Pemurnian dan Karakterisasi Protease

TINJAUAN PUSTAKA
Mikmorganisme dari Lingkungan Bersuhu Tinggi
Filogeni
mikroorganisme
berdasarkan
sekuen
nukleotida
RNA
ribosom
mengklasifikasikan kehidupan atas tiga domain, yaitu Archaea, Bacteria, dan Eukarya.
Archaea dan Bacteria yang berada dekat dengan akar pohon filogenetik hidup di
lingkungan yang ekstrim, seperti anaernb, pH rendah, kadar garam tinggi, dan suhu
tinggi. Sebagian besar tergolong hipertermofil yang hidup optimum di atas 90°c, seperti
kondisi lingkungan awal kehidupan di bumi. Berdasarkan ha1 tersebut selumh
mikroorganisme diperkirakan memiliki nenek moyang hipertermofil (Adams & Kelly 1995;
Blochl et a/. 1995).
Mikroorganisme yang hidup di lingkungan bersuhu tinggi
diklasifikasikan:
(1) termofil, suhu optimum pertumbuhan di antara 45 OC - 65 OC dan (2) termofil ekstrim
(kaldoaktif), tumbuh di atas 65 OC - 70 OC (Steel & Walker 1991). Madigan et a/. (2000)
menamakan hipertermofil bagi mikroorganisme yang tumbuh optimum pada suhu di atas
90 OC dan mati di bawah 60 OC. Hipertermofil hanya terdapat pada habitat bersuhu tinggi
sepefti mata air panas, kawah, solfatara, dan sumber air panas dasar laut.
Sebagian besar hipertermofil bersifat anaerob obligat, dan beberapa diantaranya
bersifat heterotrof obligat, yaitu hanya dapat menggunakan senyawa karbohidrat atau
protein kompleks sebagai sumber karbon. Ada juga hipertennofil yang tergantung pada
senyawa belerang untuk pertumbuhannya, dan menghasilkan hidrogen sulfida yang
bersifat korosif (Adams & Kelly 1995).
Hipertermofil yang dikenali bani sejumlah 47
spesies yang dikelompokkan ke dalam 23 genera dan 10 ordo dari kelompok bakteri dan
t
arkaea.
Bakteri hipertermofil yang tumbuh pada suhu tertinggi adalah
pymphilus dan Thermotoga maritima masing-masing pada 95
OC
dan 90
Aquifex
OC.
Arkaea
hipertermofil umumnya tumbuh optimum pada suhu yang lebih tinggi daripada bakteri,
yaitu pada kisaran 103-11O'C , misalnya Pyrococcus, Pymbaculum, Pyrodictium, dan
Methanopyms (Blochl et a/. 1995).
Sebagian besar termofil berasal dari genera pembentuk endospora, yaitu Bacillus
dan Clostridium.
Mikroorganisme termofilik yang lain antara lain dari kelompok
aktinomiset, bakteri asam laktat, bakteri gram negatif, dan sianobakter (Stell & Walker
1991).
Bacillus tennofilik
Bacillus termofilik telah diisolasi lebih dari 100 tahun yang lalu pada kisaran
perturnbuhan mesofilik dan termofilik . Mikroorganisme ini sering dijumpai sebagai
kontarninan produk makanan dan juga sebagai penghasil enzim termostabil, seperti
protease, amilase, pullulanase, glukosa isomerase, lipase, xilanase, dan enzim restriksi
DNA. Sifat tennodurik dan kemampuan menghasilkan endospora dari Bacillus termofilik
sering digunakan pula sebagai indikator keberhasilan sterilisasi uap (Rainey et a/. 1994).
Taksonomi Bacillus termofilik sebagian besar berdasarkan pada bentuk fenotipik
dan karakterisasi genotipik. Analisis filogenetik Bacillus termofilik berdasarkan sekuens
16s rDNA dan rRNA telah berhasil dipelajari (Tabel 1). Rainey et a/. (1994) melaporkan
Bacillus termofilik memiliki rasio basa mol % G+C dari gen IS rDNA di antara 57-63.
Pada mikroorganisme mesofilik mol % G + C tersebut di antara 53 dan 55.
Molekul RNA ribosom (rRNA) dapat digunakan untuk rnelihat hubungan evolusi
organisme hidup, karena sifatnya yang konstan, terdistribusi universal, secara
fungsional homolog, dan sangat konservatif sehingga dapat dipakai sebagai jam biologi
(kmnometer) suatu perjalanan evolusi. Penelitian filogenetik prokatyot lebih banyak
menggunakan IS-rRNA (1500 nukleotida), karena memiliki sekuens konservatif yang
tinggi dan sekuens mriabel tertentu yang dapat digunakan sebagai
filogenetik (Madigan et a/. 2000).
kronorneter
Tabel 1. Nilai mol % G+C dari DNA dan 16s-rDNA dari delapan galur Bacillus terrnofilik
(Rainey et a/. 1994)
Galur
mol % G+C
DNA
Suhu opt.*
ec)
. .
