HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Kultur Primer Hepatosit T

9
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Kultur Primer Hepatosit T. Javanica
Sel hati dari T. javanica telah berhasil dikulturkan in vitro. Secara umum sel
hepatosit berbentuk poligonal memiliki satu atau lebih inti sel yang dapat diamati,
namun kultur primer hepatosit yang didapatkan bermorfologi bulat (Gambar 3).
Proses isolasi yang kurang optimum dapat menjadi penyebab kualitas kultur
primer hepatosit kurang baik. Selain itu beberapa faktor yang dapat
mempengaruhi kualitas kultur primer antara lain ialah jenis spesies, umur dan
status kesehatan hewan yang digunakan, tipe jaringan yang digunakan, metode
disagregasi, jenis media, serta kondisi inkubasi dan pemeliharaan kultur primer
(Bird & Forrester 1981).
Selain itu penggunaan 6-well dish yang telah dilapisi dengan kolagen,
menggantikan kolagen segar dapat menjadi salah satu kemungkinan penyebab
kultur primer hepatosit tidak dapat berkembang dengan baik. Hasil pengamatan
kultur primer hepatosit T. javanica memiliki viabilitas yang dapat dijaga >3 bulan
menggunakan tupaia maintenance media. Kemampuan viabilitas kultur primer
hepatosit >1 bulan juga terlah dilaporkan oleh Glebe et al. (2003)
Gambar 3 Morfologi kultur primer hepatosit T. javanica (A) hari 6 perbesaran 10x8; (B)
hari 15 perbesaran 10x8
Infeksi Virus Pada Kultur Primer Hepatosit
Kultur primer hepatosit T. javanica diinfeksikan menggunakan koleksi VHB
yang berasal dari owa dan manusia. Kuantifikasi VHB dilakukan dengan
mengukur titer HBsAg pada masing-masing sampel VHB. Uji serologi dilakukan
sebagai metode alternatif kuantifikasi VHB dikarenakan keterbatasan koleksi
sampel yang dimiliki. Analisa dilakukan dengan mengirimkan sampel pada
laboratorium Prodia. Pada sampel VHB asal satwa primata didapatkan titer
HBsAg 60.789,04 IU/ml. Pada sampel VHB asal manusia titer HBsAg yang
didapatkan berada dibawah ambang batas minimum deteksi (<0,05 IU/ml) namun
hasil analisa molekuler membuktikan terdapat VHB pada sampel. HBsAg
merupakan salah satu dari beberapa marka (anti-HBs, HBcAg, anti-Hbc, HBeAg,
anti-HBe) yang digunakan dalam mendiagnosa pasien yang terinfeksi hepatitis B
secara serologis. Keberadaan HBsAg pada pasien bergantung pada kondisi dan
tahapan infeksi VHB (WHO 2002).
Proses infeksi kultur primer hepatosit dilakukan dengan menambahkan 1 ml
inokulan pada masing-masing perlakuan. Sebagai kontrol negatif, ditambahkan
10
tupaia infecton media. Perlakuan kontrol negatif dilabel dengan huruf K. Kultur
primer hepatosit yang diinfeksikan dengan VHB asal owa dilabel dengan huruf J
sedangkan kultur yang diinfeksikan dengan VHB asal manusia dilabel dengan
huruf H. Tahapan pembilasan dengan tupaia maintenance media dilakukan untuk
mencuci kultur primer hepatosit dari sisa-sisa virus yang tidak menginfeksi sel.
Hasil pengamatan selama 15 hari pada kultur primer hepatosit yang
terinfeksi tidak memperlihatkan perubahan morfologi (Gambar 4). Pengumpulan
sampel dilakukan dengan menggumpulkan 500 µl supernatan media pada masingmasing perlakuan.
