PEMBERIAN EKSTRAK UMBI UBI JALAR UNGU
advertisement
TESIS PEMBERIAN EKSTRAK UMBI UBI JALAR UNGU (Ipomoea batatas) DENGAN KANDUNGAN ANTOSIANIN 7 MG TIDAK MENURUNKAN KADAR N-CARBOXYMETHYL-LYSINE PADA TIKUS WISTAR YANG DIBERI DIET TINGGI GLIKOTOKSIN YULLI AGNES AWUY PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2012 TESIS PEMBERIAN EKSTRAK UMBI UBI JALAR UNGU (Ipomoea batatas) DENGAN KANDUNGAN ANTOSIANIN 7 MG TIDAK MENURUNKAN KADAR N-CARBOXYMETHYL-LYSINE PADA TIKUS WISTAR YANG DIBERI DIET TINGGI GLIKOTOKSIN YULLI AGNES AWUY 0990761029 PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU KEDOKTERAN BIOMEDIK KEKHUSUSAN ANTIAGING UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2012 i PEMBERIAN EKSTRAK UMBI UBI JALAR UNGU (Ipomoea batatas) DENGAN KANDUNGAN ANTOSIANIN 7 MG TIDAK MENURUNKAN KADAR N-CARBOXYMETHYL-LYSINE PADA TIKUS WISTAR YANG DIBERI DIET TINGGI GLIKOTOKSIN Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister dalam Program Studi Ilmu Kedokteran Biomedik Kekhususan Antiaging pada Program Pascasarjana Universitas Udayana YULLI AGNES AWUY 0990761029 PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU KEDOKTERAN BIOMEDIK KEKHUSUSAN ANTIAGING PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2012 ii Lembar Pengesahan TESIS INI TELAH DISETUJUI TANGGAL : Pembimbing I Pembimbing II Prof. Dr. dr. Wimpie I Pangkahila, Sp.And.FAACS NIP : 194612131971071001 Prof. dr. N. Agus Bagiada, Sp.BIOK NIP : 1302464501 Mengetahui, Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran Biomedik Kekhususan Antiaging Program Pascasarjana Universitas Udayana Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. dr. Wimpie I Pangkahila, Sp.And.FAACS NIP : 194612131971071001 Prof. Dr. dr. A. A. Raka Sudewi, Sp.S (K) NIP : 195902151985102001 iii Tesis Ini Telah Diuji pada Tanggal : Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana No : Tanggal : Ketua : Anggota : Prof. Dr. dr. Wimpie I Pangkahila, Sp.And.FAACS 1. Prof. dr. N. Agus Bagiada, Sp.BIOK 2. Prof. Dr. dr. Alex Pangkahila, M.Sc., Sp. And 3. Prof. dr. I Gusti Made Aman, Sp. FK 4. Prof. dr. N. Tigeh Suryadhi, MPH, Ph.D iv UCAPAN TERIMAKASIH Dengan mengucapkan puji syukur kepada Tuhan yang Maha Kuasa, karena atas berkat dan karunianNya, tugas akhir dengan judul “PEMBERIAN EKSTRAK UMBI UBI JALAR UNGU (Ipomoea batatas) DENGAN KANDUNGAN ANTOSIANIN 7 MG TIDAK MENURUNKAN KADAR NCARBOXYMETHYL-LYSINE PADA TIKUS WISTAR YANG DIBERI DIET TINGGI GLIKOTOKSIN” ini dapat diselesaikan. Tulisan ini disusun untuk memenuhi persyaratan tugas akhir studi yang dijalani penulis untuk memperoleh gelar Magister pada Program Magister Ilmu Kedokteran Biomedik Kekhususan Antiaging Universitas Udayana. Dalam penyusunan tulisan ini, penulis mendapatkan banyak bimbingan dan masukan yang berharga dari berbagai pihak. Untuk itu Penulis menyampaikan rasa hormat dan mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Prof. Dr. dr. Wimpie I Pangkahila, Sp.And.FAACS sebagai Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran Biomedik Kekhususan Antiaging Universitas Udayana dan Pembimbing I, yang telah memberikan banyak masukan dan bimbingan kepada penulis selama penyusunan tesis ini. 2. Prof. dr. N. Agus Bagiada, Sp.BIOK sebagai Pembimbing II yang telah memberikan ide penelitian, masukan dan bimbingan kepada penulis selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan tesis ini. 3. Prof. Dr. dr. Alex Pangkahila, M.Sc., Sp. And sebagai penguji yang telah memberikan bimbingan dan masukan kepada penulis dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan tesis ini. v 4. Prof. dr. I Gusti Made Aman, Sp. FK sebagai penguji yang telah memberikan bimbingan dan bantuan dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan tesis. 5. Prof. dr. N. Tigeh Suryadhi, MPH, Ph.D sebagai penguji yang telah memberikan masukan dan bimbingan dalam penyusunan tesis ini. 6. Prof. Nyoman Mantik Astawa dari Laboratorium Virologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana yang telah memberikan masukan dan bantuan dalam proses pemeriksaan darah sampel. 7. Bapak Gede Wiranatha dari Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana yang telah sangat membantu dalam proses pelaksanaan penelitian. Juga kepada para dosen pengajar dan rekan-rekan yang tidak dapat disebutkan satu persatu, juga kepada orang tua yang selalu memberikan dorongan, penulis mengucapkan banyak terimakasih. Manusia tidak luput dari kesalahan, oleh karena itu penulis berharap dengan segala kekurangan dalam tulisan tugas akhir ini, tetap dapat memberikan manfaat bagi penulis pribadi, bagi Program Pendidikan Magister Ilmu Kedokteran Biomedik Kekhususan Antiaging Program Pascasarjana Universitas Udayana, serta bagi pihak-pihak lain yang berkepentingan. Akhir kata, semoga Tuhan yang Maha Kuasa senantiasa melimpahkan berkat kepada mereka semua. Denpasar, April 2012 Yulli Agnes Awuy vi ABSTRAK PEMBERIAN EKSTRAK UMBI UBI JALAR UNGU (Ipomoea batatas) DENGAN KANDUNGAN ANTOSIANIN 7 MG TIDAK MENURUNKAN KADAR N-CARBOXYMETHYL-LYSINE PADA TIKUS WISTAR YANG DIBERI DIET TINGGI GLIKOTOKSIN Diet tinggi glikotoksin dianggap sebagai salah satu faktor yang mempercepat proses penuaan. Kadar sirkulasi glikotoksin akan meningkat setelah asupan makanan kaya glikotoksin dan dapat terakumulasi di banyak jaringan tubuh. Efek buruk glikotoksin dapat terjadi secara langsung dengan menyebabkan perubahan struktur dan fungsi protein plasma dan matriks ekstraselular, glikosilasi nonenzimatik dan melalui reseptornya, RAGE, yang akan meningkatkan stres oksidatif dan reaksi inflamasi. Efek buruk glikotoksin dapat diatasi dengan diet rendah glikotoksin dan konsumsi bahan kaya polifenol, termasuk antosianin. Antosianin bekerja sebagai antioksidan, anti-inflamasi dan penghambat pembentukan AGEs (CML). Salah satu bahan makanan yang kaya antosianin adalah umbi ubi jalar ungu. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek ekstrak umbi ubi jalar ungu dalam menurunkan kadar N-carboxymethyl-lysine (CML) dalam serum tikus wistar yang diberi diet tinggi glikotoksin. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakologi Universitas Udayana, menggunakan Pretest-Posttest Control Group Design. Tiga puluh ekor tikus wistar diberi asupan diet tinggi glikotoksin secara tidak terbatas selama 4 minggu. Setelah 4 minggu, tikus dibagi menjadi 2 kelompok, kemudian dilakukan pemeriksaan kadar serum CML, yang menjadi data pre-test. Kedua kelompok tetap mendapat asupan diet tinggi glikotoksin. Kelompok Kontrol mendapatkan plasebo, sedangkan kelompok Perlakuan mendapatkan 2,4 ml ekstrak umbi ubi jalar ungu (antosianin 7 mg) selama 8 minggu. Setelah 8 minggu, dilakukan pemeriksaan kadar serum CML yang menjadi data post-test. Hasil analisis data kelompok Kontrol dengan paired samples test menunjukan bahwa terjadi peningkatan kadar serum CML secara bermakna, dari 220,67 ng/mL menjadi 347,27 ng/mL. Sedangkan analisis data kelompok Perlakuan dengan uji Wilcoxon menunjukan peningkatan kadar serum CML yang tidak bermakna, dari 249,87 ng/mL menjadi 256,80 ng/mL. Walaupun demikian, uji komparatif dengan Mann-Whitney menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan bermakna antara kadar serum CML kelompok Kontrol dan Perlakuan, sesudah pemberian ekstrak ubi jalar ungu (p>0,05). Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pemberian ekstrak ubi jalar ungu 2,4 ml (antosianin 7 mg) tidak menurunkan kadar serum CML dalam serum tikus wistar yang diberi diet tinggi glikotoksin. Hasil penelitian ini diharapkan dapat dipakai sebagai dasar penelitian lebih lanjut untuk mengetahui dosis optimal antosianin yang dapat mencegah peningkatan kadar serum CML dan pengaruh antosianin terhadap akumulasi AGEs di berbagai jaringan tubuh selain serum. Kata kunci : glikotoksin, N-carboksimetil-lisin, antosianin, ubi jalar ungu. vii ABSTRACT EXTRACT OF PURPLE SWEET POTATO TUBERS (Ipomoea batatas) CONTAINING 7 MG OF ANTHOCYANIN DOES NOT REDUCE N-CARBOXYMETHYL-LYSINE LEVEL IN WISTAR RATS INDUCED BY HIGH GLYCOTOXIN DIET High glycotoxin diet regarded as one of the factors that accelerate the aging process. Levels of glycotoxin in circulation will increase after the intake of foods rich in glycotoxin and can accumulate in many tissues of the body. The harmful effects of glycotoxin can occur directly by causing changes in the structure and function of proteins plasma and matrix extracellular, non-enzymatic glycoxylation and through its receptor, RAGE, which would increase oxidative stress and inflammatory reactions. This harmful effects of glycotoxin can be overcome with low glycotoxin diet and consumption of foods rich in polyphenols, including anthocyanins. Anthocyanin is an antioxidant, antiinflammatory and inhibitor of the formation of AGEs (CML). One common food that is rich in anthocyanins are purple sweet potato tuber. This study was conducted to determine the effect of purple sweet potato tuber extract in reducing serum levels of N-carboxymethyllysine in wistar rats fed with high glycotoxin diet. This study was conducted in Farmacology Laboratory of Udayana University, with Pretest-Posttest Control Group Design. Thirty wistar rats were given unlimited supply of high glycotoxin diet for 4 weeks. After 4 weeks, the rats were divided into 2 groups, then serum levels of CML were determined as pre-test data. Both groups continued to had unlimited supply of high glycotoxin diet. The control group received placebo, while the treatment group received 2.4 ml of purple sweet potato tuber extract (7 mg of anthocyanins) for 8 weeks. After 8 weeks, serum levels of CML were determined as the post-test data. Results of analysis with paired samples test demonstrated that the serum levels of CML in control group were significantly increased, from 220.67 ng / mL to 347.27 ng / mL. While the analysis result with Wilcoxon test showed that the serum levels of CML in treatment group were not significantly increased, from 249.87 ng / mL to 256.80 ng / mL. However, the comparative test with MannWhitney demonstrated that there was no significant difference of serum levels of CML between control and treatment group after the administration