1 I. PENDAHULUAN 1. Latar Belakang Keberadaan

I. PENDAHULUAN
1. Latar Belakang
Keberadaan alga cokelat Sargassum siliquosum di perairan Indonesia
sangat melimpah dan pemanfaatannya masih jauh dari optimal. Pada puncak
musimnya, sering terlihat S. siliquosum dibiarkan terdampar di pinggir pantai dan
tidak dimanfaatkan. S. crassifolium mengandung keragaman nutrisi diantaranya
protein sebesar 5,19% (w/w), mineral 36,39%, vitamin C: 49,01 mg/100g, vitamin A:
489,11 g/100g, lipid: 1,63% (w/w) dan karbohidrat yang cukup tinggi yaitu 60,02 %
(Handayani et al., 2004; Putri, 2011). Kandungan alginat dalam rumput laut cokelat
relatif tinggi yaitu 24% (Davis et al., 2004), 30,5% (Andriamanantoanina & Rinaudo.,
2013), 32,57% (Parthiban et al., 2012), 37,91% (Handayani et al., 2004) bahkan
mencapai 40,34 (Yudiati et al., 2016)
Alginat merupakan metabolit primer yang tersusun atas rangkaian
polisakarida yang merupakan kopolimer dari monosakarida D-manuronat dan Lglukoronat. Alginat merupakan polisakarida yang dapat berfungsi sebagai
immunomodulator. Pemberian alginat dalam pakan udang terbukti mampu
meningkatkan pertahanan non spesifik L. vannamei (Yeh et al., 2009). Liu et al.
(2006) melaporkan bahwa pemberian alginat sebanyak 2 g/kg pada Penaeus
monodon mampu meningkatkan aktivitas fagositik selulernya. Cheng et al. (2005)
melaporkan dosis pemberian alginat yang sama pada udang L. vannamei mampu
meningkatkan parameter imonologik dan menghasilkan kelulushidupan yang lebih
tinggi terhadap serangan bakteri Vibrio sp. Penelitian oleh Chung et al. (2011)
terhadap induk dan larva udang vaname (L. vannamei) menunjukkan potensi alginat
sebagai imunomudulator yang mampu meningkatkan produksi telur, daya tetas,
kelulushidupan dan berat larva. Penelitian oleh Isnansetyo et al, (2014, 2015)
menunjukkan bahwa rumput laut cokelat Sargassum sp. mampu meningkatkan
kekebalan non spesifik ikan lele (Clarias sp.) dan ikan nila (Oreochromis niloticus).
Alginat mempunyai sejumlah besar ikatan grup hidroksil dan karboksil
bebas yang terdistribusi sepanjang backbone rantai polimer. Dua grup fungsional ini
sangat memungkinkan untuk dimodifikasi sehingga berubah dari komponen asalnya
(Yang et al., 2011). Na2CO3 merupakan senyawa bersifat alkali yang dapat
memodifikasi gugus karboksil sehingga konformasinya berubah. CaCl2 yang
ditambahkan pada proses ekstraksi alginat akan membentuk “egg box” sehingga
1
alginat akan lebih stabil (Yang et al., 2009). Variasi kedua senyawa tersebut,
apabila diberi penguat EDTA (Jork et al., 2000) sehingga dapat menghasilkan
persentase rendemen yang lebih besar. Rendemen yang tinggi dengan kemampuan
immunomodulator yang efektif pada budidaya udang vaname dan proteksi serangan
WSSV merupakan suatu terobosan dalam keberhasilan teknologi.
Immunostimulan adalah komponen bahan alam yang dapat memodulasi
sistem immun dengan cara meningkatkan ketahanan tubuh inang dalam
mempertahankan serangannya terhadap pathogen (Ringo et al., 2006). Sistem
immun pada udang masih merupakan innate immune berupa pertahanan non
spesifik. Secara umum, terdapat dua komponen yaitu seluler dan humoral.
Komponen seluler terdiri atas fagositosis, enkapsulasi dan pembentukan nodul pada
hemositnya, sedangkan komponen humoral adalah Lektin, Pro Phenol Oksidase,
Respiratory Burst, Superoxide Dismutase, Superoxide Anion dan Antimikrobial
Peptida (Li & Xiang., 2014). Kedua komponen ini bekerja saling berinteraksi dan
bersinergi serta tidak dapat dipisah-pisahkan.
Udang vaname (Litopenaeus vannamei) merupakan komoditas unggulan
Indonesia. Selama dekade terakhir ini, produksi udang di seluruh dunia, terancam
oleh penyakit yang disebabkan oleh virus (Bai et al., 2014). Akibatnya adalah
penurunan produksi sehingga berdampak akhir pada kerugian ekonomi yang besar.