Gambar 4 Morfologi kultur primer hepatosit T. javanica terinfeksi (A) Sebelum infeksi
perbesaran 10x8; (B) hari ketujuh sesudah infeksi perbesaran 10x10
Deteksi Infeksi Dan Replikasi VHB
Pada visualisasi hasil PCR dengan elektroforesis gel agarosa, digunakan
kontrol positif berupa DNA VHB asal owa dan manusia dari koleksi Pusat Studi
Satwa Primata, IPB. Sekuen regio pre-S1 VHB menghasilkan amplikon berukuran
455 pasang basa.
Pada Gambar 5 diamati perlakuan kontrol negatif sampel hari pertama (K1),
ketujuh (K7), dan kelima belas (K15) tidak didapatkan pita DNA. Pada perlakuan
infeksi dengan VHB owa (J) didapatkan pita DNA berukuran ±450 pasang basa
yang tebal pada sampel hari pertama (J1), ketujuh (J7), dan kelima belas (J15).
Hal ini menunjukkan bahwa VHB asal owa dapat menginfeksi dan bereplikasi
pada kultur primer hepatosit T. javanica .
Pada perlakuan infeksi dengan VHB manusia (H) didapatkan pita DNA tipis
berukuran ±450 pasang basa pada sampel hari ketujuh (H7), namun tidak
didapatkan pita DNA pada sampel hari pertama (H1) dan hari kelima belas (H15)
(Gambar 5). Hasil positif berupa pita pada hari ketujuh (H7) menunjukkan bahwa
VHB asal manusia dapat menginfeksi dan bereplikasi pada kultur primer hepatosit
T. javanica. Analisa HBsAg yang dilakukan pada inokulan VHB H berada
dibawah ambang batas deteksi (<0,05 IU/ml). Keberadaan HBsAg dalam seruma
atau plasma mengindikasikan adanya infeksi VHB, namun deteksi HBsAg tidak
memberikan secara nyata informasi aktivitas proses replikasi virus (Zaaijer HL et
al. 1994). Selain itu, viremia pada pasien bervariasi antar pasien dan DNA VHB
pada serum pasien yang sama dapat berfluktuasi dari tidak terdeteksi hingga 10
log 10 IU/ml (Chu 2002). Dengan konsentrasi inokulan yang kecil, VHB asal
manusia tidak dapat dideteksi pada sampel kultur primer hepatosit hari pertama
11
(H1). Sampel ini memerlukan waktu replikasi yang lebih lama untuk mencapai
konsentrasi yang dapat dideteksi.
Perbedaan ketebalan pita pada Gambar 5 menunjukkan korelasi antara
konsentrasi VHB pada sampel awal sebelum diinfeksikan dengan hasil replikasi
pada kultur primer hepatosit. Virus hepatitis B asal satwa primata dengan titer
HBsAg 60.789,04 IU/ml memiliki konsentrasi akhir VHB yang lebih tinggi
daripada VHB asal manusia. Pada sampel VHB asal manusia dengan konsentrasi
awal HBsAg yang lebih rendah, didapatkan hasil PCR hari pertama negatif. Hal
ini menunjukkan konsentrasi VHB awal yang rendah dan tidak dapat terdeteksi
sebelum sampel bereplikasi pada kultur primer hepatosit sampai hari ketujuh.
Dalam penelitiannya Tuaillon et al.(2012) juga menyatakan adanya korelasi yang
lemah antara titer HBsAg dengan DNA VHB pada sampel.
\
Gambar 5 Deteksi infeksi dan replikasi VHB. M : marker 1 kb ladder, K: kontrol negatif,
J: VHB asal owa, H: VHB asal manusia
Proses infeksi VHB pada kultur serta uji molekuler yang dilakukan dapat
memberikan diagnosa yang lebih akurat dalam mendeteksi keberadaan VHB pada
sampel dibandingkan dengan uji serologis yang umum digunakan pada diagnosa
pasien terinfeksi VHB, yang diketahui memiliki variasi gejala klinis serta waktu
inkubasi in vivo yang panjang. Akan tetapi pertimbangan biaya serta waktu yang
diperlukan menjadi faktor kelemahan metode ini dibandingkan dengan uji
serologis yang ada.