of purple sweet potato extract (p> 0.05). These results concluded that the administration of 2,4 ml of purple sweet potato extract (7 mg of anthocyanin) did not reduce the serum levels of CML in wistar rats fed with high glycotoxin diet. These results is expected to be useful as a basis for further research to determine the optimal dose of anthocyanin that can prevent the elevation of CML in serum and the effects of anthocyanin on the accumulation of AGEs in various body tissues other than serum. Key words: glycotoxin, N-carboxymethyl-lysine, anthocyanins, purple sweet potato. viii DAFTAR ISI SAMPUL DALAM………………………………………………………………...i PRASYARAT GELAR...........................................................................................ii LEMBAR PERSETUJUAN...................................................................................iii PENETAPAN PANITIA PENGUJI.......................................................................iv UCAPAN TERIMAKASIH.....................................................................................v ABSTRAK.............................................................................................................vii ABSTRACT..........................................................................................................viii DAFTAR ISI……………………………………………………………………...ix DAFTAR TABEL………………………………………………………………..xii DAFTAR GAMBAR……………………………………………………............xiii DAFTAR LAMPIRAN.........................................................................................xiv DAFTAR SINGKATAN.......................................................................................xv BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang……………………………………………………………...1 1.2 Rumusan Masalah………………………………………………………......7 1.3 Tujuan Penelitian………………………………………...............................7 1.4 Manfaat Penelitian......................................……….......................................7 BAB II KAJIAN PUSTAKA 2.1 Proses Penuaan...............................................................................................9 ix 2.2 2.3 Glikotoksin…………………………………………………….…..………10 2.2.1 Definisi dan Proses Pembentukan…………………….…………..10 2.2.2 N-Carboxymethyl-lysine………………………………………….14 2.2.3 Sumber Glikotoksin.....................................……….......................16 AGEs dan Penuaan………...........................................................................19 2.3.1 Mekanisme Biologis………………………………………………19 2.3.1.1 AGEs dan RAGE………………………………………....20 2.3.1.2 AGEs dan Stres Oksidatif...………………………………23 2.3.2 Pengaruh AGEs terhadap Sistem Organ…………………………....25 2.3.3 Bukti Epidemiologis………………………………………………...28 2.4 Terapi Anti-AGEs………………………………………………………....29 2.5 Antosianin……………………………………………………………........30 2.5.1 Struktur Kimia……………………………………………………..31 2.5.2 Efek Fisiologis…………………………………………………...32 2.5.3 Mekanisme Inhibisi dalam Formasi AGEs………………………33 2.5.4 Bioavailabilitas…………………………………………………...36 2.6 Vitamin B6…………………………………………………………...........37 2.7 Ubi Jalar Ungu………………………………………………………….....37 BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN 3.1 Kerangka Berpikir……………………………………................................41 3.2 Konsep……………………………………………………………………..43 3.3 Hipotesis Penelitian………………………………………………………..44 x BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian……………………………………………………...45 4.2 Tempat dan Waktu Penelitian…………………………………………......46 4.3 Populasi dan Sampel……………………………………………………....46 4.4 Variabel Penelitian………………………………………………………...48 4.5 Bahan dan Instrumen Penelitian…………………………………………...50 4.6 Prosedur Pembuatan Ekstrak Umbi Ubi Jalar Ungu……………………....50 4.7 Pemeliharaan & Perawatan Tikus Selama Penelitian..................................50 4.8 Prosedur Penelitian………………………………………………………...51 4.9 Analisis Data................................................................................................54 BAB V HASIL PENELITIAN...............................................................................55 BAB VI PEMBAHASAN......................................................................................59 BAB VII SIMPULAN DAN SARAN...................................................................63 DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………………....64 LAMPIRAN...........................................................................................................70 xi DAFTAR TABEL 2.1 Proses Selular dan Sitokin yang Teraktivasi oleh Interaksi AGE-RAGE……22 5.1 Kadar Serum CML Sebelum dan Sesudah Perlakuan………………………..55 5.2 Rerata Kadar Serum CML……………………………………………….......56 xii DAFTAR GAMBAR 2.1 Pembentukan Glikotoksin………………………..........…… ……………11 2.2 Struktur Kimia Carboxymethyl-lysine……………………………………14 2.3 Reaksi AGE-RAGE pada Tingkat Selular…………………………….....21 2.4 Stres Oksidatif – AGE – RAGE………………………………………….23 2.5 Model Konseptual Efek dari AGEs terhadap Beberapa Sistem Organ selama Penuaan………………………………………………………......27 2.6 Struktur 6 Jenis Antosianidin………………………………………….....31 2.7 Lokasi Hambatan Polifenol dalam Tahap Pembentukkan AGEs……......34 3.1 Bagan Kerangka Konsep…………………………………………………43 4.1 Skema Rancangan Penelitian…………………………………………….45 4.2 Hubungan Antar Variabel……..................................................................48 4.3 Alur Penelitian…………………………………………………………...53 5.1 Grafik Rerata Kadar Serum CML..............................................................56 xiii DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1 Analisis Deskriptif……………………………………………….70 Lampiran 2 Uji Normalitas……………………………………………………72 Lampiran 3 Uji Homogenitas…………………………………………………72 Lampiran 4 Paired Samples Test Kelompok Kontrol…………………………73 Lampiran 5 Uji Wilcoxon Kelompok Perlakuan……………………………...73 Lampiran 6 Uji Mann-Whitney…………………………………………….....74 xiv DAFTAR SINGKATAN AGEs = Advanced Glycation End Products CML = Carboxymethyl-lysine xv BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Proses penuaan akan dialami oleh semua makhluk hidup. Setelah mencapai usia dewasa, secara alamiah seluruh komponen tubuh tidak dapat berkembang lagi. Seiring dengan bertambahnya umur, tubuh manusia akan mengalami perubahan dari tingkat DNA dan fungsi sel sampai pada akhirnya akan menyebabkan penurunan fungsi organ dan sistem tubuh. Dikenal dua macam usia, yaitu usia kronologis dan usia fisiologis/biologis. Usia kronologis adalah usia sebenarnya sesuai dengan tahun kelahiran, sedangkan usia fisiologis adalah usia sesuai dengan fungsi organ tubuh. Usia kronologis tidak selalu sama dengan usia fisiologis. Usia fisiologis dapat menjadi lebih muda daripada usia kronologis, dapat dilihat pada orang yang penampilan dan fungsi tubuh lebih muda dari usia sebenarnya dan aktivitas sehari-hari tetap berkualitas baik. Sebaliknya, usia fisiologis seseorang dapat menjadi lebih tua daripada usia sebenarnya, yaitu pada orang yang penampilan, fungsi tubuh dan aktivitas seharihari berkurang kualitasnya (Pangkahila, 2007). Penuaan adalah suatu proses kompleks yang melibatkan banyak faktor yang saling mempengaruhi satu sama lain. Secara umum, penuaan disebabkan oleh faktor-faktor yang berasal dari dalam tubuh manusia sendiri dan faktor dari luar tubuh manusia. Faktor lingkungan dan gaya hidup mempunyai pengaruh yang besar dalam setiap tahap proses ini. 1 Faktor dari dalam tubuh manusia atau faktor internal termasuk radikal bebas, hormon yang berkurang, proses glikosilasi, metilasi, apoptosis dan sistem kekebalan yang menurun. Faktor eksternal yang utama adalah gaya hidup tidak sehat, diet yang tidak sehat, kebiasaan salah, polusi lingkungan, stress dan kemiskinan (Pangkahila, 2007). Interaksi faktor internal dan eksternal mempengaruhi munculnya karakteristik dari proses penuaan. Berbagai penelitian tentang ekspresi gen pada beberapa species dan jaringan secara konsisten menunjukkan bahwa penuaan berhubungan erat dengan gangguan fungsi mitokondria yang progresif, peningkatan stress oksidatif dan aktivasi sistem imun. Secara umum, semua proses ini dapat dipengaruhi oleh modifikasi dalam asupan nutrisi. Contohnya, diet rendah kalori dapat mengurangi stress oksidatif. Dengan demikian, perubahan kualitas makanan dan nutrisi dipercaya berefek positif terhadap kesehatan dan dapat memperlambat proses penuaan (Semba et al., 2010b). Glikotoksin adalah sekumpulan senyawa heterogen reaktif, yang dihasilkan oleh proses glikasi (Odetti dan Monacelli, 2008). Proses glikasi, yang disebut juga non-enzimatik glikosilasi, adalah suatu reaksi yang terjadi antara senyawa gula pereduksi, dengan suatu senyawa protein, lipid dan asam nukleat, yang menghasilkan senyawa yang berwarna kecoklatan dan berfluoresensi. Glikotoksin dikenal juga dengan sebutan Advanced Glycation End Products (AGEs) dan Advanced Lipoxidation End Products (ALEs). Sampai saat ini, telah ditemukan 20 jenis glikotoksin, tapi yang paling dikenal dan sering diteliti adalah beberapa produk intermediat seperti methylglyoxal dan glyoxal, dan beberapa produk akhir 2 seperti pentosidine, carboxymethyl-lysine (CML), hydroimidazolone dan glucosepane (Semba et al., 2010b). Tubuh manusia terpapar dengan 2 sumber utama glikotoksin. Sumber eksogen yaitu berasal dari makanan dan endogen yaitu glikotoksin yang terbentuk dalam tubuh. Kandungan glikotoksin yang tinggi ditemukan dalam jenis makanan yang diproses dalam suhu tinggi, seperti menggoreng dan memanggang (Semba et al., 2010b). Industri makanan yang melakukan proses persiapan makanan menggunakan temperatur tinggi seperti pasteurisasi produk susu, keju, sosis dan daging, juga sereal, meningkatkan produksi, paparan dan akumulasi glikotoksin dalam tubuh (Contreras dan Novakofski, 2010; Semba et al., 2010b). Jenis makanan yang menjadi sumber glikotoksin terbesar adalah produk makanan bersumber hewani yang tinggi protein dan lemak. Pembentukan glikotoksin baru dengan pemanasan, lebih mudah terjadi pada jenis makanan ini (Contreras dan Novakofski, 2010; Uribarri et al., 2010). Jenis makanan yang tinggi karbohidrat seperti sayuran, buah-buahan, dan biji-bijian, mengandung sedikit glikotoksin, bahkan setelah proses pemanasan (Uribarri et al., 2010). Konsumsi karbohidrat dianggap