pH
opt.*
60
5,5-9,0
61
Mol%
G+C
16s-rDNA
57
B. thermooleovemns DSM 5366
55-65
6,O-7,5
58
59
6.caldovelox DSM 4 11
60-70
6,3-8,5
65
59
6. caldolyt~~s
DSM 405
72
6,O-8,O
52,53
59
B. caldotenax DSM 406
80
7,5-8,5
65,73
59
6. thermodenitrificans DSM 466
65-70
td
49
59
6. themomber DSM 7064
45-48
td
57
57
6. thermocatenulatus DSM 730
65-70
td
69
60
B. tlavothermus DSM 2641
Keterangan: * suhu dan pH optimum pertumbuhan, td = tidak ditentukan
Enzim
Enzim adalah protein yang dihasilkan oleh sel hidup dan berfungsi sebagai
katalis biologi yang spesifik dan efisien. Hampir seluruh reaksi fisiologi dikatalisis enzim
dengan meningkatkan kecepatan reaksi 10~-10'*kali lebih cepat daripada reaksi tanpa
katalis enzim. Reaksi katalitik oleh enzim pada umumnya bersifat cepat membentuk
reaksi kesetimbangan tanpa disertai reaksi samping, bekerja dalam larutan encer,
berlangsung pada suhu rendah, dan kondisi netral (Ottaway & Apps 1984).
Enzim berupa protein globular yang terbentuk dari rantai polipeptida yang berlipat
secara kompak. Konformasi tersier protein globular merupakan bentuk yang paling
stabil, karena ditunjang oleh berbagai ikatan yang menstabilkan struktur tersier protein.
Jenis-jenis ikatan tersebut adalah: ikatan hidrogen yang terdapat di antara gugus R
,
residu asam amino rantai samping yang berdekatan, ikatan ion di antara gugus R yang
ben'awanan, interaksi hidrofobik dari gugus R asam amino hidrofobik,
kovalen berupa ikatan disulfida dari residu sistin (Ottaway & Apps 1984).
dan ikatan
Struktur protein enzim mempenganrhi aktivitas katalitiknya. Aktivitas katalitik enzim
akan hilang bila tejadi denaturasi protein. Denaturasi adalah perubahan konformasi
molekul protein dari bentuk berlipat menjadi bentuk tidak beriipat. Denaturasi dapat
menyebabkan kehilangan aktivitas biologi, kelarutan, dan kemampuan untuk
membentuk kristal. Denaturasi dapat disebabkan oleh kondisi pH ekstrim, suhu tinggi,
dan pengaruh senyawa seperti: detergen ionik, pelarut organik, urea konsentrat, anion
besar dari asam kuat (ClOj, CCI 3CO03, dan ion chaotropic (I-, SCN') (Ottaway & Apps
1984).
Enzim Tennostabil
lstilah termostabil (stabil panas) didefinisikan dengan sejumlah arti dan bersifat
relatif. Sebagian besar definisi termostabil bemubungan dengan sifat alami enzim dan
sumber penghasilnya. Maka ada yang mendefinisikan enzim termostabil sebagai enzim
yang memiliki suhu aktivitas maksimum di atas suhu pertumbuhan organisme
penghasilnya. Namun pada kenyataannya, ada enzim yang dihasilkan oleh
mikroorganisme yang hidup pada suhu 90°C tetapi mempunyai suhu aktivitas optimum
di bawah atau di atas suhu pertumbuhannya.
Definisi enzim termostabil yang lain berhubungan dengan aktivitas enzim yang
masih terukur setelah enzim diinkubasi pada suhu 6 0 ' ~atau lebih selama waktu
tertentu. Definisi tersebut temyata dapat
berlaku
untuk enzim yang bersifat
termotoleran yang masih memiliki aktivitas enzim setelah pemanasan dan terukur pada
kondisi suhu mesofilik. Kestabilan enzim biasanya diukur berdasarkan waktu paruh
aktivitas enzim. Waktu panrh didefinisikan sebagai waktu reaksi aktivitas enzim yang
tufun hingga sepafuh aktivitas semula pada kondisi suhu tertentu. Nilai waktu paruh
masih benrpa ukuran yang relatif. Namun pada umumnya enzim termostabil sejati
memiliki waktu p a ~ pada
h
suhu 5 0 ' ~yang jauh lebih lama dari pada enzim termolabil
(tidak tahan panas) (Ng & Kenealy 1986).
Mikroorganisme (hiper)termofil berpotensi sebagai penghasil enzim termostabil.
Enzim yang dihasilkannya memiliki nilai ekonomis, antara lain:(l) stabil selama
penyimpanan akan mengurangi biaya produksi dan memudahkan untuk proses
pemumian enzim, (2) reaksi berlangsung pada suhu tinggi sehingga akan mengurangi
kontaminasi oleh
bakteri mesofil, (3) lebih tahan terhadap pelarut, detergen, dan
senyawa denaturan, (4) pada suhu tinggi proses fermentasi akan lebih cepat, karena
reaksi enzim akan meningkat, dan (5) pemisahan produk yang mudah menguap akan
lebih cepat (Steel &Walker 1991).
Perbandingan komparatif protein dari mesofil dan termofil menunjukkan terdapat
kesamaan uri-ciri molekuler dan katalitik di antara protein yang mengatalisis reaksi yang
sama dari kedua organisme tersebut (Steel & Walker 1991). Berdasarkan studi residu
asam amino
pada sisi katalitik enzim, protease termostabil yang berasal dari
B. steamthennophilus dan B. themopmteolyticus menunjukkan 85% homolog, dan
protease termolabil (tidak tahan panas) dari B. subtilis dan B. amyloliquefaciens
menunjukkan 82% homolog. Protease B. stearothermophilus hanya menunjukkan 30%
homolog dengan protease B. subtilis. Sekuen dari 17 residu asam amino, termasuk
residu histidina pada sisi aktif dari keempat protease netral ini bersifat sangat
konservatii, dan diduga memiliki struktur tiga dimensi yang sama (Rao et al. 1998).
