Cloning vectors based on E

Dwi Yeni Wayansari (B1J006037)
Ari Pringgo Aji (B1J006039)
Fajar Eka Permana (B1J006041)
K07-TD-07
Vektor-vektor kloning berdasarkan pada
genome bakteriofage E. coli
Genome λ adalah 48.5 kb, dimana 15 kb atau yang sebanyak itu
‘merupakan pilihan' dimana mengandung yang hanya dibutuhkan untuk penyatuan
DNA faga kedalam kromosom E. coli (Gambar 1A). Ruas-ruas ini dapat
dihilangkan tanpa mengurangi kemampuan faga untuk menginfeksi bakteri dan
sintesis langsung partikel λ baru oleh siklus litik. Dua jenis vektor sedang
dikembangkan (Gambar 1B):
Gambar 1 A dan 1 B
•
Penyisipan vector, dimana semua DNA pilihan telah dihilangkan dan
lokasi penghambatan yang unik diperkenalkan pada semua genom yang
dilekatkan.
•
Vektor pengganti, dimana DNA pilihan terkandung dalam fragmen
pengisi, disambung dengan sepasang bagian pembatas, yang digantikan
apabila DNA yang dikloningkan terligasi kedalam vektor.
Genome λ adalah linear, tetapi 2 ujung alami molekul tersebut memiliki
12 nukleotida cabang tunggal yang menggantung, yang disebut lokasi cos, yang
memiliki sekuen pelengkap dan oleh karena itu dapat dipasangkan satu sama lain.
Vektor kloning λ dapat diperoleh sebagai suatu molekul lingkar yang dapat
dimanipulasi di dalam tabung uji dengan cara yang sama dengan plasmid,
pengenalan kembali E. coli dengan metode transfeksi satu istilah yang digunakan
untuk mengambil DNA phage telanjang. Pengemasan in vitro dapat digunakan.
Prosedur ini dimulai dengan versi linier kloning vektor pemotongan tepi awal dari
molekul menjadi dua ruas, bagian kiri dan kanan, masing-masing dengan satu
lokasi cos pada satu ujungnya. Ligasi dilakukan dengan hati-hati dalam
pengukuran kuantitas masing-masing sisi dan DNA dapat dikloningkan.
Tujuannya untuk menghasilkan concatamer pada ruas yang berbeda yang saling
terkait dengan urutan bagian kiri DNA baru ke bagian kanan, seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 2. Concatamer kemudian ditambahkan pada campuran
in vitro, yang
mengandung semua protein yang diperlukan untuk membuat
partikel faga λ. Protein ini membentuk partikel faga secara spontan, dan akan
ditempatkan di dalam partikel pada setiap fragmen DNA yaitu antara 37 dan 52
kb panjangnya dan merupakan sekuen yang memiliki sayap. Campuran susunan
tadi selanjutnya dipotong pada kombinasi lengan kiri dan kanan DNA sebesar
37-52 kb terpisah dari concatamer dan menyusun faga λ di sekelilingnya. Faga
tersebut kemudian dicampur dengan sel-sel E. coli, dan proses infeksi alamiah
dari vektor ditambah DNA baru kedalam bakteri.
Gambar 2
Setelah infeksi, sel-sel disebarkan diatas cawan agar. Tujuannya untuk
menghasilkan lapisan bakteri diatas permukaan agar. Bakteri kemudian di infeksi
dengan vektor kloning yang dikemas yang kemudian mati dalam 20 menit karena
gen λ yang terletak di lengan vektor secara langsung menggandakan diri pada
DNA dan mensintesis faga baru dengan siklus litik, masing-masing faga baru
tersebut memiliki satu salinan mereka sendiri pada vektor ditambah DNA yang
dikloningkan. Bakteri yang mati dan mengalami lisis melepaskan faga ke media
sekitarnya. Hasil akhir proses ini adalah pembersihan lokasi dari plak yang terlihat
pada hamparan bakteri yang tumbuh diatas cawan agar (Gambar 3). Dengan
sejumlah vektor λ, semua plak terbentuk dari faga rekombinan karena ligasi dari
dua lengan tadi terjadi tanpa penyisipan dua DNA baru yang berakibat pada
molekul yang terlalu pendek untuk disusun. Dengan vektor-vektor lain hal ini
diperlukan untuk membedakan plak rekombinan dengan yang bukan rekombinan.
Berbagai metode digunakan, termasuk sistem galaktosidase β yang dijelaskan
diatas vektor plasmid pUC8 (gambar 4.9), yang juga dapat diterapkan pada vektor
λ yang membawa satu fragmen gen lacZ kedalam klon yang disisipkan dari DNA.
Gambar 3
Daftar Pustaka
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?
highlight=genomes,based,bacteriophage,E.%20coli,Cloning
%20vectors&rid=genomes.section.6035#6043
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6045
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6048
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6049
Diakses Tanggal 28 Oktober 2008
Daftar Situs Terkait
http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?
it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120078/micro10.swf::Step
s%20in%20Cloning%20a%20Gene
http://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/cloning/clon
ing.swf
http://www.bioteach.ubc.ca/TeachingResources/Applications/GMOpkgJKloseGL
ampard2.swf
http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03EstructuraDelGenoma/animaciones/humanShot.swf
http://www.pbs.org/wgbh/nova/genome/media/sequence.swf
http://www.blackwellpublishing.com/trun/artwork/Animations/cloningexp/cloni
gexp.swf
http://www.brookscole.com/biology_d/templates/student_resources/0534252729_
fairbanksandersen/flashcards/ch09.swf
Diakses Tanggal 28 Oktober 2008