berisiko bila dikonsumsi dalam bentuk produk industri, refine sugar, dan high-fructose corn syrup yang tinggi konsentrasinya pada minuman ringan komersial (Semba et al., 2010b). Selain dari makanan, yang menjadi sumber eksogen paparan glikotoksin bagi tubuh manusia, glikotoksin juga terbentuk dalam tubuh manusia. Pembentukan glikotoksin secara endogen terjadi secara terus-menerus dalam tubuh manusia 3 pada keadaan normoglikemik dan proses penuaan alami, dan lebih diperberat pada keadaan hiperglikemi (Rahbar dan Figarola, 2003; Ramasamy et al., 2005; Semba et al., 2010b). Akumulasi glikotoksin dalam tubuh, yang bersumber eksogen maupun endogen, akan menyebabkan terjadinya stress oksidatif dan inflamasi kronik, yang pada akhirnya akan lebih meningkatkan pembentukan glikotoksin secara endogen. Selain melalui proses non-enzimatik glikosilasi, secara endogen glikotoksin juga terbentuk melalui jalur oto-oksidasi glukosa, peroksidasi lipid dan polyol pathway (Contreras dan Novakofski, 2010). Kadar glikotoksin yang tinggi dalam cairan dan jaringan tubuh sering dihubungkan dengan berbagai penyakit kronik, termasuk neurodegenerasi (Alzheimer), aterosklerosis dan rheumatoid arthritis (Ramasamy et al., 2005; Bengmark, 2007). AGEs bersifat irreversible dan akumulasinya menyebabkan perubahan struktur dan fungsi protein, menimbulkan stress oksidatif (Semba et al., 2010b) dan inflamasi sistemik kronik (Schmidt et al., 2001; Ramasamy et al., 2005) yang semuanya berperan penting dalam patofisiologi penuaan. Akibat buruk dari glikotoksin dapat dihindari dengan mencegah pembentukan glikotoksin, mencegah penumpukan AGEs di jaringan dan mengatasi reaksi inflamasi dan oksidatif stres yang ditimbulkan AGEs. Restriksi kalori, diet rendah glikotoksin, dan penggunaan bahan-bahan yang bekerja sebagai AGE inhibitor dan AGE breaker, dapat mencegah pembentukan dan penumpukan AGEs di jaringan tubuh (Bengmark, 2007; Semba et al., 2010b). 4 Beberapa bahan, seperti aminoguanidine, dapat mencegah terjadinya crosslinking dan merupakan AGE-inhibitor yang paling dikenal. Selain itu, konsumsi vitamin dan antioksidan dapat menginhibisi pembentukan AGEs/ALEs dan meredam efek buruk dari AGEs, termasuk vitamin C, vitamin E (Rahbar dan Figarola, 2003), thiamin, piridoksamin dan piridoksin (Yamagishi et al., 2008) dan bahan polifenol (Vauzour et al., 2010). Apalagi, saat ini functional food dan nutraceutical semakin dikenal dan diterima oleh masyarakat umum, karena saat ini banyak orang yang lebih memilih produk dan bahan makanan yang sehat dan alami (Shipp dan Abdel-Aal, 2010). Antosianin adalah suatu jenis polifenol grup flavonoid yang dikenal sebagai antioksidan. Antosianin adalah pigmen larut air, yang memberi warna merah, ungu dan biru pada banyak buah-buahan, sayuran dan bunga. Sebagai senyawa alami dari sayuran, buah-buahan dan anggur merah, antosianin sering dikonsumsi oleh banyak orang. Diperkirakan konsumsi harian antosianin di AS ≈ 12.5 mg/hari. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa selain sebagai antioksidan, antosianin juga mempunyai efek antidiabetik, anti-kanker dan anti-inflamasi (Wrolstad, 2001; Shipp dan Abdel-Aal, 2010). Mekanisme hambatan antosianin terhadap pembentukan glikotoksin terjadi melalui hambatan terhadap oto-oksidasi monosakarida (Rahbar dan Figarola, 2003), proses glikasi dan pengikatan glikotoksin dengan reseptornya (Vauzour et al., 2010), pencegahan lipid peroksidasi (Matsuda et al., 2002) dan inhibisi polyol pathway (Yawadio et al., 2007). Matsuda et al. (2003) dalam penelitiannya menemukan bahwa aktivitas hambatan antosianin dalam pembentukan AGEs 5 lebih kuat dibandingkan dengan aminoguanidin, dan aktivitas scavenging terhadap DPPH dan anion superoxide lebih kuat dibandingkan dengan α-tocopherol. Salah satu sumber antosianin yang mudah ditemukan di Indonesia adalah ubi jalar ungu, yang merupakan bahan makanan yang banyak ditemukan di Indonesia. Umbi ubi jalar ungu mengandung antosianin 110-210 mg per 100 gram basah (Jawi et al., 2008). Selain kaya akan antosianin, ubi jalar juga merupakan sumber piridoksin yang baik. Kandungan piridoksin dalam ubi jalar adalah 0,2 mg per 100 gram berat basah (USDA National Nutrient Database, 2010). Ketiga bentuk alami vitamin B6 (piridoksin, piridoksal, piridoksamin), diketahui mempunyai kemampuan untuk menginhibisi pembentukan glikotoksin, tapi yang paling kuat adalah piridoksamin. Piridoksin diketahui, secara moderat, mempunyai kemampuan untuk menghambat pembentukan glikotoksin (Kaufmann, 2011). Dengan mempertimbangkan efek antosianin sebagai AGEs inhibitor, antioksidan dan anti-inflamasi, timbul dugaan bahwa asupan harian ekstrak sirup umbi ubi jalar ungu dapat mencegah pembentukan AGEs dan meredam reaksi inflamasi yang ditimbulkan oleh penumpukan AGEs di jaringan tubuh. CML (carboxymethyl-lysine) adalah jenis AGEs yang paling sering diteliti. CML sering dipakai sebagai petanda pembentukkan AGEs in vivo dan kerusakan protein jangka panjang, karena CML adalah jenis AGEs yang paling banyak ditemukan in vivo (Contreras dan Novakofski, 2010) dan paling dikenal karakterisasinya (Ferreira et al., 2003; Goldberg et al., 2004). CML dapat 6 dihasilkan dari protein dan lipid glikosidasi (Goldin et al., 2006; Uribarri et al., 2010). Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui apakah asupan harian ekstrak umbi ubi jalar ungu dapat menurunkan kadar N-carboxymethyl-lysine (CML) pada serum tikus wistar yang diberi diet tinggi glikotoksin. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang penelitian yang diuraikan di atas, maka dirumuskan masalah penelitian ini sebagai berikut : Apakah asupan 2,4 ml ekstrak umbi ubi jalar ungu (antosianin 7 mg) selama 8 minggu dapat menurunkan kadar serum N-carboxymethyl-lysine pada tikus wistar yang diberi diet tinggi glikotoksin? 1.3 Tujuan Penelitian Untuk mengetahui efek pemberian ekstrak umbi ubi jalar ungu 2.4 ml (antosianin 7 mg) selama 8 minggu dalam menurunkan kadar N-carboxymethyllysine dalam serum tikus wistar yang diberi diet tinggi glikotoksin. 1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1 Manfaat Keilmuan Dapat memberikan pengetahuan dan pemahaman tentang mekanisme efek hambatan ekstrak umbi ubi jalar ungu terhadap pembentukan N-carboxymethyllysine. 7 1.4.2 Manfaat Praktis Memberikan pengetahuan bagi masyarakat tentang nilai nutrisi dari bahan makanan, dan manfaatnya untuk mencegah terjadinya kelainan dan penyakit kronis, serta memperlambat penuaan. 8 BAB II KAJIAN PUSTAKA 2.1 Proses Penuaan Banyak teori yang menjelaskan mengapa manusia mengalami proses penuaan. Secara mendasar teori-teori ini dapat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu teori wear and tear dan teori program. Teori wear and tear meliputi kerusakan DNA, proses glikosilasi dan radikal bebas. Teori program meliputi terbatasnya replika sel, proses imun dan teori neuroendokrin (Pangkahila, 2007). Penuaan adalah suatu proses kompleks yang melibatkan banyak faktor yang saling mempengaruhi satu sama lain. Secara umum, penuaan disebabkan oleh faktor-faktor yang berasal dari dalam tubuh manusia sendiri dan faktor dari luar tubuh manusia. Faktor lingkungan dan gaya hidup mempunyai pengaruh yang besar dalam setiap tahap proses ini. Faktor dari dalam tubuh manusia atau faktor internal termasuk radikal bebas, hormon yang berkurang, proses glikosilasi, metilasi, apoptosis dan sistem kekebalan yang menurun. Faktor eksternal yang utama adalah gaya hidup tidak sehat, diet yang tidak sehat, kebiasaan salah, polusi lingkungan, stress dan kemiskinan (Pangkahila, 2007). Interaksi faktor internal dan eksternal mempengaruhi munculnya karakteristik dari proses penuaan. Berbagai penelitian tentang ekspresi gen pada beberapa species dan jaringan secara konsisten menunjukkan bahwa penuaan berhubungan erat dengan gangguan fungsi mitokondria yang progresif, peningkatan stress oksidatif dan aktivasi sistem imun. Secara umum, semua proses ini dapat 9 dipengaruhi oleh modifikasi dalam asupan nutrisi. Contohnya, diet rendah kalori dapat mengurangi stress oksidatif. Dengan demikian, perubahan kualitas makanan dan nutrisi dipercaya berefek positif terhadap kesehatan dan dapat memperlambat proses penuaan (Semba et al., 2010b). 2.2 Glikotoksin 2.2.1 Definisi dan Proses Pembentukan Glikotoksin adalah sekumpulan senyawa heterogen yang reaktif dan tidak stabil, yang dihasilkan oleh proses glikasi non-enzimatik, yang dapat membentuk ikatan silang kovalen intramolekul dan intermolekul, dan menghasilkan produk akhir yang irreversible, disebut Advanced Glycation End Products (AGEs) dan Advanced Lipoxidation End Products (ALEs) (Odetti dan Monacelli, 2008). Reaksi glikasi non-enzimatik, yang juga dikenal dengan Maillard reaction, terjadi dalam 3 fase (Gambar 2.1). Fase pertama adalah suatu reaksi non-enzimatik spontan, antara gugus karbonil gula pereduksi (glukosa atau fruktosa) dengan gugus amino bebas (terutama lisin dan arginin) dari suatu protein, lipid dan asam nukleat yang menghasilkan basa Schiff. Basa Schiff adalah senyawa yang memiliki suatu karbon yang berikatan ganda dengan nitrogen, dan nitrogen tersebut tidak terhubung dengan hidrogen. Terjadinya reaksi fase pertama tergantung pada konsentrasi glukosa dan berlangsung selama beberapa jam. Jika konsentrasi glukosa berkurang, reaksi ini bersifat sementara (Contreras dan Novakofski, 2010). 