Sifat stabil panas suatu protein ditentukan struktur intrinsik protein antara lain: (1)
memiliki ikatan disulfida, (2) jumlah interaksi elektrostatik permukaan protein (jembatan
garam) lebih banyak, (3) struktur protein yang lebih kompak dengan adanya interaksi
hidrofobik dan ikatan hidrogen, dart (4) mengandung kation divalen atau monovalen
yang menjaga kestabilan konformasi protein (Steel & Walker 1991).
Sifat ketahanan terhadap panas suatu protein atau enzim dapat diinduksi dengan
penambahan senyawa nonprotein atau melalui modifikasi fisiko kimia. Modifikasi kimia
dilakukan dengan cara mereaksikan enzim dengan substrat, pelarut, garam, dan kation.
Sebagai contoh, gliserol, sukrosa, dan etilen glikol biasa dicampurkan dengan enzim
selama masa penyimpanan. Ion kalsium dapat mempertahankan kestabilan terhadap
panas pada enzim protease dan amilase. Demikian pula ion magnesium, strontium, dan
barium memberikan pengaruh yang sama seperti kalsium pada a -amilase Aspergillus
orylae (Ng & Kenealy 1986).
Enzim termostabil yang dipasarkan ada pula yang berasal dari mesofil. Melalui
teknik rekombinasi DNA, memungkinkan untuk mengklon enzim terrnofilik ke dalam
inang mesofilik untuk menghasilkan enzim termostabil.
lmanaka et
al. (1986)
melakukan mutasi terarah dengan cara mensubstitusi asam amino pada daerah yang
bukan konservatif dari protease netral termostabil dan terrnolabil yang berasal dari
Bacillus temyata dapat pula meningkatkan termostabilitas.
Protease Mikroorganisme
Protease atau enzim proteolitik adalah enzim yang memiliki daya katalitik terhadap
ikatan peptida dari suatu molekul polipeptida atau protein. Protease dapat diisolasi dari
tumbuhan (papain, bromelin), hewan (tripsin, kimotripsin, pepsin, renin), dan
mikroorganisme (bakteri, kapang, dan virus). Protease merupakan enzim hidrolitik yang
paling banyak diperdagangkan dalam industri ( 5 60%), sebanyak 2 40% di antaranya
berasal dari mikrorganisme. lndustri yang memanfaatkan protease antara lain industri
detergen, makarian, tekstil, kulit, dan farrnasi (Rao et al. 1998).
Komisi tatanama International Union of Biochemistry and Molecular Biology
mengelompokkan protease ke dalam kelompok enzim 3 (hidrolase) dan subkelompok 4
(EC 3.4). Protease diklasifikasikan berdasarkan tiga kriteria utama: (1) jenis reaksi yang
dikatalisis, (2) sifat kimia sisi katalitik, dan (3) hubungan evolusi struMur enzim.
Protease terdiri dari dua kelompok utama ditinjau dari jenis reaksi yang dikatalisis
yaitu eksopeptidase dan endopeptidase. Eksopeptidase memotong ikatan peptida dekat
dengan ujung amino (aminopeptidase, EC 3.4.11
(karboksipeptidase, EC 3.4.16
(EC 3.4.21
- EC 3.4.18)
- EC 3.4.14),
atau ujung karboksil
dari molekul substrat.
Endopeptidase
- EC 3.4.34) memotong ikatan peptida pada bagian dalam rantai polipeptida
dan jauh dari ujung amino atau karboksil molekul substrat.
Endopeptidase dikelompokkan ke dalam 4 subkelompok berdasarkan mekanisme
katalitik enzim, yaitu: protease serina (EC 3.4.21), pmtease sisteina (EC 3.4.22),
protease asam (EC 3.4.23), dan protease logam atau metaloporotease (EC 3.4.24).
Rawlings & Barret memberi kode bertunrt-turut: S, C, A, dan M untuk memudahkan
penamaan keempat subkelompok tersebut. Endopeptidase yang belum diketahui
mekanisme katalitiknya diberi nomor EC 3.4.99 (Rao eta/. 1998).
Penggolongan protease berdasarkan sekuen asam amino atau sekuen nukleotida
penyandinya mengarah pada hubungan evolusi s t ~ k t u renzim. Sebagai contoh,
dendogram Treeview package menyeleksi sekuen asam amino dari protease yang
berasal dari mikroorganisme, tumbuhan, dan hewan melalui program SWISS-PROT dan
PIR. Protease ini kemudian dikelompokkan ke dalam tiga kelompok yang berbeda
berdasarkan pH aktivitas enzim (Rao et a/. 1998).
-
Protease Serina
Protease serina dicirikan dengan kehadiran gugus serin pada sisi aktif. Protease
serin
dihambat
antara
lain
oleh
senyawa
3,4-dikloroisokoumarin
(3,4-DCI),
fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF), diisopropilfluomfosfat (DFP), dan tosil-I-lisin klorometil
keton (TLCK). Protease serina aktii pada kondisi pH netral dan alkalin (pH 7-11).
