meningkatkan produksi COX-218,19.
Dengan
adanya
penghambatan
radikal bebas oleh kumarin, maka
COX-2 tidak akan teraktivasi.
Untuk mengetahui mekanisme
suatu senyawa sebagai agen kokemoterapi dapat dilakukan uji
induksi
apoptosis.
Apoptosis
merupakan
suatu
mekanisme
kematian
sel
terprogram
(programmed cell death) yang
melalui
serangkaian
perubahan
sebagai hasil dari adanya rangsangan
fisiologis atau patologis. Apoptosis
sel mempunyai ciri-ciri pengerutan
sel, penonjolan membran (membrane
blebbing), kondensasi kromatin dan
fragmentasi inti sel. Proses apoptosis
sel WiDr diketahui melalui jalur
independent p5320. p53 mempunyai
fungsi utama dalam menghentikan
siklus sel sebagai respon terhadap
kerusakan DNA sehingga ada
kesempatan untuk memperbaiki
kerusakan sebelum proses replikasi
selanjutnya. Pada sel WiDr yang
resisten terhadap 5-FU, terjadi
mutasi pada protein p53, sehingga
tidak terjadi proses apoptosis.
Hasil yang didapat dari uji
induksi apoptosis kombinasi ekstrak
etil asetat buah mengkudu dan
senyawa 5-FU menunjukkan adanya
peningkatan induksi apoptosis, hal
ini dapat dilihat pada gambar 2.
Terjadinya peningkatan induksi
apoptosis terlihat dari banyaknya sel
yang berwarna oranye,
yang
menunjukkan bahwa sel mengalami
apoptosis. Menurut Ren, et al21,
kumarin
memiliki
mekanisme
induksi apoptosis melalui jalur ikatan
dengan mengaktifkan TNF-αR dan
juga melalui penghambatan aktivitas
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 11
DNA topoisomerase I/II, modulasi
signaling
pathways,
pelepasan
sitokrom C dengan aktivasi caspase 3 dan -9, dimana terjadi penurunan
ekspresi gen Rb dan Bcl-2, serta
peningkatan ekspresi gen p53. Hal
ini berhubungan dengan adanya
resistensi sel WiDr terhadap 5-FU
yang disebabkan oleh adanya mutasi
pada p53, sehingga dapat diketahui
bahwa kumarin dapat meningkatkan
sensitivitas sel WiDr terhadap 5-FU.
Konsentrasi yang memberikan efek
adalah dosis ekstrak etil asetat
mengkudu 260 µg/ml dan dosis 5-FU
50 µg/ml. Hal ini sesuai dengan uji
sitotoksik kombinasi dimana dosis
rendah
dari
kedua
senyawa
memberikan efek yang lebih baik
jika
dibandingkan
dengan
penggunaan
senyawa
tunggal
maupun dengan dosis yang lebih
tinggi.
Berdasarkan penelitian
ini,
senyawa kumarin pada ekstrak etil
asetat buah mengkudu memiliki
potensi
sebagai
kombinasi
kemoterapi bersama 5-FU pada
pasien kanker kolon. Uji in silico
menggunakan docking molekuler,
menunjukkan potensi ikatan yang
cukup baik antara kumarin dengan
COX-2. Uji KLT menunjukkan hasil
bahwa senyawa kumarin terdapat
pada ekstrak etil asetat buah
mengkudu. Uji sitotoksik senyawa
tunggal, baik untuk ekstrak etil asetat
mengkudu
maupun
5-FU
menunjukkan hasil nilai IC50 yang
tinggi. Uji sitotoksik kombinasi
kedua senyawa terhadap sel WiDr
menunjukkan
efek
antagonis.
Apoptosis sel WiDr terinduksi oleh
kombinasi senyawa kumarin dan 5FU perlakuan dosis rendah. Hasil
penelitian ini dapat menjadi dasar
bagi
penelitian
selanjutnya.
Penelitian mengenai efektivitas
mengkudu sebagai ko-kemoterapi
kanker kolon dapat dikembangkan
dengan melakukan fraksinasi ekstrak
untuk mendapatkan senyawa yang
lebih spesifik. Perlu dilakukan
penelitian
lanjutan
mengenai
mekanisme secara molekuler buah
mengkudu sebagai agen kombinasi
kemoterapi.
KESIMPULAN
Dari penelitian ini diperoleh
kesimpulan sebagai berikut :
1. Ekstrak
etil
asetat
buah
mengkudu mengadung senyawa
Kumarin.
2. Senyawa Kumarin dan enzim
COX-2 mempunyai potensi
ikatan dengan nilai ∆G -5,25
kkal/mol.
3. Ekstrak
etil
asetat
buah
mengkudu memiliki aktivitas
sitotoksik lemah sebesar 868,69
µg/ml. Senyawa 5-fluorourasil
memiliki aktivitas sitotoksik
sebesar 795,54 µg/ml.
4. Kombinasi kemoterapi ekstrak
etil asetat buah mengkudu dan
senyawa 5-fluorourasil memiliki
efek antagonis terhadap sel
WiDr dengan rentang nilai CI
1,17 – 4,86.
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 12
5.
Perlakuan induksi apoptosis
secara tunggal dan kombinasi
menujukkan
peningkatan
apoptosis pada perlakuan dosis
rendah.
DAFTAR PUSTAKA
1.
2.
3.
4.
5.
National Cancer Institute, 2014.
Common
cancer
types.
Available
from:
http://www.cancer.gov/cancerto
pics/commoncancers. Diakses
pada 17 Mei 2014.
Zuhud, Evrizal. A.M. 2011. Bukti
Kedahsyatan Sirsak Menumpas
Kanker. Jakarta : Agromedia
Pustaka. Hal. 114.