10 Gambar 2.1 Pembentukan Glikotoksin (Contreras dan Novakofski, 2010) Selama fase kedua, basa Shiff mengalami pengaturan secara kimia yang berlangsung selama beberapa hari, dan membentuk produk Amadori, disebut juga produk glikasi awal. Produk Amadori adalah senyawa yang lebih stabil, tapi reaksi ini juga masih bersifat sementara (Contreras dan Novakofski, 2010). Produk Amadori dikenal juga sebagai fruktosamin atau ketoamin (Semba et al., 2010b). Fase ketiga berlangsung jika terjadi akumulasi dari produk Amadori, yang akan mengalami beberapa proses kimia yang kompleks (yaitu oksidasi, reduksi dan hidrasi), menghasilkan protein termodifikasi karena adanya ikatan silang. Proses ini berlangsung selama beberapa minggu sampai beberapa bulan, dan 11 bersifat menetap. Produk akhir ini berwarna kecoklatan dan beberapa diantaranya dapat befluoresensi, disebut AGEs (Contreras dan Novakofski, 2010). Keadaan mikro-internal dan half-life dari suatu protein atau lipid, akan menentukan jumlah dan tahap modifikasi glikotoksin yang terjadi, bervariasi dari produk intermediat yang reaktif sampai produk akhir AGEs yang irreversible (Rahbar dan Figarola, 2003). Selain melalui reaksi Maillard, ada beberapa jalur lain yang menghasilkan glikotoksin. Contohnya, otooksidasi glukosa dan peroksidasi lipid menjadi senyawa dikarbonil, yang terjadi karena meningkatnya stress oksidatif (Uribarri dan Tuttle, 2006; Contreras dan Novakofski, 2010). Mekanisme lain adalah melalui polyol pathway, dimana glukosa diubah menjadi sorbitol oleh enzim aldose reduktase, dan kemudian menjadi fruktosa oleh sorbitol dehidrogenase. Metabolit fruktosa, fruktosa-3-fosfat, kemudian diubah menjadi senyawa dikarbonil (Gambar 2.1) (Contreras dan Novakofski, 2010; Ramasamy et al., 2005). Konsentrasi tinggi intraselular dan ekstraselular dari reaktif karbohidrat, seperti glukosa dan terutama fruktosa, berperan penting dalam peningkatan proses glikasi dan pembentukan senyawa α-dikarbonil (α-oksaldehida) (Bengmark, 2007). Jadi, setidaknya ada 3 jalur pembentukan glikotoksin, yaitu reaksi Maillard, oksidasi glukosa dan peroksidasi lipid, dan jalur polyol. Jalur pembentukan yang bervariasi menyebabkan struktur kimia glikotoksin sangat bervariasi. Jenis glikotoksin yang paling dikenal adalah carboxymethyl-lysine (CML), pentosidine, pyrraline, dan methylglyoxal (Contreras dan Novakofski, 2010). 12 Suatu tahap penting dalam proses glikasi adalah pembentukan produk intermediat yang reaktif melalui oksidasi glukosa, reaksi basa Schiff dengan gugus amino dan dari produk Amadori, yang terjadi dalam semua tahap dan jalur proses glikasi. Senyawa intermediat reaktif ini dikenal sebagai senyawa αdikarbonil (α-oksaloaldehida), termasuk glyoxal, methylglyoxal dan 3- deoxyglucosone, yang merupakan senyawa prekursor. Senyawa prekursor tersebut kemudian akan mengalami oksidasi dan reaksi silang membentuk produk glikasi lanjut yang berwarna kecoklatan dan berfluoresensi. Senyawa α-dikarbonil ini juga dapat membentuk ikatan silang dengan gugus amina bebas suatu protein dan membentuk basa Schiff yang baru (Rahbar dan Figarola, 2003; Meerwaldt et al., 2008). 3-deoxyglucosone (3-DG) terbentuk dari produk Amadori melalui proses nonoksidatif rearrangement dan hidrolisis. Selain itu juga dari fruktosa-3-fosfat yang merupakan produk intermediat dari jalur polyol. 3-DG dengan cepat akan bereaksi dengan senyawa amino membentuk AGEs seperti imidazolone, pyrraline dan carboxymethyl-lysine (CML) (Rahbar dan Figarola, 2003). Methylglyoxal (MGO) dihasilkan melalui jalur non-enzimatik, dari dekomposisi spontan triose fosfat, oto-oksidasi karbohidrat dan degradasi glukosa, dan beberapa jalur metabolik lain seperti reaksi Maillard dan peroksidasi lipid. MGO memodifikasi residu arginin untuk membentuk imidazolone, memodifikasi residu lisin untuk membentuk carboxyethyl-lysine (CEL), dan modifikasi imidazolium cross-link untuk membentuk methylglyoxal-lysine dimer (MOLD). 13 MGO diproduksi oleh sel-sel yang memetabolisme glukosa (Rahbar dan Figarola, 2003). Pembentukkan AGEs merupakan bagian dari metabolisme normal, tapi akan bersifat pathogen bila level akumulasi AGEs di sirkulasi dan jaringan berlebihan (Uribarri et al., 2010). Pada keadaan normal, sangat sedikit senyawa α-dikarbonil dan fruktosamine yang berlanjut membentuk AGEs, karena adanya jalur metabolik alternatif utama bagi prekursor AGEs ini. Pembentukan AGEs akan meningkat bila konsentrasi senyawa dikarbonil dan fruktosamin meningkat. Keadaan ini terjadi akibat peningkatan kecepatan pembentukan dan/atau berkurangnya kecepatan metabolisme senyawa dikarbonil dan fruktosamin. Keadaan hiperglikemia, akumulasi triose-fosfat dan senyawa keton, peroksidasi lipid dan stress oksidatif dapat meningkatkan kecepatan pembentukan AGE (Rahbar dan Figarola, 2003). 2.2.2 N-Carboxymethyl-lysine (CML) Gambar 2.2 Struktur Kimia Carboxymethyl-lysine 14 CML dan methylglyoxal adalah yang paling sering diteliti. CML sering dipakai sebagai petanda pembentukkan AGEs in vivo dan kerusakan protein jangka panjang, karena CML adalah jenis AGEs yang paling banyak ditemukan in vivo (Contreras dan Novakofski, 2010) dan paling dikenal karakterisasinya (Ferreira et al., 2003; Goldberg et al., 2004). CML dapat dihasilkan dari protein dan lipid glikosidasi (Goldin et al., 2006; Uribarri et al., 2010). Secara in vivo, CML dapat terbentuk melalui beberapa mekanisme, yang dapat terjadi secara bersamaan. Pertama, melalui jalur klasik glikoksidasi. Kedua, melalui prekursornya glyoxal (Ferreira et al., 2003). Glyoxal (GO), adalah senyawa dikarbonil yang merupakan prekursor CML. Glyoxal terbentuk melalui beberapa reaksi, yaitu fragmentasi oksidatif basa Schiff (Namiki pathway), degradasi dan oto-oksidasi glukosa yang dikatalisa oleh ion metal, peroksidasi lipid dan fragmentasi fruktosa-fosfat (Ferreira et al., 2003). Hasil penelitian terbaru menemukan bahwa GO juga dihasilkan dari oksidasi glukosa melalui peroksinitrit (ONOO-) (Rahbar dan Figarola, 2003). GO kemudian akan bereaksi dengan lisin dan arginin dari suatu protein, yang pada keadaan fisiologis dapat menghasilkan beberapa AGEs seperti CML, pentosidine, glyoxal-lysine-dimer (GOLD), GOLA dan non-fluoresensi AGE lainnya (Rahbar dan Figarola, 2003; Goldin et al., 2006). 15 2.2.3 Sumber Glikotoksin Tubuh manusia terpapar dengan 2 sumber utama glikotoksin. Sumber eksogen yaitu berasal dari makanan dan endogen yaitu glikotoksin yang terbentuk dalam tubuh. Pembentukkan glikotoksin secara endogen terjadi secara terus-menerus dalam tubuh manusia pada proses penuaan alami, akibat paparan protein berumur panjang dengan glukosa, bahkan pada keadaan normoglikemik. Keadaan ini akan lebih diperberat pada keadaan hiperglikemi (Rahbar dan Figarola, 2003; Ramasamy et al., 2005; Semba et al., 2010b). Karena selain melalui reaksi Maillard, ada beberapa jalur lain yang menghasilkan glikotoksin yaitu oksidasi glukosa dan peroksidasi lipid, dan jalur polyol (Contreras dan Novakofski, 2010). Glikotoksin Eksogen Glikotoksin terbentuk saat makanan diproses dalam suhu tinggi, seperti menggoreng dan memanggang (broiling, roasting, grilling). Industri makanan yang sebenarnya bertujuan untuk membuat makanan lebih aman, lebih enak dan bervariasi, dengan melakukan pemanasan, iradiasi dan ionisasi sangat besar peranannya dalam produksi, paparan dan akumulasi AGEs/ALEs dalam tubuh (Contreras dan Novakofski, 2010; Semba et al., 2010b). Pembentukan glikotoksin dalam makanan adalah proses kompleks yang melibatkan beberapa reaksi dan produk akhir. Jenis glikotoksin yang terbentuk dalam makanan sangat heterogen, dan baru beberapa jenis yang dikarakterisasi, diantaranya furfurals, pyrralines dan senyawa dikarbonil seperti methylglyoxal. 16 Tapi, CML adalah senyawa pertama yang dikenal dan paling sering digunakan sebagai petanda glikotoksin dalam makanan (Contreras dan Novakofski, 2010). Kadar glikotoksin yang terbentuk dipengaruhi oleh kandungan nutrient, protein atau lemak vs karbohidrat, suhu yang digunakan saat persiapan bahan makanan, waktu paparan saat memasak dan kelembaban (Goldberg et al., 2004; Contreras dan Novakofski, 2010). Kecepatan pembentukan glikotoksin akan meningkat bila waktu paparan dan suhu yang digunakan dalam memproses makanan ditingkatkan (Contreras dan Novakofski, 2010). Dengan pemanasan, kandungan AGEs dalam suatu makanan bisa meningkat 10-100x lipat (Uribarri et al., 2010). Broiling (225oC) dan frying (180oC) menghasilkan glikotoksin tertinggi, diikuti oleh roasting (177oC) dan boiling (100oC) (Goldberg et al., 2004). Secara umum, makanan yang dimakan mentah, dimasak dengan suhu rendah atau dengan kelembaban tinggi (water based) seperti merebus dan mengukus, memiliki kandungan glikotoksin yang rendah (Goldberg et al., 2004; Semba et al., 2010b). Kandungan glikotoksin dalam makanan tergantung pada komposisi nutrisinya. Makanan bersumber hewani yang tinggi protein dan lemak, seperti produk susu dan daging, mengandung kadar glikotoksin yang paling tinggi, dan paling mudah terjadi pembentukan glikotoksin baru dengan pemanasan (Contreras dan Novakofski, 2010; Uribarri et al., 2010). Sebaliknya, jenis makanan yang tinggi karbohidrat seperti sayuran, buah-buahan, dan biji-bijian, mengandung sedikit glikotoksin, bahkan setelah proses pemanasan (Goldberg et al., 2004; Uribarri et al., 2010). Buah-buahan yang kaya fruktosa dapat menjadi sumber 17 akumulasi AGEs/ALEs karena fruktosa sangat reaktif terhadap protein. Walaupun demikian, konsumsi karbohidrat terutama berisiko bila dikonsumsi dalam bentuk produk industri komersial misalnya sereal, makanan ringan, refined sugar dan high fructose corn syrup yang tinggi konsentrasinya pada minuman ringan komersial (Bengmark, 2007; Semba et al., 2010b). Konsentrasi tinggi dari methylglyoxal ditemukan pada minuman ringan komersial yang tinggi kandungan high fructose corn syrup-nya. Bahkan, susu formula bayi mengandung AGEs yang tinggi, kandungan CML susu formula bayi kira-kira 70x lebih tinggi dibandingkan susu ibu (Semba et al., 2010b). Berbagai jenis makanan yang tinggi kandungan glikotoksinnya termasuk sereal, kue kering, cakes, daging dan unggas; condiment termasuk sirup maple, kecap, brown rice vinegar; minuman termasuk soda, teh, kopi, classic coke, diet coke dan berbagai minuman ringan komersial lainnya (Bengmark, 2007; Uribarri et al., 2010). Setelah dikonsumsi, ≈ 10% bahan glikotoksin akan diserap ke sirkulasi, 2/3 akan tetap berada dalam tubuh, dan hanya 1/3 bagian yang diekskresi melalui ginjal. Glikotoksin yang tidak diekskresi akan bereaksi dengan sel dan jaringan, bersifat aktif dan menimbulkan efek patologis seperti layaknya glikotoksin endogen (Negrean, 2006; Odetti dan Monacelli, 2008; Contreras dan Novakofski, 2010). Bahkan akumulasi glikotoksin dari sumber eksogen dapat melebihi glikotoksin yang bersumber endogen (Peppa et al., 2003; Kandarakis et al., 2007). Seperti halnya glikotoksin endogen, glikotoksin eksogen juga merupakan ligan bagi RAGE dan akan mengaktivasi jalur-jalur signal transduksi utama. 