Protease serina terdiri dari dua tahap reaksi hidrolisis, yaitu asilasi dan deasilasi. Tahap
asilasi ditandai dengan pembentukan senyawa antara enzim-peptida yang berikatan
kovalen bersamaan dengan hilangnya fragmen asam amino atau peptida. Pada tahap
deasilasi terjadi serangan nukleofilik senyawa antara oleh air yang menyebabkan
hidrolisis peptida (Rao et a/. 1998).
Protease serina yang berasal dari mikroorganisme dikelompokkan oleh Morihara
ke dalam empat kelompok protease: serupa tripsin, alkalin, a-litik Myxobacter, dan
stafilikokal (Tabel 2). Protease serina dari setiap kelompok menunjukkan kespesifikan
yang khas pada sisi pemotongan substrat.
Kelompok
pertama menunjukkan
kespesifikan terhadap asam amino basa, kelompok kedua terhadap residu aromatik
atau hidrofobik, kelompok ketiga terhadap residu alifatik sederhana, seperti alanina, dan
kelompok keeempat spesifik terhadap residu asam (aspartat atau glutamat) pada sisi
karboksil dari titik pemotongan substrat sintetik atau rantai-B insulin teroksidasi (Ward
1983).
Tabel 2. Pengelompokan dan ciri-ciri protease serina mikrorganisme (Ward 1983;
Tsuchiya et a/. 1992)
Kelompok
Contoh Mikrob
Ciri-ciri
Senyawa
Protease Serina
Penghasil
Penghambat
Serupa tripsin
Streptomyces sp.
Aktif pada pH 8,O
DFP, TLCK
- BM 20000
- pH isoelektrik 4
-
Alkalin
-Bacillus lichenifomis
(Subtitisin Carlsberg)
-Themoactinomyces
I
SP.
a-litik
Myxobader
- Mycobacterium
Stafilokokal
Staphylococcus
aul~us
- Somngium
- pH optimum 8-9
-
BM 27277
pH isoelektrik 9,4
-
pH optimum 11,5
BM 25000
-
Aktif pada pH 9,O
DFP, PMSF
DFP
- pH optimum 4,O- DFP
-
7,8
BM 12000
Protease Asam
Protease asam atau protease asam aspartat tergantung pada kehadiran residu
asam aspartat untuk aktivitas katalitik enzim. Serangan nukleofilik pada protease asam
dilakukan oleh dua transfer proton: satu dari nukleofil ke diad dari dua gugus karboksil,
dan yang lainnya dari diad ke karbonil oksigen substrat (mekanisme dorong-tank [pushpulll) yang akan membentuk senyawa antara tetraherdral bermuatan netral. Bentuk
tetrahedral ini akan pecah kembali dengan mekanisme dorong-tank (Polgar 1990).
Protease asam terdiri dari tiga subkelompok: pepsin, retropepsin, dan enzim yang
berasal dari pararetrovirus. Sebagian besar protease asam aktif pada pH 3-4, BM
30000
- 40000, titik isoelektrik antara pH 3 - 43, dihambat oleh pestatin, dan sensitif
terhadap senyawa diazoketon, seperti: diazosetil-DL-norleusin metilester (DAN) dan 1,2epoksi-3-(pnitrofenoksi)propana (EPNP) dengan kehadiran ion tembaga. Protease
asam banyak dihasilkan oleh fungi, dan jarang dihasilkan bakteri (Ward 1983; Rao et a/.
1998).
Protease Sisteina
Protease sisteina atau protease tiol memerlukan asam amino sisteina dan histidina
untuk aktivitas katalitik enzim. Berdasarkan kespesifikan rantai samping, protease ini
terdiri dari 4 subkelompok: serupa papain, serupa tripsin, spesifik untuk asam glutamat,
dan lainnya (di luar ketiga subkelompok pertama). Papain mempakan protease sisteina
memiliki pH optimum netral, dan sensitii terhadap senyawa sulfidril, seperti PCMB.
Klostripain merupakan contoh protease sisteina yang menunjukkan kekhasan pada
asam amino bash pada sisi karboksil dari titik potong, BM 50000, dan pH isolelektrik 4,84,Q (Ward 1983; Rao et a/. 1998). Protease sisteina mengkatalisis hidrolisis turunan
asam karboksilat melalui jalur pembentukan asam-basa dan hidmlisis senyawa antara
asil-tiol. Mekanisme reaksi protease sisteina mirip dengan protease serina, kecuali
nukleofil berupa gugus tiolat bukan hidroksil (Polgar 1990).
Metaloprotease
Metaloprotease (protease logam) membutuhkan ion logam divalen untuk aktivitas
enzim. Mekanisme reaksi metaloprotease agak berbeda dengan ketiga jenis protease
lainnya.
Pada termolisin, gugus karboksilat dari Glu 143 membantu serangan
nukleofilik ikatan zink dengan molekul air pada karbon karbonil ikatan peptida.