Hal ini terutama disebabkan oleh serangan penyakit virus, diantaranya yang sangat
populer adalah White Spot Syndrome Virus (Lightner, 1996; Jiang et al., 2014).
Serangan virus diawali dengan penempelan ligan atau PAMP (Pathogen
Associated Molecular Pattern) dengan PRR (Pattern Recognition Receptor) dari
inang (Ma et al., 2007). Pengenalan pola yang unik dari PAMP’s secara cepat
menghasilkan aktivasi sistem immun udang secara luas, termasuk pengeluaran
molekul-mulekul terlarut dan hemosit tersirkulasi yang dimediasi oleh komponen
humoral dan seluler. Enzim yang memicu perlawanan terhadap serangan virus
seperti ProPO, Serine Proteinase akan bekerja lebih aktif dan menghasilkan reaksi
pewarnaan berupa melanin (Amparyup et al., 2013).
Pathogen Recognition Receptor memberikan peranan yang penting dalam
sistem imun udang serta memberikan pola ekspresi yang berbeda dalam kaitannya
dengan penanggulangan infeksi virus. Informasi menunjukkan, bahwa PRR yang
berperan diantaranya adalah Toll-like Receptor (TLR), β-glucan binding protein
2
(BGBP), C-type Lectin (CTL’s). Ketiga PRR ini memberikan peranan yang penting
dengan cara mengenali dan mengeliminasi keberadaan microinvaders.
Penelitian tentang peran lektin sebagai reseptor pada L. vannamei sudah
dilaporkan dan sudah diidentifikasi. Ma et al. (2007) mengidentifikasi lektin tipe C
dari hepatopankreas L. vannamei (LvLT). Zhang et al. (2009) dan Zhan et al. (2011)
memastikan bahwa gen LvLec yang diambil dari otak, hemosit dan hepatopancreas
terdiri atas 157 dan 169 asam amino. LvLectin-1 dan LvLectin-2 diidentifikasi Wei et
al. (2012) pada hampir semua jaringan termasuk insang dan gonad. Kesemua lektin
tersebut berasal dari satu atau dua CRD. Penelitian terbaru Li et al. (2014)
membuktikan bahwa LvCTL3 mempunyai single C-type lectin-like domain (CTLD).
LvCTL3 mRNA dapat dideteksi di semua jaringan inang dan ekspresi LvCTL3
tertinggi didapatkan pada insang L. vannamei setelah diuji tantang dengan Vibrio
parahaemalyticus dan WSSV.
Transkrip BGBP dari udang karang disintesa di dalam hepatopankreas dan
dilepaskan ke dalam plasma. Setelah berikatan dengan β-1,3-glucan (BG), akan
memacu aktivasi dari sistem proPO dan menginduksi degranulasi hemosit (Duvic
dan Söderhäll, 1990). Perkembangan informasi menunjukkan adanya BGBP-HDL
telah diisolasi dari udang Litopenaeus vannamei (Vargas-Albores et al., 2000;
Yepiz-Plascencia et al., 2000; Romo-Figueroa et al., 2004) dan Ferropenaeus
chinensis (Lai et al., 2011) yang mempunyai 70% sekuen asam amino yang sama
dengan BGBP udang karang.
Pada saat pathogen mengenai penghalang fisik, seperti kulit atau saluran
mukosa intestinal, TLR akan mengenali dan respon sel imun menjadi aktif (Kumagai
et al., 2008). Full length cDNA dari Toll reseptor yang pertama (disebut dengan
LcToll yang mengkode 926 asam amino residu pada L. vanamei) telah dilaporkan.
Pola ekspresi dari FcToll secara jelas termodulasi setelah adanya rangsangan dari
serangan bakteri atau virus (Yang et al., 2008). Informasi menyebutkan bahwa telah
ditemukan dua buah TLR yaitu LvToll2 dan LvToll3 yang diisolasi dari L. vannamei.
Keduanya mengandung 1009 dan 1224 residu asam amino (Wang et al., 2012).
Wang et al. (2013) berhasil mengindentifikasi LvTollip pada L. vannamei. Setelah
dilakuan uji tantang dengan WSSV dan Vibrio alginolyticus, tingkat ekspresinya
menjadi naik dan teramati pada hampir semua jaringan yaitu insang, hemosit,
hepatopancreas, intestinal dan daging udang. Penulis menduga bahwa tingkat
ekspresi LvTollip responsif terhadap infeksi mikrobia.
3
S. siliquosum kaya akan alginat yang mempunyai kandungan monosakarida
yang mempunyai potensi sebagai immunostimulan pada udang. Sistem pertahanan
tubuh udang adalah sistem immun bawaan, tidak mempunyai sel memori seperti
ikan (Whittington et al., 1994). dan hewan-hewan tingkatan yang lebih tinggi serta
bersifat non spesifik. Kondisi seperti ini tidak memungkinkan untuk aplikasi vaksin.