18 Glikotoksin bersumber diet, bersama dengan glikotoksin endogen, dapat meningkatkan beban glikosidan sistemik, stress oksidatif dan aktivasi sel, yang meningkatkan kerentanan jaringan terhadap gangguan / kerusakan (Negrean et al., 2007; Contreras dan Novakofski, 2010). Peranan glikotoksin bersumber diet dalam kadar total AGEs dalam tubuh telah terbukti dengan beberapa penelitian pada binatang dan manusia, terutama dengan CML dan MGO, yang menunjukkan bahwa kadar glikotoksin dalam sirkulasi akan meningkat setelah asupan makanan kaya glikotoksin, dengan atau tanpa diabetes dan penyakit ginjal (Peppa et al., 2008; Contreras dan Novakofski, 2010). Korelasi yang kuat antara konsumsi makanan yang tinggi glikotoksin dengan induksi petanda-petanda inflamasi dan stress oksidatif telah terbukti dalam penelitian pada manusia (Vlassara et al., 2002; Contreras dan Novakofski, 2010; Uribarri et al., 2010). Penelitian lain menunjukan bahwa diet rendah AGEs menghasilkan 30-40% penurunan dalam kadar serum AGEs, berkurangnya akumulasi AGEs di jaringan, penurunan ekspresi reseptor AGEs, sel-sel inflamasi dan faktor-faktor proaterosklerotik (Negrean et al., 2007; Odetti dan Monacelli, 2008; Peppa et al., 2008). 2.3 AGEs dan Penuaan 2.3.1 Mekanisme Biologis Penelitian menunjukkan bahwa AGEs, endogen maupun eksogen, bersifat merusak. Efek biologis AGEs terjadi melalui 2 mekanisme yang berbeda. Pertama adalah reaksi yang tidak tergantung reseptor, yaitu secara langsung menyebabkan 19 perubahan struktur dan fungsi protein plasma dan matriks ekstraselular. Kedua adalah melalui reseptor yang disebut RAGE, yang akan meningkatkan stres oksidatif dan reaksi inflamasi (Contreras dan Novakofski, 2010; Semba et al., 2010b). AGEs/ALEs dapat memodifikasi kolagen dan protein lain dengan membentuk ikatan silang. Protein yang berumur panjang, seperti protein matriks ekstraselular dan membran basal pembuluh darah, paling rentan terhadap modifikasi AGEs. Penelitian telah menunjukkan bahwa penuaan manusia berhubungan dengan kekakuan jaringan yang kaya matriks ekstraselular dan protein berumur panjang, seperti otot rangka, tendon, sendi, tulang, jantung, arteri, paru, kulit, lensa mata dan myelin saraf. Pembentukan ikatan silang ini akan mengganggu kapasitas mekanik dari jaringan-jaringan ini (Bengmark, 2007; Semba et al., 2010b). 2.3.1.1 AGEs dan RAGE AGEs meningkatkan stres oksidatif dan reaksi inflamasi melalui ikatan dengan AGEs reseptor, yang disebut Reseptor-AGE (RAGE). RAGE adalah suatu molekul immunoglobulin pada permukaan sel yang merupakan multiligand reseptor, yang ditemukan pada banyak jaringan tubuh. RAGE paling banyak ditemukan di jantung, paru dan otot rangka. Jalur signal RAGE dapat diaktivasi oleh banyak ligand proinflamasi, termasuk CML (Schmidt et al., 2001; Ramasamy et al., 2005; Semba et al., 2010b). Interaksi AGE dengan RAGE akan menyebabkan aktivasi jalur mitogenactivated protein kinases (MAPKs) dan phosphatidylinositol-3 kinase (PI3-K), 20 yang kemudian akan mengaktivasi faktor transkripsi nuclear factor kappa B (NFKB). Setelah aktivasi, NFKB bergerak ke nucleus dan mengaktifkan transkripsi gen-gen untuk sitokin-sitokin, faktor-faktor pertumbuhan dan molekulmolekul adhesif, seperti TNF-α, IL-6 dan VCAM1. Aktivasi NFKB akan meningkatkan ekspresi RAGE, yang selanjutnya akan merangsang siklus yang meningkatkan produksi faktor-faktor pencetus inflamasi, sehingga terjadi inflamasi berkepanjangan (Gambar 2.3) (Contreras dan Novakofski, 2010; Semba et al., 2010b; Schmidt et al., 2001). Tabel 2.1 menunjukkan proses-proses selular dan sitokin-sitokin yang teraktivasi dengan adanya interaksi AGE-RAGE (Bengmark, 2007). Gambar 2.3 Reaksi AGE-RAGE pada tingkat selular (Contreras dan Novakofski, 2010) 21 Tabel 2.1 Proses Selular dan Sitokin yang Teraktivasi oleh Interaksi AGE-RAGE Interaksi AGE-RAGE juga akan mengaktivasi NADPH oksidase, suatu kompleks enzim yang menghasilkan superoksida. Peningkatan aktivitas kompleks enzim ini akan meningkatkan stress oksidatif intraselular. Peningkatan stress oksidatif oleh NADPH oksidase selanjutnya juga akan mengaktifkan NFKB (Gambar 2.4) (Ramasamy et al., 2005; Contreras dan Novakofski, 2010; Semba et al., 2010b). Ekspresi RAGE pada jaringan normal adalah rendah, dan akan meningkat pada tempat-tempat dimana ada akumulasi ligand. Ekspresi RAGE yang berkepanjangan oleh sel-sel otot polos, endothelium, sel-sel mononuklear, dan sel- 22 sel lain yang berada disekitar ligand, mengakibatkan aktivasi kronik inflamasi, disfungsi selular berkepanjangan, kerusakan jaringan dan pada akhirnya penyakit (Schmidt et al., 2001b; Semba et al., 2010b). 2.3.1.2 AGEs dan Stres Oksidatif Proses glikasi, dari tahap awal sampai ke tahap lanjut, merupakan salah satu sumber utama ROS (reactive oxygen species). Protein yang terglikasi akan menghasilkan radikal bebas 50x lebih banyak daripada protein yang tidak terglikasi (Bengmark, 2007). Stress oksidatif, reaksi antara AGEs dan RAGE, akan membentuk suatu lingkaran yang tak berujung pangkal (Gambar 2.4) (Ramasamy et al., 2005). Gambar 2.4 Stres oksidatif – AGE – RAGE 23 Adanya stress oksidatif, rangsangan inflamasi, trauma fisik dan hiperglikemia (intermiten dan menetap) akan mempercepat pembentukan AGEs. Pada penuaan, selain terjadi peningkatan produksi AGEs, terjadi penurunan kemampuan tubuh untuk detoksifikasi AGEs, sehingga terjadi akumulasi AGEs di jaringan tubuh. Akumulasi AGEs akan meningkatkan ekspresi RAGE dan menarik sel-sel inflamasi seperti PMNs, makrofag dan limfosit. Sel-sel inflamasi ini yang normalnya bekerja untuk mekanisme homeostatik tubuh, misalnya untuk menghilangkan sumber infeksi atau jaringan nekrosis, akan melepaskan senyawasenyawa proinflamasi yang akan mengaktifkan jalur inflamasi baru. Reaksi senyawa proinflamasi ini dengan RAGE akan menghasilkan ROS lebih lanjut, dan ROS tersebut akan mencetus pembentukkan AGEs, inflamasi dan lebih banyak ROS, yang pada akhirnya akan menyebabkan disfungsi jaringan dan kerusakan menetap (Ramasamy et al., 2005). ROS juga akan bereaksi dengan struktur biomolekular sel dan jaringan, yang akan menyebabkan disfungsi dan kerusakan. Contohnya, deposit AGE di dinding arteri akan menghasilkan radikal bebas yang dapat mengoksidasi lipid dinding pembuluh darah dan mempercepat atherogenesis (Rahbar dan Figarola, 2003; Ramasamy et al., 2005). Selain melalui interaksi dengan RAGE, AGE juga dapat meningkatkan produksi ROS melalui beberapa mekanisme lain seperti penurunan aktivitas superoxide dismutase (SOD) dan katalase, penurunan simpanan gluthation dan aktivasi Protein Kinase C (Ramasamy et al., 2005). 24 Katalase dan SOD adalah enzim antioksidan. Penurunan aktivitas katalase dan SOD terjadi karena proses glikasi, dimana reaksi glukosa dengan enzimenzim ini akan menyebabkan gangguan sruktur dan fungsi enzim, yang menyebabkan akumulasi radikal peroksida dan superoksida (Jiang et al., 2004). Pembentukan senyawa α-dikarbonil, yang merupakan produk glikasi intermediate, yang dihasilkan dari jalur oksidatif (glikoksidatif) dan non-oksidatif proses glikasi, kemudian menjadi sumber radikal bebas selanjutnya. Saat senyawa α-dikarbonil membentuk ikatan silang dengan gugus amina bebas dari protein, terjadi donasi elektron ke senyawa α-dikarbonil, yang menghasilkan radikal kation dan anion. Oksigen kemudian dapat menerima elektron dari radikal anion, menghasilkan radikal anion superoksida, yang akan memulai reaksi rantai yang merusak struktur sel dan jaringan (Rahbar dan Figarola, 2003). 2.3.2 Pengaruh AGEs terhadap Sistem Organ Kadar serum AGEs ditentukan oleh produksi endogen, asupan eksogen dan eliminasi oleh ginjal dan sistem enzim, yang akan menentukan peningkatan dan penurunan yang bersifat sementara dari kadar serum AGEs. Beberapa enzim, seperti glyoxalase I, II dan carbonyl reductase, dan reseptor AGER1, berfungsi dalam sistem detoksifikasi dan pengaturan balik untuk mengatasi efek pro-oksidan dari glikasi. Kemudian, sistem ekskresi ginjal akan mengeliminasi produksi AGEs yang berlebihan pada keadaan fisiologis. Beberapa peneliti mengatakan bahwa dalam proses penuaan dan beberapa keadaan patologis, terjadi gangguan pada keadaan seimbang ini. Ketidakseimbangan ini terjadi karena peningkatan produksi 25 endogen, atau peningkatan asupan eksogen, yang dengan adanya gangguan dalam sistem ekskresi ginjal, menyebabkan akumulasi AGEs yang sering ditemukan pada populasi lanjut usia (Contreras dan Novakofski, 2010). Faktor-faktor yang berperan penting dalam pembentukkan AGEs adalah kecepatan turn-over protein untuk glikosidasi, derajat hiperglikemia dan keadaan stress oksidatif. Adanya salah satu atau lebih dari faktor-faktor ini akan menyebabkan glikasi dan oksidasi protein ekstraselular dan intraselular (Goldin et al., 2006). AGEs/ALEs dapat terakumulasi di banyak jaringan tubuh, dan saat terakumulasi akan meningkatkan reaksi inflamasi, memperlemah sistem imun, meningkatkan kemungkinan infeksi, menurunkan mekanisme pertahanan antioksidan, mengganggu mekanisme perbaikan DNA dan meningkatkan akumulasi berbagai toksin. Bila dibandingkan dengan individu sehat, kadar AGEs/ALEs pada individu dengan risiko atau menderita penyakit kronik, sangat meningkat (Bengmark, 2007). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa akumulasi AGEs, yaitu CML, CEL, MGO, pentosidine dan beberapa jenis lain, ditemukan di jaringan yang mengalami penuaan (Ramasamy et al., 2005). Akumulasi protein yang disfungsional, insoluble dan indigestible (AGEs/ALEs) terutama terjadi pada jaringan berumur panjang seperti kolagen, myelin saraf dan lensa. Akumulasi ini akan menyebabkan berkurangnya elastisitas jaringan tubuh yang kaya kolagen, yang dianggap menjadi penyebab peningkatan kekakuan lensa, sendi, otot rangka dan dinding pembuluh darah, seiring dengan bertambahnya usia. Deposit protein yang disfungsi dalam jaringan, bila 26 berlebihan, akan menyebabkan akumulasi perubahan histologi yang disebut amiloid, yang merupakan ciri umum dari berbagai penyakit kronik. (Bengmark, 2007). Gambar 2.5 menunjukkan pengaruh AGEs terhadap berbagai sistem organ (Semba et al., 2010b). Gambar 2.5 Model konseptual efek dari AGEs terhadap beberapa sistem organ selama penuaan. 