Karakter Genotip

Karakter Genotip
Siti K. Chaerun
• Kromosom--Æ> gen ---Æ DNA ---Æ>
nukleotida--Æ>>:
– Nitrogenous basae (A-T, C-G)
– Deoxyribose (pentose sugar)
– Phosphate group
• DNA:
– dapat digunakan sebagai standard untuk
perbandingan antara mikroba dalam
karakterisasi/klasifikasi
– Sumber informasi yang paling penting dari DNA ini
adalah sekuense nuleotida genom bakteri yang
lengkap (tujuan teori dari metode klasifikasi).
• Kekurangan dalam mempelajari DNA ini:
prosedur preparasi dan purifikasi DNA yang
sangat rumit dan membosankan
PCR
• Replikasi “in vitro” sekuense DNA yang
sangat penting dalam klasifikasi dan
identifikasi bakteri.
• Aplikasi PCR ini adalah:
– Untuk analisis genotip mikroba culturable dan
unculturable (kebanyakan adalah prokariot).
– Deteksi probe gen dari mikrooba spesifik dari
suatu spesimen komplek (sampel lingkungan,
klinis, assosiasi simbiotik)
Template DNA
• Merupakan sekuense target yang ditambahkan pada
PCR dalam bentuk single- or double-strand
• Template DNA circular diamplikasi kurang efisien
dibandingkan DNA linier.
• Ukuran DNA template sangat krusial
• Amplikasi sekuense DNA dengan berat molekul tinggi
(>10 kb) dapat ditingkatkan dengan cara “digesting”
DNA template dengan menggunakan enzim restriksi.
• Konsentrasi template yang diperlukan:
– Yeast: 10 ng
– Bakteri 1 ng
– Plasmid 1 pg
Primers
• Faktor terpenting dalam mempengaruhi efisiensi
dan spesifikasi reaksi amplifikasi
• Paling krusial sehingga diperlukan desain yang
hati-hati untuk mendapatkan produk yang
diinginkan dengan yield yang besar, mereduksi
amplikasi sequense yang tidak diinginkan,
memfasilitasi manipulasi produk PCR.
• Jumlah untuk setiap primer: 0.1-0.5 uM (6 x 1012
sampai 3 x 1013 molekul)
• Semakin tinggi konsentrasi primer akan
menghasilkan amplifikasi non-spesifik
dNTPs (Deoxynucleoside
triphosphates)
• PCR perlu jumlah equamolar dari dATP,
dTTP, dCTP, dGTP
• 200-250 uM dari setiap dNTP diatas untuk
Taq polymerase dalam reaksi yang
mengandung 1.5 mM MgCl2 --Æ> cukup
untuk mensintesis 6-6.5 ug DNA
• Konsentrasi dNTPs (> 4mM)---- inhibitor
karena akan mengambil Mg+2.
Inhibitor PCR
• Inonic detergent
• Polyaniones
• Gel-loading dye (bromophenol blue,
xylene cyanol)
• Phenol
• EDTA
• Template DNA
• dll