Pengelompokan protease logam berdasarkan kespesifikan reaksi terdiri dari: netral,
alkalin, Myxobacter I, dan Myxobader II (Tabel 3). Keempat subkelompok ini dihambat
oleh senyawa pengkhelat, seperti etilendiamintetraasetat (EDTA). Protease netral
menunjukkan kespesifikan terhadap asam amino hidrofobik, protease alkalin
menunjukkan kespesifikan yang sangat has, Myxobacter I spesifik pada asam amino
sederhana pada kedua sisi titik potong, dan Myxobacter II spesifik pada residu lisina
pada sisi amino ikatan peptida (Ward 1983; Rao et a/. 1998).
Tabel 3. Pengelompokan, ciri-ciri, dan contoh metaloprotease mikroorganisme
(Ward 1983; Kubo et a/. 1988)
Kelompok
Metaloprotease
Netrai
Contoh Mikrob Penghasii
B. steamthermophilus
Ciri-ciri
-
BM 34000
pH optimum 7,5
dihambat oleh ImM EDTA
- Pseudomonas aemginosa - Semtia spp.
-
BM 48000-60000
pH optimum 7,O-9,O
Peka pada konsentrasi
EDTA > IO-~M
Myxobacter I
- Sorangium sp.
- Mycobacter sp.
-
BM 14000
pH optimum 9,O
Myxobacter II
- Mycobactersp.
-
BM 17000
pH optimum 8,5-9,O
Alkalin
,
-
1
Protease Tennostabil Bacillus
Protease termostabil yang dihasilkan Bacillus dan telah digunakan secara
komersial, antara lain subtilisin, termolisin, dan kaldolisin. Ketiga enzim ini mengikat
satu atau lebih kalsium yang berguna untuk kestabilan enzim di lingkungan
ekstraseluler. Protease yang berikatan dengan kalsium tidak cocok digunakan dalam
industri detergen, karena detergen mengandung senyawa antara lain tripolifosfat yang
dapat mengkhelat kalsium. lndustri detergen memerlukan enzim yang stabil pada pH
alkalin dan denaturan kimia. Subtilisin yang bersifat alkalin telah digunakan dalam
industri detergen dengan terlebih dahulu dimodifikasi. Residu 75-83 yang merupakan
loop pengikatan kalsium subtilisin dihilangkan dan sisi aktii senna 221 diganti dengan
sisteina. Delesi residu 75-83 menyebabkan destabilisasi protein, tetapi kemudian
mereka menciptakan struktur baru untuk kestabilan enzim dengan cara mutagenesis
terarah menggunakan oligonukleotida pendek. Mutan baru yang terbentuk memiliki
aktivitas protease dengan 1000 kali lebih tahan terhadap senyawa pengkhelat
(Strausberg et a/. 1995).
Peningkatan termostabilitas subtilisin dilakukan dengan
menambah ikatan disulfida menggunakan mutagenesis terarah pada AsnlO9 dan
Asn218 dengan Ser (Rao et a/. 1998).
Kaldolisin dihasilkan oleh B. caldolyticus dan Thennus aquaticus T-351. Kaldolisin
memiliki waktu paruh selama 193 jam pada suhu 7 5 ' ~dalam 10 mM CaCI2, dan bila
tanpa kalsium hanya 4,8 menit. Kaldolisin mengikat enam
ion ca2' untuk setiap
molekul enzim. Ada dua tipe pengikatan kalsium pada kaldolisin empat ion ca2' terikat
secara lemah dan dapat dihilangkan dengan kromatografi penukar kation. Dua ion ca2'
v
lainnya terikat kuat dan menentukan kestabilan enzim (Steel & Walker 1991).
Termolisin merupakan metaloendopentidase yang dihasilkan oleh galur-galur
spesies Bacillus. Enzim yang dihasilkan dikenal sebagai protease netral (NP) atau
protease serupa termolisin (TLP). Struktur termolisin pertama kali dilaporkan tahun
1972 dari B. cereus. Enzim ini relatif stabil
terhadap suhu tinggi. Struktur kristal
termolisin termostabil ekstrim yang berasal dari B. thermopmteolyticus, termostabil
moderat NP-cer yang berasal dari 8.cereus terdiri, dan dari NP lainnya terdiri dari
domain N-terminal (residu 1-154) mengandung lipatan beta, dan domain C-terminal
(residu 153316) mengandung alfa heliks. Termolisin mengandung satu atom zink pada
sisi aktiif dan dua hingga empat ion ca2' untuk kestabilan enzim (Eijsink et a/. 1995).
Spesies-spesies Bacillus yang menghasilkan enzim yang memiliki sifat termostabilitas
dan homologi yang serupa dengan termolisin dengan termolisin B. thermopmteolyticus
terdapat pada Tabel 4.
Tabel 4. Homologi dan termostabilitas protease netral yang dihasilkan oleh spesies
Bacillus (Eijsink et a/. 1993).
Spesies Bacillus
CC)
Nama enzim
ldentik relatii (%)
termolisin
100
82,O
B. ~ a l d ~ l y f i ~ ~ ~
NP-=I
86
76,7
B. stearothennophilus
NP-ste
85
68,5
8.cereus
8.subtilis
NP-cer
73
60,O
NP-sub
47
55,3
6. amyloliquefaciens
NP-amy
47
55
6. thermopmteolyticus
T50
Kestabilan TLP biasanya dinyatakan dengan Tsayaitu suhu pada 30 menit inkubasi
aktivitas enzim tereduksi separuhnya. Sebagai contoh Tsatermolisin 86,g0c dan berbeda
dengan TLP yang kurang stabil seperti NP-ste (TS0= 73,4'~) pada 44 asam amino.