27 Beberapa kelainan lain yang dipengaruhi oleh akumulasi AGEs/ALEs adalah penyakit alergi dan otoimun, penyakit neurodegenerasi lain (Parkinson, ALS, stroke), penyakit keganasan, diabetes, kelainan endokrin, gastrointestinal, paru, urogenital dan kulit (Bengmark, 2007). Dengan demikian lebih jelas lagi bahwa dalam proses penuaan terjadi akumulasi AGEs/ALEs yang perlahan-lahan tapi kontinyu, termasuk pada orang yang sehat, tapi akan meningkat dan dipercepat pada individu yang berisiko atau sudah menderita penyakit kronik (Bengmark, 2007). 2.3.3 Bukti Epidemiologis Kadar AGEs/ALES yang tinggi dalam cairan dan jaringan tubuh sering dihubungkan dengan berbagai penyakit kronik, termasuk neurodegenerasi (Alzheimer), aterosklerosis dan rheumatoid arthritis (Ramasamy et al., 2005; Bengmark, 2007). Kadar AGEs/ALEs pada individu dengan risiko atau manifestasi penyakit-penyakit kronik, bila dibandingkan dengan individu sehat, meningkat secara bermakna. Walaupun demikian, terdapat perbedaan pola dan jenis AGEs/ALEs dalam jaringan dan sirkulasi, diantara kelompok penderita penyakit kronik yang berbeda (Bengmark, 2007). Beberapa studi epidemiologi menunjukkan bahwa orang lanjut usia dengan peningkatan CML dalam sirkulasi, mempunyai risiko lebih besar untuk mengalami kekakuan arteri (Semba et al., 2009e), penyakit ginjal kronik (Semba et al., 2009a, 2009d), anemia (Semba et al., 2008, 2009c), penurunan kekuatan 28 otot skeletal (Dalal et al., 2009), penurunan performa fisik (Semba et al., 2010a) dan mortalitas pada penyakit kardiovaskular (Semba et al., 2009b). Beberapa penelitian imunohistokimia menggunakan antibody anti-AGE menunjukkan adanya protein yang termodifikasi dengan AGE pada beberapa jaringan tubuh dalam keadaan patologis, termasuk ginjal penderita diabetik nefropati, gagal ginjal kronik, lesi aterosklerosis pada dinding arteri dan fibroid amyloid pada amyloidosis karena hemodialisis. Hal ini menunjukkan peranan potensial AGE dalam pathogenesis penyakit dan kelainan akibat penuaan (Rahbar dan Figarola, 2003). Berdasarkan data diatas, dapat disimpulkan bahwa akumulasi AGEs mempercepat penurunan fungsi multisistem yang terjadi dalam proses penuaan. 2.4 Terapi Anti – AGEs Akibat buruk dari AGEs/ALEs dapat dihindari dengan mencegah penumpukan AGEs di jaringan dan mengatasi reaksi inflamasi dan oksidatif stress yang ditimbulkan oleh AGEs. Restriksi kalori, diet rendah glikotoksin, dan penggunaan bahan-bahan yang bekerja sebagai AGE inhibitor dan AGE breaker, dapat mencegah pembentukan dan penumpukkan AGEs di jaringan tubuh (Bengmark, 2007; Semba et al., 2010b). Aminoguanidine adalah AGE-inhibitor yang pertama dan paling dikenal. Aminoguanidine menghambat gugus karbonil reaktif dari gula pereduksi dan sebagai scavenger senyawa intermediat 29 α-dikarbonil. Aminoguanidine juga mencegah terjadinya cross-linking, tapi aktivitas hambatannya terhadap pembentukan AGE post-Amadori hanya sedikit (Rahbar dan Figarola, 2003). Konsumsi vitamin dan antioksidan juga dapat menginhibisi pembentukan AGEs/ALEs dan meredam efek buruk dari AGEs, termasuk vitamin C, vitamin E (Rahbar dan Figarola, 2003), thiamin, piridoksamin dan piridoksine (Yamagishi et al., 2008) dan bahan polifenol (Vauzour et al., 2010). Apalagi saat ini, functional food dan nutraceutical semakin dikenal dan diterima oleh masyarakat umum, karena saat ini banyak orang yang lebih memilih produk dan makanan yang sehat dan alami (Shipp dan Abdel-Aal, 2010). Penelitian in vitro dan in vivo, menunjukkan bahwa konsumsi antioksidan dapat mengurangi proses glikasi protein dan meredam efek buruk dari AGEs. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa efek inhibisi antioksidan dalam pembentukan AGE terutama karena efek pencegahan terhadap jalur oto-oksidasi (Rahbar dan Figarola, 2003). Salah satu sumber antioksidan yang paling dikenal adalah polifenol, yang merupakan suatu bahan fitokimia. Studi epidemiologi menunjukkan bahwa konsumsi polifenol, terutama kelompok flavonoid, dapat menurunkan risiko penyakit-penyakit kronik, termasuk keganasan, penyakit kardiovaskular dan neurodegenerasi (Spormann et al., 2008; Vauzour et al., 2010). 2.5 Antosianin Antosianin adalah suatu jenis polifenol grup flavonoid yang paling banyak ditemukan pada buah-buahan dan sayuran. Antosianin adalah pigmen yang dapat 30 larut dalam air, memberi warna merah, ungu dan biru pada banyak buah-buahan, sayuran, bunga dan biji-bijian (Wang dan Stoner, 2008). 2.5.1 Struktur Kimia Antosianin adalah derivatif polihidroksi atau polimetoksi dari 2- fenilbenzopirilium yang terglikosilasi, mengandung 2 cincin benzoyl (A dan B) yang dipisahkan oleh cincin heterosilik (C) (Gambar 2.6). Dengan kata lain, antosianin adalah senyawa antosianidin dan glukosa dalam asam organik. Ada 6 jenis antosinidin yang ditemukan dalam tanaman, yaitu cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin, peonidin dan petunidin (Shipp dan Abdel-Aal, 2010). Gambar 2.6 Struktur 6 jenis antosianidin, dalam bentuk glukosida dengan glukosa. 31 Bentuk glikosida dari 3 non-metilasi antosianidin (cyanidin, delphinidin, pelargonidin) adalah yang paling banyak ditemukan, kira-kira 80% pada daundaunan berwarna, 69% pada buah-buahan dan 50% pada bunga. Mereka biasanya berikatan dengan senyawa sakarida seperti glukosa, galaktosa, rhamnosa atau arabinosa, dalam bentuk 3-glikosida atau 3,5-diglikosida. Perbedaan warna antara antosianin biasanya karena perbedaan pola cincin B antosianidin, pola glukosilasi dan derajat esterifikasi glukosa dengan asam alifatik atau aromatik, dan pH, suhu, jenis pelarut dan adanya pigmen penyerta (Shipp dan Abdel-Aal, 2010). 2.5.2 Efek Fisiologis Antosianin paling dikenal sebagai antioksidan. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa selain sebagai antioksidan, antosianin juga mempunyai efek anti-inflamasi, efek anti-diabetik, anti-kanker, dan dapat memperbaiki profil lipid darah dan memiliki efek vasoprotektif (Wrolstad, 2001; Shipp dan Abdel-Aal, 2010). Struktur fenolik antosianin bertanggung jawab dalam efek antioksidan-nya, yaitu gugus hidroksil pada posisi 3 dari cincin C dan posisi 3’, 4’, 5’ dari cincin B. Sebagai antioksidan, antosianin bekerja sebagai scavenger ROS seperti superoksid (O2- ), singlet oksigen (‘O2), peroksida (ROO-), hidrogen peroksida (H2O2) dan radikal hidroksil (OH.) (Wang dan Stoner, 2008). Mekanisme efek antosianin sebagai anti-inflamasi memang belum diketahui, tapi suatu penelitian in vitro menunjukkan bahwa administrasi antosianin dapat menurunkan aktivasi faktor transkripsi NFKB dan menurunkan ekspresi beberapa 32 sitokin dan mediator proinflamasi (Karlsen et al., 2007). Suatu penelitian epidemiologi menunjukkan penurunan insidens penyakit-penyakit inflamasi pada populasi yang mengkonsumsi makanan kaya polifenol (Spormann et al., 2008), dan konsumsi antosianin menunjukkan berkurangnya risiko penyakit kardiovaskular, diabetes, arthritis dan keganasan (Wang dan Stoner, 2008). 2.5.3 Mekanisme Inhibisi dalam Formasi AGEs Antosianin adalah salah satu jenis polifenol yang dapat mencegah pembentukan AGEs. Gambar 2.7 menunjukkan tahap-tahap dalam proses pembentukan AGEs dimana polifenol dapat bekerja sebagai inhibitor (*), termasuk oto-oksidasi monosakarida, oksidasi produk Amadori menjadi senyawa dikarbonil, pengikatan AGEs dengan RAGE dan sebagai scavenger senyawa dikarbonil dan radikal bebas (Vauzour et al., 2010). 33 Gambar 2.7 Tanda (*) menunjukkan lokasi hambatan polifenol dalam tahap pembentukkan AGEs, yaitu oto-oksidasi monosakarida, oksidasi produk Amadori menjadi senyawa dikarbonil, pengikatan AGEs dengan RAGE dan sebagai scavenger senyawa dikarbonil dan radikal bebas. 34 Matsuda et al. (2003) dalam penelitiannya menjelaskan bahwa fenolic antioksidan selain sebagai scavenger radikal bebas, juga berfungsi sebagai AGE inhibitor. Struktur flavonoid yang dibutuhkan dalam aktivitas inhibisinya terhadap pembentukan AGEs, yaitu : 1) Bila jumlah gugus hidroksil (-OH) pada posisi 3’-, 4’-, 5’- dan 7bertambah, aktivitas inhibisi makin kuat. 2) Aktivitas flavon lebih kuat dibandingkan flavonol, flavanon dan isoflavon. 3) Metilasi atau glukosilasi pada gugus 4’-hidroksil dari flavon, flavonol dan flavanon, akan menurunkan aktivitas inhibisi. 4) Metilasi atau glikosilasi pada gugus 3’-hidroksil dari flavonol, cenderung meningkatkan aktivitas inhibisi. 5) Glikosilasi dari gugus 7-hidroksil dari flavon dan isoflavon, menurunkan aktivitas inhibisi. 6) Aktivitas inhibisi antosianin lebih kuat dibandingkan flavonol glikosida yang lain. Disebutkan juga bahwa flavonoid dengan aktivitas inhibisi terhadap AGEs yang kuat, memiliki aktivitas antioksidan yang kuat. Dalam penelitian yang sama, Matsuda et al (2003) menemukan bahwa aktivitas hambatan antosianin dalam pembentukan AGEs lebih kuat dibandingkan dengan aminoguanidin, dan aktivitas scavenging terhadap radikal DPPH dan anion superoxide lebih kuat dibandingkan dengan α-tocopherol. Antosianin juga dapat menghambat pembentukan AGEs/ALEs melalui hambatan terhadap lipid peroksidasi yang terjadi karena adanya oksidatif stress 35 (Wang dan Stoner, 2008; Shipp dan Abdel-Aal, 2010) dan sebagai inhibitor aldose reduktase yang merupakan enzim utama dalam polyol pathway (Matsuda et al., 2002; Yawadio et al., 2007). 2.5.4 Bioavailabilitas Antosianin diabsorpsi dalam bentuk glikosida yang intak, didistribusi dalam sistem sirkulasi dan diekskresi di urine (Kano et al., 2005; Shipp dan Abdel-Aal, 2010). Absorpsi antosianin terjadi segera setelah konsumsi, konsentrasi plasma maksimal dicapai dalam waktu 15 – 60 menit. Jumlah antosianin yang diserap tergantung dari jenis antosianin yang dikonsumsi (Shipp dan Abdel-Aal, 2010). Ekskresi antosianin terjadi lengkap dalam waktu 6 – 8 jam. Hanya sebagian kecil dari antosianin yang dikonsumsi, kurang dari 0,1%, terdeteksi di urine, yang menimbulkan dugaan bahwa sebagian besar antosianin yang dikonsumsi diabsorpsi di saluran pencernaan, terutama di lambung dan usus halus, dan di distribusikan ke sistem sirkulasi (Shipp dan Abdel-Aal, 2010). Antosianin sangat mungkin mengalami perubahan bentuk dan dimetabolisme menjadi bentuk dengan sruktur kimia alternative, seperti glukoronida dan metil, dan / atau bentuk asam fenolik serupa dan aldehida. Hal ini terbukti dengan ditemukannya beberapa antosianin dengan struktur molekul yang berbeda dan beberapa metabolitnya secara in vitro dan dalam saluran cerna (Shipp dan AbdelAal, 2010). 