Data semi kuantitatif konsentrasi DNA VHB pada kultur primer hepatosit T.
javanica (Tabel 1) didapatkan dengan melakukan real time PCR. Pengumpulan
data dilakukan secara duplo. Data berupa cycle treshold (CT) merupakan data
semi kuantitatif yang mengindikasikan konsentrasi DNA VHB pada masingmasing tanpa membandingkan pada kurva standar konsentrasi DNA VHB. Nilai
CT yang rendah mengindikasikan bahwa konsentrasi DNA yang dimiliki tinggi,
sedangkan nilai CT yang tinggi mengindikasikan bahwa konsentrasi DNA pada
sampel rendah.
12
Data CT yang diperoleh pada sampel owa menunjukkan penurunan CT
seiring hari pengambilan sampel (Tabel 1 dan Gambar 6). Hari pertama
didapatkan data pada 24,05 dan 22,08 sedangkan pada hari ketujuh 24,97 dan
24,61. Pada hari kelima belas pada 27,65 dan 28,19. Pada Kontrol positif owa
didapatkan CT pada 13,58 dan 13,19.
Pada sampel VHB asal manusia didapatkan nilai CT negatif di hari pertama,
pada hari ketujuh 38,31 dan 38,40 serta pada hari kelima belas negatif. Untuk
kontrol positif didapatkan data CT pada 17,79 dan 16,84 (Tabel 1 dan Gambar 7).
Hasil ini menunjukkan terjadinya proses replikasi VHB pada kultur primer
hepatosit T. javanica.
Glebe et al. (2003) melaporkan infeksi kultur primer hepatosit T. belangeri
peningkatan konsentrasi HBeAg dan HBsAg dimulai pada hari keenam, yang
menandakan terjadinya replikasi VHB pada sel. Dalam penelitiannya Walter et al.
(1996) juga mengemukakan infeksi in vitro menggunakan kultur primer hepatosit
T. belangeri mensekresikan HBsAg sejak hari ketiga setelah infeksi dan HBeAg
pada hari kelima setelah infeksi.
Tabel 1 CT real time PCR kultur primer hepatosit Tupaia javanica
Sampel
1
2
NTC
K1
K7
K15
J+
13,58
13,19
J1
24,05
22,08
J7
24,97
24,61
J15
27,65
28,19
H+
17,79
16,84
H1
H7
38,31
38,40
H15
-
13
J+
J1 J1 J7 J7
J15
Gambar 6 Grafik CT sampel VHB asal owa. J+: kontrol positif, J1: sampel hari 1, J7:
sampel hari 7, J15: sampel hari 15
H+H+
H1H7H15
Gambar 7 Grafik CT hasil real time PCR sampel VHB asal manusia. H+: kontrol positif,
H1: sampel hari 1, H7: sampel hari 7, H15: sampel hari 15
Kemampuan VHB asal owa dan manusia dalam menginfeksi dan bereplikasi
menunjukkan kesamaan situs pengenalan reseptor kedua virus tersebut pada
kultur primer hepatosit T. javanica. Antigen pre-S1 VHB merupakan salah satu
protein yang penting dalam proses infeksi, namun konfirmasi reseptor serta situs
pengenalan spesifik pada sel hepatosit belum diverifikasi (Glebe et al. 2003; Xie
et al. 2010). Selain itu analisa filogenetik yang dilakukan oleh Warren et al.(1999)
menunjukkan bahwa HBV asal owa memiliki kekerabatan paling dengan VHB
genotype C, yang terdistribusi di daerah Asia Tenggara, apabila dibandingkan
dengan genotipe VHB lainnya. Hal ini diduga karena terjadi transmisi antar
spesies oleh hepadnavirus pada satu daerah geografis.