Secara keseluruhan kedua enzim hampir sama dan seluruh residu yang terlibat dalam
katalisis dan pengikatan ion logam bersifat konservatii. Perbedaan kestabilan termolisin
dengan NP-cer ditentukan oleh 44 asam amino yang terdapat pada domain N-terminal.
Kestabilan enzim NP atau TLP lainnnya dapat ditingkatkan pada daerah ini (Eijsink et
al. 1995).
Pemumian Enzim Protease
Pemumian bertujuan untuk memisahkan enzim yang diinginkan dari senyawa yang
tidak dikehendaki lainnya. Tahaptahap pemumian tergantung dari tujuan akhir, apakah
untuk tujuan komersial atau tujuan riset. Enzim yang kasar atau yang dimumikan
sebagian masih dapat dipakai untuk
komersial, sedangkan enzim yang mumi atau
hampir mumi dikehendaki dalam riset atau dipakai dalam produk analitik. Hanis (1989)
menyebutkan minimal ada tiga strategi dalam
dipetttatikan: (1) kualitas; perlu tindakan
pemumian enzim yang hams
untuk mempertahankan aktivitas protein
dengan cara mengurangi proteolisis dan denaturasi, (2) kuantitas; pemakaian akhir dari
protein mumi akan menentukan kuantitas enzim yang diperlukan, (3) ekonomis yang
merupakan kunci penting bila akan dipakai dalam industri, atau diterapkan dalam skala
laboratorium.
Pemekatan Enzim
Pemekatan protein enzim merupakan tahap awal dari prosedur pemumian enzim
sebelum tahap pemumian berikutnya atau dapat pula digunakan untuk keperluan
analisis enzim (Hanis 1989).
Pemekatan protein dapat dilakukan dengan dua metode,
yaitu analitik dan preparatif (penyiapan). Metode analitik menggunakan pengendapan
asam (misalnya asam trikloroasetat), pengendapan organik (misalnya aseton atau
etanol), dan imunopresipitasi dapat menyebabkan denaturasi protein. Berbeda dengan
metode analitik, metode preparatif tetap mempertahankan aktivitas protein. Pemekatan
protein dengan metode preparatif misalnya dengan menggunakan pengendapan dengan
1
garam, pengendapan dengan pelarut organik, pengendapan dengan polimer organik ,
ultrafiltrasi, liofilisasi, dan dialisis (Bollag & Edelstein 1991). Metode pengendapan
protein yang biasa dilakukan dalam pengendapan protease adalah menggunakan
garam amonium sulfat dan pelarut organik aseton.
Prinsip pengendapan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein yang
berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan daya
tolak menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein (pada pH dan suhu
tertentu) meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in). Kenaikan kelarutan
protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan garam dengan
konsentrasi tertentu kelarutan protein menurun (saking out). Molekul air yang berikatan
dengan ion-ion garam semakin banyak yang menyebabkan penarikan selubung air yang
mengelilingi permukaan protein. Peristiwa ini mengakibatkan protein sating berinteraksi,
beragregasi, dan kemudian mengendap (Hanis 1989; Scopes 1987). Amonium sulfat
merupakan garam yang paling sering digunakan untuk mengendapkan protein karena
memiliki daya larut tinggi di dalam air, relatif tidak mahal, dan kestabilan protein di dalam
larutan amonium sulfat (2M - 3M) tahan bertahun-tahun (Scopes 1987).
Pengendapan protein dengan menggunakan pelarut organik berdasarkan pada
pengurangan kelarutan protein dan
konstanta dielektrika pelarut. Semakin banyak
pelarut organik yang ditambahkan, semakin berkurang daya solvasi air dan muatan
pada permukaan molekul protein yang hidrofilik. Hal ini akan menjadikan molekulmolekul protein cenderung berinteraksi dengan sesamanya, hingga akhimya protein
mengendap. Prosedur pengendapan pelarut organik dilakukan pada suhu di bawah
O'C.
Pada suhu di atas
loOc,konformasi
protein akan segera berubah yang
memungkinkan molekul-molekul pelarut organik mendapatkan jalan masuk ke bagian
dalam struktur pfotein, kemudian akan merusak interaksi hidrofobik dan akhimya akan
terjadi denaturasi (Hartis 1989; Scopes 1987).
Pengendapan protein dengan polimer organik, misalnya yang paling banyak
menggunakan polietilen glikol (PEG), memiliki mekanisme yang hampir sama dengan
pengendapan pelarut organik, tetapi pada PEG hanya perlu konsentrasi yang lebih
rendah dari 20%. Berat molekul PEG yang digunakan berkisar 6000-20000.PEG adalah
polimer nonionik yang tidak larut.
Pengendapan enzim dengan PEG tidak
mempengaruhi tahap pemumian berikutnya, misalnya dengan kromatografi penukar ion
atau kromatografi afinitas (Hams 1989).
Garam yang berlebih yang terdapat di dalam larutan enzim setelah tahap
fraksinasi dapat dihilangkan dengan cara dialisis. Pada tahap dialisis, protein
ditempatkan di dalam kantung (membran) semipermeabel yang direndam di dalam
larutan bufer tertentu. Molekul yang berukuran kecil akan ke luar melalui membran, dan
molekul yang berukuran besar akan tertahan di dalam membran dialisis. Ukuran pori
kantung dialisis yang terbuat dari bahan selulosa asetat ini berdiameter 1-20 nm. Ukuran
ini menunjukkan berat molekul minimum yang dapat tertahan di dalam membran.