36 2.6 Vitamin B6 Salah satu bahan alami yang bekerja sebagai AGE inhibitor adalah vitamin B6. Vitamin B6 ditemukan dalam 3 bentuk alami, yaitu piridoksin, piridoksal dan piridoksamine. Sumber piridoksine adalah bahan makanan nabati, sedangkan piridoksal dan piridoksamin ditemukan dalam bahan makanan hewani. Ketiga bentuk alami vitamin B6 (piridoksin, piridoksal, piridoksamin), diketahui mempunyai kemampuan untuk menginhibisi pembentukan glikotoksin, tapi yang paling kuat adalah piridoksamin. Piridoksin diketahui, secara moderat, mempunyai kemampuan untuk menghambat pembentukan glikotoksin (Kaufmann, 2011). Piridoksamin, bentuk natural dari vitamin B6, efektif menginhibisi pembentukan AGEs pada beberapa tahap yang berbeda. Piridoksamin mencegah degradasi protein-intermediat Amadori menjadi protein-AGEs melalui pengikatan redox metal ions (Voziyan et al., 2003), menghambat lipid peroksidasi (Onorato et al., 2000) dan sebagai scavenger senyawa karbonil hasil degradasi glukosa dan lipid (Voziyan et al., 2002; Goldin et al., 2006). 2.7 Ubi Jalar Ungu (Ipomoea batatas) Ubi jalar (Ipomoea batatas) termasuk dalam family Convolvulaceae (suku kangkung-kangkungan). Varietas ubi jalar ditemukan dalam beberapa warna kulit dan daging umbi. Ubi jalar putih dan kuning-oranye adalah yang paling umum, dan ada juga jenis yang berwarna ungu gelap (CGIAR, 2004; Plantamor, 2008). 37 Ubi jalar ungu adalah bahan makanan yang banyak ditemukan di Indonesia. Ubi jalar ungu dapat menjadi pilihan makanan yang sehat, memiliki warna merahungu yang menarik, tinggi kandungan antosianin, fenolik total dan aktivitas antioksidannya (Truong et al., 2010). Kandungan fenolik ubi jalar ungu adalah 261,4 – 712,8 mg per 100 g berat kering, lebih tinggi daripada kandungan fenolik pada ubi jalar kuning, wortel dan wortel ungu (Truong et al., 2010). Jenis dan jumlah antosianin dalam ubi jalar ungu bervariasi tergantung varietasnya. Secara umum, jenis antosianin utama dalam ubi jalar ungu adalah peonidin, cyanidin dan pelargonidin. Kandungan total antosianin pada varietas The Stokes Purple dan NC415 yang memiliki warna ungu gelap adalah 33,7 – 96,8 per 100 gr berat kering, sedangkan varietas Okinawa hanya 10 – 21,1 mg per 100 gr berat kering. Kandungan antosianin ubi jalar ungu lebih rendah daripada black currant (kismis) dan blueberries (322 – 476 mg per 100 gr berat kering), tapi sebanding dengan buah anggur (27 – 120 mg per 100 gr berat kering), buah plum (19 – 124 mg per 100 gr berat kering), buah ceri (122 mg per 100 mg berat kering), raspberries (92 mg per 100 mg berat kering), terong (86 mg per 100 gr berat kering) dan red radishes (100 mg per 100 gr berat kering). Hasil ini menunjukkan bahwa ubi jalar ungu berada pada pertengahan spektrum buahbuahan dan sayuran yang tinggi antosianin (Truong et al., 2010). Penelitian lain menunjukkan bahwa umbi ubi jalar ungu mengandung antosianin 110-210 mg per 100 gram basah (Jawi et al., 2008). 38 Antosianin dari ubi jalar ungu bersifat stabil dan tidak dipengaruhi oleh radiasi ultraviolet (Kano et al, 2005), resisten terhadap perubahan pH dan temperature (Harada et al., 2004). Pengupasan, pengukusan (steam cooking) atau pembekuan tidak berpengaruh terhadap kandungan total fenolik dan antosianin ubi jalar ungu. Tapi penghancuran umbi dalam suhu ruangan akan menurunkan kadar total fenolik dan antosianin-nya. Hal ini disebabkan karena degradasi polifenol oleh enzim antosianase, polifenol oksidase dan peroksidase. Enzimenzim ini sangat aktif pada suhu ruangan dan terdegradasi pada suhu > 70o C. Oleh karena itu, sebaiknya umbi dibekukan atau dikukus terlebih dahulu, sebelum dihancurkan (Truong et al., 2010). Setelah asupan minuman ubi jalar ungu, dua jenis antosianin yaitu cyanidine dan peonidine, terdeteksi di darah tikus dan manusia, kemudian secara cepat diekskresi melalui urine (Harada et al., 2004). Absorptivitas antosianin rendah bila dibandingkan dengan flavonoid lain, dan kadar antosianin ubi jalar ungu yang diekskresi melalui urine sangat rendah (0,01% pada manusia dan 0,11% pada tikus), walaupun demikian aktivitas radical-scavenging di urine meningkat setelah konsumsi minuman ubi jalar ungu ((Kano et al., 2005). Hal ini menunjukkan walaupun absorbabilitas-nya rendah, antosianin ubi jalar ungu mampu menimbulkan efek fisiologis dalam tubuh. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ekstrak umbi ubi jalar ungu yang kaya antosianin, selain sebagai antioksidan yang kuat, juga memiliki aktivitas anti-mutagenik, dapat menurunkan tekanan darah dan mengurangi cedera liver pada tikus (Truong et al., 2010). 39 Antosianin dari ubi jalar ungu memiliki aktivitas scavenging radikal DPPH (1,1-dyphenyl-2-picrylhydrazy l) lebih kuat dibandingkan antosianin dari kol merah, kulit buah anggur, buah murbei atau jagung ungu, bahkan lebih kuat dibandingkan asam askorbat, dan secara in vitro mencegah oksidasi LDL (Kano et al., 2005). Penelitian pada manusia menunjukkan bahwa asupan minuman dari ubi jalar ungu yang mengandung antosianin 400 mg per hari mempunyai efek proteksi liver terhadap oksidatif stress (Suda et al., 2008). Pemberian ekstrak ubi jalar ungu dengan dosis antosianin 2,7 mg per 100 gram berat badan, dapat mengurangi cedera liver pada tikus (Kano et al., 2005) dan pemberian sirup ubi jalar ungu yang mengandung antosianin 0,07 mg dapat menurunkan kadar MDA pada darah dan hati mencit (20 gr) (Jawi et al., 2008). Selain kaya akan antosianin, ubi jalar juga merupakan sumber piridoksin yang baik. Kandungan piridoksin dalam ubi jalar adalah 0,2 mg per 100 gram berat basah (USDA National Nutrient Database, 2010). Beberapa tahun terakhir ini, kultivar ubi jalar ungu semakin dikembangkan di banyak negara untuk memenuhi kebutuhan terhadap makanan yang sehat. Yang paling menonjol adalah kultivar Ayamurasaki dan Yamagawamurasaki di Jepang yang banyak digunakan dalam produk komersial sebagai pewarna makanan alami, sari buah, roti, mie, selai dan minuman terfermentasi (Truong et al., 2010). Bahkan di Bali, ekstrak umbi ubi jalar ungu sudah dikembangkan menjadi produk minuman berupa sirup dan wine. 40 BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN 3.1 Kerangka Berpikir Akumulasi glikotoksin yang irreversible dalam sistem organ bersifat merusak karena dapat secara langsung merusak struktur dan fungsi jaringan tubuh, dan juga menyebabkan stres oksidatif dan inflamasi kronik. Adanya stres oksidatif dan inflamasi kronik akan lebih meningkatkan pembentukan dan akumulasi glikotoksin, sehingga menimbulkan suatu proses yang tak berujung pangkal. Proses ini pada akhirnya akan menyebabkan gangguan fungsi jaringan dan sistem organ yang permanen, timbulnya berbagai penyakit degeneratif, yang mempercepat proses penuaan dan penurunan kualitas hidup. Paparan terhadap glikotoksin terjadi setiap hari dan sukar dihindari. Sumber makanan yang kaya glikotoksin terutama adalah jenis makanan yang gurih dan enak, tinggi protein dan lemak, yang dipersiapkan dengan cara menggoreng atau memanggang. Selain itu, sumber glikotoksin juga berasal dari berbagai jenis makanan cepat saji dan produk industri komersial. Akibat buruk dari glikotoksin dapat dihindari dengan menggunakan bahanbahan alami yang mempunyai efek sebagai penghambat pembentukan glikotoksin, antioksidan dan antiinflamasi. Banyak jurnal ilmiah yang melaporkan efek antosianin sebagai antioksidan, dan beberapa jurnal ilmiah melaporkan efek antosianin sebagai penghambat tahap awal proses glikasi dan sebagai antiinflamasi. 41 Salah satu bahan makanan yang kaya antosianin dan mudah ditemukan di Indonesia adalah ubi jalar ungu. Ubi jalar ungu juga tinggi kandungan fenolik total dan aktivitas antioksidannya. Selain itu, ubi jalar ungu merupakan sumber piridoksin yang baik, yang diketahui secara moderat mempunyai kemampuan untuk menghambat pembentukan glikotoksin. Dengan mempertimbangkan hal-hal tersebut di atas, ekstrak umbi ubi jalar ungu dapat menjadi alternatif yang sehat dan menyenangkan untuk mencegah peningkatan kadar serum & penumpukan N-carboxymethyl-lysine di jaringan, mengatasi stres oksidatif dan inflamasi kronik. 42 3.2 Konsep Ekstrak umbi ubi jalar ungu Faktor Endogen : Metabolisme normal & penuaan. Hiperglikemi. Stress oksidatif Faktor Eksogen : Diet tinggi glikotoksin TIKUS N-carboxymethyl-lysine Gambar 3.1 Bagan Kerangka Konsep 43 3.3 Hipotesis Penelitian Pemberian ekstrak umbi ubi jalar ungu, dengan antosianin 7 mg, menurunkan kadar serum N-carboxymethyl-lysine pada tikus wistar yang diberi diet tinggi glikotoksin. 44 BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan studi eksperimental dengan menggunakan PretestPosttest Control Group Design (Pocock, 2008). Tikus dibagi menjadi 2 kelompok penelitian. 1. Kelompok pertama merupakan kelompok kontrol (P0), yang diberikan placebo, yaitu akuades. 2. Kelompok kedua adalah kelompok perlakuan (P1), yang diberikan ekstrak umbi ubi jalar ungu 2,4 ml (antosianin 7 mg). P0 O1 Populasi O2 Sampel P1 O3 O4 Gambar 4.1 Skema Rancangan Penelitian P0 P1 O1 O2 O3 O4 : Kelompok Kontrol (diet tinggi glikotoksin + akuades). : Kelompok Perlakuan (diet tinggi glikotoksin + 2,4 ml ekstrak ubi jalar ungu). : Pretest kadar CML kelompok Kontrol. : Posttest kadar CML kelompok Kontrol. : Pretest kadar CML kelompok Perlakuan. : Postetst kadar CML kelompok Perlakuan. 45 4.2 Tempat dan Waktu Penelitian - Proses pemeliharaan tikus, pemberian diet tinggi glikotoksin dan ekstrak ubi jalar ungu dilakukan di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, selama 8 minggu. - Pemeriksaan kadar CML serum tikus dilakukan di Laboratorium Virologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana. - Pembuatan ekstrak ubi jalar ungu dan pemeriksaan kadar antosianin dilakukan di Laboratorium Fakultas Pertanian Universitas Udayana. 