Upaya pengendalian dapat dilakukan dengan pemakaian antibiotik, namun
pemakaiannya dalam jangka panjang dapat menimbulkan dampak negatif
(Isnansetyo et al., 2014). Dampak ini bukan saja terhadap lingkungan perairan
timbulnya resistensi, tetapi berdampak lebih jauh terhadap kesehatan konsumen
karena residu antibiotik. Pengembangan dan pembuatan antivirus merupakan salah
satu solusi alternatif, tetapi dengan memperhatikan perkembangan penyakit viral
yang semakin kompleks dari waktu ke waktu, maka solusi ini menjadi tidak efektif.
Harga yang mahal tentu menjadi suatu pertimbangan tersendiri pula bagi para
praktisi di lapangan. Solusi dan pencegahan terhadap hal ini adalah dengan cara
meningkatkan ketahanan tubuh udang melalui immunostimulasi yang bersifat alami
dan ramah lingkungan (Alifuddin et al., 2003). Pertahanan tubuh non spesifik yang
baik akan memberikan perlindungan sejak awal terjadinya infeksi oleh jamur,
parasit, bakteri maupun virus yang terdapat di perairan.
2. Permasalahan
Penelitian immunologik-molekuler terkait infeksi WSSV pada L. vannamei
yang berkembang pesat akhir-akhir ini sangat menarik untuk dilakukan, karena
semua penulis sepakat bahwa sistem immun pada udang sangat kompleks dan
belum secara komprehensif dipahami. Laporan publikasi terkait sistem immun non
spesifik pada udang pada umumnya menyajikan informasi tentang hasil akhir dari
serangkaian proses yang rumit dan panjang dalam mekanisme pertahanan udang.
Proses yang terkait dengan pengenalan Virus Binding Protein dari WSSV
pada reseptor (PRR) udang belum pernah dilaporkan, sehingga jawaban atas
pertanyaan reseptor yang bertanggung jawab pada pengenalan pathogen dan
mekanismenya menjadi menarik untuk dikaji. Terlebih lagi penggunaan berbagai
variasi alginat dengan konformasi yang berbeda sebagai immunomodulator
merupakan suatu tema yang belum pernah digali.
4
Phenol Oxydase (PO) banyak dilaporkan memegang kunci dan mempunyai
peran utama dalam sistem pertahanan udang. Setelah PRR mengenali WSSV,
maka akan terjadi serangkaian proses penghambatan protein oleh enzim serin, dan
diikuti dengan enzim PO dan menghasilkan melanin sebagai produk akhirnya.
Enzim PO sendiri tidak serta merta muncul, tetapi melalui serangkaian proses.
Salah satunya adalah sintesis proPhenol Oxydase Activating Enzyme (PPA) yang
mengaktivasi sistem proPhenol Oxydase (proPO) menjadi Phenol Oxydase (PO).
Berdasarkan pertimbangan di atas, maka penelitian komprehensif yang
memadukan peranan antara variasi konformasi alginat Sargassum siliquosum
sebagai imunostimulan dengan ekspresi gen immun pada reseptor dan proPO yang
diinfeksi dengan WSSV pada L. vanname perlu dilakukan.
3. Keaslian Penelitian
Penelitian mengenai berbagai variasi alginat (asam, sodium, kalsium)
dalam
kaitannya
dengan
menanggulangi WSSV
potensinya
sebagai
immunomudulator
untuk
pada udang L. vannamei belum pernah dilaporkan.
Pemberian ini menggunakan species L. vannamei sebagai hewan uji. Parameter
yang diteliti cukup banyak baik parameter kekebalan seluler dan humoral,
parameter ekspresi gen hingga sintasan dan pertumbuhan sehingga menggunakan
udang pada berbagai ukuran dan membuat keunikan tersendiri. Udang vanname
yang digunakan berukuran juvenile sampai dengan sekitar 15-22 gram. Liu et al.
(2006) menggunakan udang Penaeus monodon dalam penelitiannya, sedangkan
Yeh et al. (2008) menggunakan ikan Epinephelus coioides. Penelitian terbaru
Wongprasert et al. (2014) menggunakan species P. Monodon sebagai hewan uji.