Selain dengan dialisis, penghilangan garam dapat dilakukan dengan filtrasi gel.
Metode ini biasanya diterapkan untuk sampel yang sedikit, yaitu tidak melampaui 2530% volume kolom untuk mendapatkan resdusi yang memadai antara protein dan
garam. Matriks filtrasi gel memiliki pori yang berukuran kecil , misalnya Sephadex G-25
buatan Pharmacia. Kekurangan metode ini adalah tejadi pengenceran sampel protein
(Harris 1989).
Kromatografi Kolom
Pemumian enzim protease yang biasa dilakukan adalah
menggunakan
kromatografi kolom. Ada beberapa cara kromatografi kolom, antara lain kromatografi
I
filtrasi gel, kromatografi penukar ion, kromatografi interaksi hidrofobik, kromatografi
afinitas, dan kromatografi cair berkinerja tinggi.
Kromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein dan makromolekul
biologi lain berdasarkan ukuran molekul. Matriks filtrasi gel berupa gel yang berpori yang
19
dikemas di dalam kolom dan dielusi dengan fase cair-mobil. Pori-pori matriks dapat
rnenampung molekul yang berukuran lebih kecil dan memisahkannya dari molekul yang
berberat molekul tinggi. Kromatografi filtrasi gel dapat digunakan pula untuk estimasi
berat molekul (Scopes 1987).
Kromatografi penukar ion memanfaatkan perbedaan afinitas antara molekul
berrnuatan di dalam larutan dengan senyawa yang tidak reaktii yang bermuatan
beriawanan sebagai pengisi kolom. Perrnukaan protein terdiri dari muatan positif dan
negatif tergantung dari rantai samping asam amino asam dan basa. pH protein dengan
jumlah muatan positif dan negatif sama disebut titik isoelektrik (pl). pl sebagian besar
protein di antara pH 5 dan 9. Protein yang memiliki pH di atas pl akan bermuatan
negatif, sedangkan pH di bawah pl bermuatan positii.
Pengejaan kromatografi penukar ion didahului dengan mengelusi protein enzim
dengan pH bufer awal yang telah diatur. Protein diharapkan terikat kuat pada kolom, dan
protein lain dibiarkan terelusi lebih dahulu. Protein yang terikat pada kolom dilepaskan
dengan cara mengubah pH bufer atau kekuatan ion pelarut. Matriks penukar ion
mengikat secara kovafen gugus fungsional yang bermuatan negatif pada penukar
kation, atau gugus fungsional yang bermuatan positif pada penukar anion. Matriks
berupa polimer elastis dan mengandung senyawa resin sintetik terbuat dari bahan
dekstran, selulosa, atau Sephadex Contoh matriks penukar kation dan anion masingmasing adalah karboksirnetil selulosa (CMC) dan dietilaminoetil (DEAE) selulosa
(Scopes 1987).
Kromatografi interaksi hidrofobik banyak digunakan untuk pemisahan protein dan
peptida.
Pada 'kekuatan ion yang tinggi protein terikat kuat pada matriks melalui
interaksi hidrofobik. Matriks bersifat nonpolar. Campuran protein dimasukkan ke dalam
kolom dengan bufer konsentrasi garam tinggi. Setelah protein yang tidak terikat keluar
lebih dulu, protein yang terikat dielusi dengan menggunakan eluen yang polaritasnya
diturunkan (konsentrasi garam lebih rendah) (O'Farrel 1998).
Pemisahan protein dengan kromatografi afinitas berdasarkan interaksi spesifik di
antara makromolekul biologi dengan pasangannya, sebagai contoh enzim dengan
substrat atau inhibitor, dan antibodi dengan antigen. Ligan akan terikat secara kovalen
pada matriks. Komponen protein yang memiliki afinitas spesifik terhadap ligan akan
diserap, dan komponen lainnya (protein kontaminan) yang tidak memiliki afmitas akan
terelusi lebih dulu. Komponen protein yang telah diserap dapat diiepaskan dengan
mengubah kondisi elusi, misalnya mengubah pH, menambahkan kofaMor atau substrat
(Jack 1998).
Kromatografi
cair berkinerja tinggi fase-balik (mersed-phase high performance
liquid chromatography) digunakan untuk isolasi, analisis, dan elusidasi struktur molekul
peptida dan protein. Mekanisme teknik kromatografi ini adalah protein akan terikat
berdasarkan karakter hidrofobiknya. lnteraksi hidrof&ik tejadi antara pelarut dengan
ligan hidrofobik di permukaan. Peningkatan muatan ion pelarut pada fase mobil akan
mengurangi kekuatan ikatan dan akhimya senyawa akan terelusi. Teknik kromatografi
ini banyak digunakan dalam bioteknologi untuk mengamati tingkat kemumian dan
stabilitas protein (Neville 1998).
Elektroforesis dan Zimogram
Elektroforesis didefinisikan sebagai perpindahan partikel-partikel bermuatan
karena pengaruh medan listrik.