Tyagi, A. K., Agarwal, C., Chan,
D. C. F., and Agarwal R. 2004.
Synergistic anticancer effects of
silibinin
with
conventional
cytotoxic agents doxorubicin,
cisplatin dan carboplatin against
human breast carcinoma MCF-7
dan MDA-MB468 cells. Oncol
Rep. 11(2):493-9.
Rosmarilin
H.
Anti-cancer
activity of local alpinia galangal
L (SW) rhizome extracts on
cancer cell line of human and
mice transplanted with primary
tumor cell. USU reporitary 2006.
Available
from:
http://library.usu.ac.id/download/
fp/D0300608.pdf Diakses pada
25 Mei 2014.
Palozza, P., Serini, S., Maggiano,
N., Giuseppe, T., Navarra, P. and
Ranelletti, F.O. 2005. -Carotene
Downregulates the Steady-State
and Heregulin-a-Induced COX-2
Pathways in Colon Cancer Cells.
J.Nutr. 135:129-136.
6. Sigmond, J., Backus, H.H.,
Wouters, D., Temmink, O.H.,
Jansen, G. and Peters, G.J., 2003,
Induction of Resistance to the
Multitargeted
Antifolate
Pemetrexed (ALIMTA) in WiDr
Human Colon Cancer Cells is
Associated with Thymidilate
Synthase
Overexpression,
Biochem. Pharmacol.
7. Noguchi, P., Wallace, R.,
Johnson, J., Early, E.M.,
O’Brien, S. and Ferrone, S.,
1979, Characterization of the
WiDr:
a
Human
Colon
Carcinoma Cell Line, In Vitro,
15(6):401-408.
8. Nurulita, N. A, Edy. M,
Sugiyanto, Eishou. M, Masashi.
K. 2011. The Ethyl Acetate
Fraction of Gynura Procumbens
Sensitizes WiDr Colon Cancer
Cell Against 5-fluorouracil but
Shows
Antagonism
With
Cisplatin. International Journal
of Phytomedicine., 3(2011) 392405.
9. Palozza, P., Serini, S., Maggiano,
N., Giuseppe, T., Navarra, P. and
Ranelletti, F.O. 2005. -Carotene
Downregulates the Steady-State
and Heregulin-a-Induced COX-2
Pathways in Colon Cancer Cells.
J.Nutr. 135:129-136.
10. Siswandono dan Soekardjo, B.,
(2000). Kimia Medisinal. Edisi 2.
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 13
Surabaya: Airlangga University
Press. hal. 291.303
11. Bangun, A.P., B. Sarwono. 2002.
Khasiat dan Manfaat Mengkudu.
Agro Media. Jakarta.
12. Wang, M.Y., B.J. Brest, C.J.
Jensen, D. Nowicki,C. Su, A.K.
Palu, and G. Andersen. 2002.
Morinda citrifolia (noni): A
literature review and recent
advances in noni research. Acta
Pharmacol.
Sin.
23(12):
1.127−1.141.
13. Wang SS, Purdue MP, Cerhan
JR, Zheng T, Menashe I,
Armstrong BK. 2009. Common
Gene Variants in the Tumor
Necrosis Factor (TNF) and TNF
Receptor Superfamilies and NFkB Transcription Factors and
Non-Hodgin Lymphoma. PLoS
ONE
4(4):
e5360.
doi:
10.1371/journal.pone.0005360
14. Singh S, Khar A. 2006.
Biological effects of curcumin
and its role in Soudamini NK,
Kuttan R (1989). Inhibition of
chemical
carcinogenesis by
curcumin. J. Ethnopharmacol.
27:227-233.
15. Lin, WW., Karin, M. 2007. A
Cytokine-Mediated Lik Between
Innate Immunity, Inflamasi, and
Cancer.
Departement
of
Pharmacology,
Collage
of
Medicine,
National
Taiwan
University, Taipe, Republic of
China: 1175-1183
16. Huang
K,
Andersson
C,
Roomans GM, Ito N, Claesson-
Welsh L 2001. Signaling
Properties of VEGF Receptor-1
and -2 homo- and Heterodimers.
Int J Biochem Cell Biol 33: 315–
324
17. Agarwal, M. K., M. L. Agarwal.
2004. Tocotrienol-rich fraction
of palm oil activates p53,
modulates Bax/Bcl2 ratio and
induces apoptosis independent of
cell cycle association. Cell Cycle
3(2): 205-211.
18. Wiseman, H., Halliwell, B. 1996.
Demage to DNA by Reactivity
Oxygen and Nitrogen Species :
Role in the Inflamatory Disease
and Progression to Cancer.
Biochem Journal : 125.
19. Rao, C, V., Indranie, C., Simi,
B., T, Manning, P, T., Connor, J.,
R Reddy,
B.
S.
2002.
Chemopreventive Properties of
Selective Inducible Nitric Oxyde
Synthase Inhibitor in Colon
Carcinogenesis,
Administered
Alone or in Combination with
Celecoxib,
a
Selective
Cyclooxigense-2
Inhibitor.
American Association for Cancer
Research Journal : 165-170.
20. Liu, H.C., Chen, G.G., Vlantis,
A.C., Leung, B.C.S., Tong,
M.C.E. and van Hasselt, C.A.,
2006, 5-Fluorouracil Mediates
Apoptosis and G1/S Arrest in
Laryngeal
Squamous
Cell
Carcinoma
via
a
p53Independent
Pathway,
The
Cancer Journal, 12(6):482-493.
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 14
21. Ren, W., Qiao, Z., Wang, H.,
Zhu, L. and Zhang, L. 2003.
Flavonoids:
Promising
Anticancer Agents. Medical
Research Reviews. 23(4):519534.
Nur Oktafiyani – 2011 035 0063 || FARMASI FKIK UMY 15