Penggunaan tiga tipe alginat sekaligus dalam satu penelitian juga belum
pernah dilaporkan sebelumnya. Para peneliti terdahulu menggunakan satu tipe
alginat saja, yaitu sodium alginat (Cheng et al., 2004; Cheng et al., 2005; Liu et al.,
2006; Yeh, et al., 2008; Chung et al., 2011). Sodium alginat yang mereka gunakan
adalah buatan pabrik dan bersifat komersial. Penelitian ini menggunakan tiga tipe
alginat sekaligus, melakukan ekstraksi sehingga target ekstrak tercapai, sekaligus
memanfaatkan species lokal. Selain tipe, dosis alginat yang diaplikasikan pada
penelitian ini yaitu 0; 2,0; 4,0 dan 6,0g kg-1 baru pertama kali dilakukan. Penelitian
oleh Liu et al. (2006) menggunakan dosis 2g kg-1, aplikasi pemberian pakan secara
oral oleh Cheng et al. (2004; 2005) menggunakan dosis 0; 1,0 dan 2,0 g kg-1.
5
Penelitian peningkatan kekebalan dengan menggunakan sampel hemosit
udang telah banyak dilaporkan, baik paramater Total Haemocyte Counts (THC) dan
Aktifitas Fagositosis (Hou et al., 2005; Yeh et al., 2006; Lin et al., 2011;
Sirirustananun et al., 2011). Penelitian oleh Isnansetyo et al, (2014, 2015)
menunjukkan bahwa rumput laut cokelat Sargassum sp. mampu meningkatkan
kekebalan non spesifik ikan lele (Clarias sp.) dan ikan nila (Oreochromis niloticus)
termasuk data mengenai Indeks Fagositosis. Faktanya, penelitian-penelitian terkait
immunologi yang menyajikan data Indeks Fagositosis pada budidaya udang belum
pernah dilaporkan.
Penelitian lingkup immunologi dan hubungannya dengan tingkat ekspresi
gen pernah dipublikasikan oleh beberapa peneliti. Tingkat ekspresi gen proPO dan
βGBP pernah dilaporkan oleh Liu et al, (2006). Chen et al, (2014) melaporkan
terkait kekebalan non spesifik dan ekspresi gen WSSV, sementara data ekspresi
gen
VP
28
dipublikasikan
oleh
Wongprasert
et
al,
(2014).
Kenyataan
memperlihatkan bahwa ekspresi tiga immun reseptor dan satu gen kekebalan
(proPO) sekaligus memang belum pernah dipublikasikan. Data tingkat ekspresi
relatif gen dan kuantifikasi virus WSSV merupakan keunggulan tersendiri sekaligus
mempunyai nilai novelti yang tinggi pada penelitian ini. Keaslian penelitian semakin
diperkuat dengan fakta bahwa kuantifikasi virus berupa data jumlah copi virus,
hingga penelitian ini ditulis, belum pernah dilaporkan oleh peneliti sebelumnya.
4. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah:
a.
Mengetahui persentase rendemen dengan metode ekstraksi yang
berbeda serta karakterisasi alginat dari alga cokelat S. siliquosum.
b.
Mendapatkan penemuan dan menganalis efektifitas suplementasi tiga tipe
alginat S. siliquosum sebagai imunostimulan dan mengetahui parameter
imunologik (Total Haemocyte Count /THC, aktivitas enzim ProPO, Super
oxide dismutase) dan pertahanan udang pada L. vannamei terhadap
infeksi WSSV.
c.
Mendapatkan penemuan dan menganalis pengaruh tipe alginat terpilih
terhadap ekspresi gen yang berhubungan dengan sistem immun pada
udang.
d.
Mendapatkan penemuan dan menganalis efektifitas suplementasi secara
6
oral tipe alginat terpilih dari S. siliquosum pada dosis yang berbeda untuk
meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan L. vannamei terhadap infeksi
WSSV.
5. Manfaat
Manfaat dari hasil penelitian ini antara lain:
a.
Alginat diharapkan dapat menjadi salah satu immunostimulan yang dapat
meningkatkan kekebalan udang terhadap serangan WSSV pada L.
vannamei
serta
mengetahui
hubungan
suplementasi
immunostimulan/alginat, parameter ketahanan non spesifik dan ekspresi
gen yang bertanggung jawab.
b.
Pencegahan penyakit viral dengan pemberian alginat melalui pakan selain
dapat meningkatkan nilai tambah pakan, maka akan lebih mudah
diaplikasikan dalam usaha budidaya baik skala kecil maupun besar.
c.
Memberikan informasi bagi petani sekaligus pemegang kebijakan tentang
suplementasi alginat pada pakan untuk peningkatan produksi L.vannamei.
d.
Informasi dan penemuan teknologi dari penelitian ini diharapkan dapat
memberikan
kontribusi keilmuan serta mendorong pengetahuan dan
penelitian selanjutnya untuk memperluas eksplorasi dan pemanfaatan
alginat, terutama dalam bidang budidaya perikanan/kelautan.
7