Elektroforesis gel poliakrihmida sodium dodesil sulfat
(SDS-PAGE) merupakan teknik elektroforesis yang paling banyak digunakan untuk
analisis campuran protein. Mekanisme pada SDS-PAGE dijelaskan bahwa protein akan
bereaksi dengan SDS yang merupakan detergen anionik membentuk kompleks yang
bermuatan negatif.
Protein akan terdenaturasi dan terlarut membentuk kompleks
berikatan dengan SDS yang berbentuk elips atau batang yang ukurannya sebanding
dengan berat molekul protein. Protein dalam bentuk kompleks yang berrnuatan negatif
ini akan dapat terpisahkan bedasarkan muatan dan ukurannya secara elektroforesis di
dalam matriks gel poliakrilamida. Berat molekul protein dapat diukur dengan
menggunakan protein standar yang telah diketahui berat molekulnya dengan cara
membandingkan nilai mobilitas relatif (R9 (Smith 1984).
Elektroforesis gel native (nondenaturasi) memisahkan protein terlanrt yang tidak
mengendap atau beragregasi selama elektroforesis. Metode ini dapat pula diterapkan
untuk protein dengan kelarutan rendah,
seperti
protein rnernbran, dengan
menambahkan detergen nonionik, misalnya 0,5% Triton X-100 ke dalam gel.
Pada
elektroforesis gel yang terdenaturasi, seperti pada SDS-PAGE, molekul-molekul protein
yang telah terpisah dengan elektroforesis dapat kehilangan aktivitas biologi dan
biokimia, tetapi pada elektroforesis nondenaturasi aktivitas tersebut masih bertahan
(Dunn 1989).
Zimografi adalah teknik elektroforesis untuk menetapkan
aktivitas proteolitik.
Teknik ini telah banyak digunakan untuk rneneliti enzim matrix degmding ekstrseluler,
misalnya matrix metaloprotease (MMPs). Berbeda dengan SDS-PAGE,
gel pemisah
disisipi substrat protein (gelatin atau kasein) yang akan dihidrolisis oleh protease selama
masa inkubasi. Enzirn dipisahkan dalam gel denaturasi (SDS), namun dalam kondisi
tidak tereduksi. Penambahan detergen Triton X-100 akan melepaskan SDS dan kembali
terjadi pelipatan protein (renaturasi). Gel diwamai dengan Coomassie Blue, dan molekul
protein yang memiliki aktivitas proteolitik tampak sebagai pita bening. Metode zimografi
bersifat mudah, bnsitif, dan kuantitatif dalam menganalisis aktivitas proteolitik (Kleiner
& Stetler-Stevenson 1994; Leber & Balkwill 1997).
Peneliti yang melakukan pemumian protease terrnostabil tidak selalu melakukan
analisis elektroforesis (Tabel 5). Teknik pemumian yang dipilih tergantung tujuan yang
dikehendaki oleh setiap peneliti.
Data hasil elektroforesis dari beberapa protease
termostabil ditampilkan pada Tabel 6.
Tabel 5. Metode pemumian protease termostabil
Mikroorganisme
Jenis Protease
Thermoactinomyces sp. Alkalin
(Tsuchiya et a/. 1992)
8. steamthermophilus
(Razak et a/. 1994)
Campuran
B. steamthermophilus
(Kubo et a/. 1988)
Metaloprotease
netral
B. steamthemophilus
(Zamost et a/. 1990)
Metaloprotease
Metode Pemumian
- Kolom Butyl-Toyopearl
- Pengendapan amonium
sulfat
- Dialisis dan ultrafiltrasi
- Kolom SP-Toyopearl
- SDS-PAGE
- Pengendapan aseton
- Dialisis dan liofilisasi
- Ultrafiltrasi
- Pengendapan aseton
- Pengeringan beku
I - Ultrafiltrasi
- Kolom Sephadex
G-25
- Kolom DEAE-
Tingkat
Kemumian
Terakhir
10,6
Tidak
ditentukan
Tidak
ditentukan
619
Sephadex
- Pemekatan PEG 8000
Therrnus aquaticus
YT-1
(Matsuzawa et a/,
1988)
Serina alkalin
(Aqualisin)
Il - Dialisis
- Kolom Sephadex
G-75
- Pemekatan PEG
8000
- SDS-PAGE
3,o
- Pengendapan amonium
25,4
sulfat
- Kolom DEAE-selulosa
- Kolom CM-selulosa
(2x1
- Kolom CM-Sepharose
- SDS-PAGE
Tabel 6. Hasil analisis elektmforesis SDS-PAGE dan zimogram protease terrnostabil
-
Mikrooraanisme
Jenis Protease
SDS-PAGE
Thermoactinomyces sp.
(Tsuchiya et a/, 1992)
Alkalin
6. steamthermophilus
(Zamost et a/, 1990)
Metaloprotease
T. aquaticus YT- 1
(Matsuzawa et al. 1988)
Senna alkalin
(Aqualisin)
Thennococcus stetten
(Klingeberg et a/. 1995)
Senna alkalin
Thermus sp.
(Peek et al. 1992)
Alkalin
Zimogram
Pymcoccus furiosus
(Eggen et al. 1990)
Senna
Thermococcus celer
Netral
Staphylothermus marinus
Alkalin
Thermobacterioides
pmteolyticus
(Klingeberg et a/. 1991)
Alkalin
Jumlah Pita
Protein
Berat Molekul
(kDa)
I