4.3 Populasi dan Sampel 4.3.1 Populasi Penelitian Tikus putih jenis Wistar (albino rat) berumur 4 – 5 bulan, berat 160 – 170 gram. 4.3.2 Kriteria Subjek Kriteria penerimaan : 1. Tikus putih jenis Wistar yang telah diberi diet tinggi glikotoksin selama 4 minggu. 2. Umur 4 – 5 bulan. 3. Berat tikus 160 – 170 gram . Kriteria drop-out : 1. Tikus mati saat penelitian berlangsung. 46 4.3.3 Besaran Sampel Besar sampel ditentukan dengan menggunakan rumus Pocock (2008). Besar sampel tiap kelompok minimal adalah : 2σ2 n= (µ2 – µ1)2 x f(αβ) n = jumlah sampel σ = simpangan baku (SD) α = tingkat kesalahan I (ditetapkan 0,05) tingkat kemaknaan (1 – α) = 0,95 β = f(αβ) = tingkat kesalahan II (ditetapkan 0,1) nilai pada tabel µ1 = rerata sebelum perlakuan µ2 = rerata setelah perlakuan Pemberian minuman dari ubi jalar ungu yang mengandung antosianin 400 mg per hari, pada orang dewasa dengan borderline hepatitis, menurunkan level serum GGT dari 103,6 ± 17,3 IU/L menjadi 82,7 IU/L pada minggu ke-8 (Suda et al., 2008). Dengan demikian, maka diperoleh : 2 x 17,32 n= (82,7 – 103,6)2 X 10,5 = 15 Berdasarkan rumus diatas, jumlah sampel tiap kelompok minimal adalah 15 ekor. 47 4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Klasifikasi Variabel a. Variabel bebas : diet tinggi glikotoksin. b. Variabel tergantung : kadar CML (ng/ml). c. Variabel kendali : ekstrak umbi ubi jalar ungu 2,4 ml (antosianin 7 mg). 4.4.2 Hubungan Antar Variabel Variabel Bebas Variabel Tergantung Diet tinggi glikotoksin CML Variabel Kendali Ekstrak umbi ubi jalar ungu Gambar 4.2 Hubungan Antar Variabel 4.4.3 Definisi Operasional Variabel a. Ekstrak umbi ubi jalar ungu adalah bahan alamiah yang diambil dari umbi ubi jalar ungu yang dimurnikan dan dilarutkan dalam akuades, diberikan 2,4 ml (antosianin 7 mg) per tikus. 48 Pemberian minuman dari ubi jalar ungu yang mengandung antosianin 400 mg per hari, pada orang dewasa dengan borderline hepatitis, menurunkan level serum GGT dari 103,6 ± 17,3 IU/L menjadi 82,7 IU/L pada minggu ke-8 (Suda et al., 2008). Dosis antosianin 400 mg pada manusia dewasa ini, dikonversi berdasarkan tabel konversi perhitungan dosis, menjadi 7 mg pada tikus wistar dewasa. b. Kadar CML adalah kadar carboxymethyl-lysine dalam serum darah (ng/ml), diukur sebelum dan sesudah perlakuan, dengan metode ELISA, menggunakan OxiSelect N-CML ELISA kit produksi Cell Biolabs Inc. c. Jenis makanan sampel adalah makanan yang tinggi glikotoksin, yaitu makanan standar (protein 20-25%, lemak 5%, pati 45-50%, serat kasar 5%), yang dipanaskan/disangrai (160-170oC) selama 20 menit. Kadar CML dalam makanan standard yang dipanaskan pada suhu 100oC selama 20 detik adalah 1,3 ± 0,4 mg CML/100 gram (diet rendah AGEs), sedangkan yang dipanaskan pada suhu 125oC selama 30 menit adalah 76 ± 15,3 mg/100 gram (diet tinggi AGEs). Kadar serum AGEs dari kelompok tikus yang mendapatkan diet rendah AGEs adalah 4,35±0,3 U/mL, sedangkan kelompok yang mendapatkan diet tinggi AGEs adalah 9,88±1,07 U/mL (Kandarakis et al., 2007). d. Placebo adalah cairan akuades. 49 4.5 Bahan dan Instrumen Penelitian Bahan penelitian : 1. Ekstrak umbi ubi jalar ungu. 2. Makanan tinggi glikotoksin. Instrument penelitian yang digunakan adalah : 1. Kit ELISA OxiSelect N-Carboxymethyl-lysine, produksi Cell Biolabs Inc., USA. 4.6 Prosedur Pembuatan Ekstrak Umbi Ubi Jalar Ungu 1. Umbi ubi jalar ungu dicuci bersih, kemudian dipotong-potong. 2. Ke dalam 100 gr umbi ubi jalar ungu ditambahkan 1000 ml akuades dan dihomogenisasi dengan blender selama 5 menit. 3. Homogenat umbi ubi jalar ungu kemudian disaring dengan 3 lapis kain kasa. 4. Kandungan antosianin dalam ekstrak umbi ubi jalar ungu yang sudah jadi diperiksa, didapatkan antosianin 3 mg per 1 ml ekstrak. 4.7 Pemeliharaan & Perawatan Tikus Selama Penelitian - Ruangan dimana kandang ditempatkan harus memiliki ventilasi yang baik supaya suhu dan kelembaban dapat diatur dan bau yang merangsang dapat cepat hilang. Suhu diatur dengan alat pendingin 20-25˚C, tidak boleh lebih dari 30˚C. Aliran udara tidak boleh kencang. Ruangan harus bersih, tenang dan tidak bising. 50 - Kandang berukuran 900 cm2 untuk 4-5 ekor tikus. Kandang dibersihkan paling sedikit seminggu sekali dengan obat pembersih atau air panas. Alas tidur dalam kandang dipakai serbuk gergaji yang bebas debu, diganti paling sedikit seminggu sekali atau kalau tercium bau ammonia. - Air minum yang bersih disediakan dalam botol plastik sehingga tikus dapat minum setiap saat. Botol minuman dibersihkan seminggu sekali. - Makanan adalah makanan standard yang disangrai, diberikan secara ad libitum dalam jumlah tidak terbatas. - Saat pemberian ekstrak ubi ungu, sonde tidak dimasukkan terlalu dalam untuk menghindari rasa sakit yang berlebihan. - Setelah penelitian, tikus dieutanasia. Karena jumlah tikus yang banyak, cara yang dipakai adalah dengan karbondioksida yang ditempatkan dalam wadah plastik atau logam. 4.8 Prosedur Penelitian - Dipilih 30 ekor tikus jenis wistar yang berumur 4 – 5 bulan, dengan berat 160 – 170 gram, yang telah diberi diet tinggi glikotoksin selama 4 minggu. - Kadar CML dalam serum semua tikus diperiksa, yang menjadi data pretest. - Tikus dibagi menjadi 2 kelompok, 15 ekor tikus per kelompok, secara random. - Kelompok P0, diberi makanan tinggi glikotoksin dan akuades, selama 8 minggu. 51 - Kelompok P1, diberi makanan tinggi glikotoksin dan ekstrak umbi ubi jalar ungu 2,4 ml (antosianin 7 mg), dengan menggunakan sonde, selama 8 minggu. - Setelah 8 minggu, dilakukan pemeriksaan kadar CML dalam serum tikus dari kedua kelompok, yang menjadi data post-test. 52 30 tikus diberi diet tinggi glikotoksin selama 4 minggu Pre-test kadar serum CML 15 tikus kelompok P0 15 tikus kelompok P1 Diet tinggi glikotoksin + akuades selama 8 minggu Diet tinggi glikotoksin + 2,4 ml ekstrak ubi jalar ungu selama 8 minggu Post-test kadar serum CML Analisis Laporan Gambar 4.3 Alur Penelitian 53 4.9 Analisis Data Data diolah dengan program SPSS for Windows. 1. Analisis deskriptif. Analisis deskriptif dilakukan untuk mengetahui karakteristik data yang dimiliki. 2. Uji normalitas. Uji normalitas data dilakukan dengan Uji Shapiro-Wilk. 3. Uji homogenitas. Homogenitas data dianalisis dengan Levene’s Test. 4. Uji komparasi. Uji komparasi data pre dan post kelompok Kontrol menggunakan paired samples test, sedangkan uji komparasi kelompok Perlakuan menggunakan uji Wilcoxon. Uji komparasi antara kelompok Kontrol dan Perlakuan menggunakan uji Mann-Whitney. 54 BAB V HASIL PENELITIAN Dalam penelitian ini digunakan 30 tikus putih jenis Wistar (albino rat) dengan peningkatan kadar serum CML, yang terbagi menjadi 2 kelompok masingmasing berjumlah 15 ekor tikus, yaitu kelompok kontrol (akuades) dan kelompok perlakuan (ekstrak ubi ungu 2,4 ml). Data hasil pemeriksaan kadar serum CML sebelum dan sesudah perlakuan disajikan dalam Tabel 5.1. Subjek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 CML serum kelompok Perlakuan (ng/ml) Pre 247 257 205 211 159 168 130 193 160 125 125 479 386 444 459 Subjek Post 84 275 292 287 293 303 308 172 303 362 275 289 147 98 364 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 CML serum kelompok Kontrol (ng/ml) Pre Post 189 399 238 306 240 195 364 267 237 218 138 241 170 256 259 320 219 182 203 498 138 505 105 487 105 484 307 469 398 382 Tabel 5.1 Kadar Serum CML Sebelum dan Sesudah Perlakuan 55 Dalam pembahasan ini akan diuraikan hasil analisa deskriptif, uji normalitas, uji homogenitas, uji komparabilitas dan uji efek perlakuan. 5.1 Analisis Deskriptif Rerata kadar serum CML dari kelompok Kontrol dan Perlakuan, sebelum dan sesudah perlakuan, disajikan dalam Tabel 5.2 dan Gambar 5.1. Hasil analisis deskriptif secara lengkap disajikan dalam Lampiran 1. Kelompok Kontrol Perlakuan Rerata Kadar Serum CML (ng/mL) Pre Post 220,67 347,27 249,87 256,80 Tabel 5.2 Rerata Kadar Serum CML 350 300 250 200 Kontrol 150 Perlakuan 100 50 0 Pre Post Gambar 5.1 Grafik Rerata Kadar Serum CML (ng/ml) 56 5.2 Uji Normalitas Data Data kadar CML serum kelompok Kontrol dan Perlakuan, sebelum dan sesudah perlakuan, diuji normalitasnya dengan uji Shapiro-Wilk. Hasilnya menunjukkan bahwa data kelompok Kontrol, sebelum dan sesudah perlakuan, berdistribusi normal (p > 0,05). Sedangkan data kelompok Perlakuan, sebelum dan sesudah perlakuan, tidak berdistribusi normal (p < 0,05). Hasil uji normalitas disajikan dalam Lampiran 2. 5.3 Uji Homogenitas Data Data kadar CML serum kelompok Kontrol dan Perlakuan, sebelum dan sesudah perlakuan, diuji homogenitasnya dengan Levene’s test. Hasil menunjukkan bahwa data sebelum dan sesudah perlakuan adalah homogen (p>0,05), disajikan dalam Lampiran 3. 5.4 Uji Komparabilitas dan Uji Efek Perlakuan Data pre-test dan post-test dari kelompok Kontrol berdistribusi normal sehingga analisis perbandingan dilakukan dengan paired samples test. Hasil analisis menunjukan ada perbedaan bermakna antara kadar CML pre-test dan post-test dari kelompok Kontrol (p < 0,05). Hasil analisis disajikan dalam Lampiran 4. Data pre-test dan post-test dari kelompok Perlakuan tidak berdistribusi normal sehingga analisis perbandingan dilakukan dengan uji Wilcoxon. Hasil analisis menunjukan tidak ada perbedaan bermakna antara kadar CML pre-test 57 dan post-test dari kelompok Perlakuan (p > 0,05). Hasil analisis disajikan dalam Lampiran 5. Karena data dari kelompok Kontrol berdistribusi normal, sedangkan data kelompok Perlakuan tidak berdistribusi normal, maka uji komparasi antara kelompok Kontrol dan Perlakuan menggunakan uji Mann-Whitney. Hasil yang disajikan pada Lampiran 6, menunjukkan bahwa kadar CML sebelum perlakuan dari kelompok Kontrol dan Perlakuan tidak ada perbedaan bermakna (p > 0,05), demikian juga dengan kadar CML dari kedua kelompok sesudah perlakuan tidak berbeda bermakna (p > 0,05). 58 BAB VI PEMBAHASAN 6.1 Pengaruh Ekstrak Ubi Jalar Ungu terhadap Kadar Serum CML Hasil analisis deskriptif yang disajikan dalam Tabel 5.2, menunjukkan bahwa rerata kadar serum CML sesudah perlakuan, baik pada kelompok Kontrol maupun kelompok Perlakuan, lebih tinggi dibandingkan dengan sebelum perlakuan. Hal ini sesuai dengan beberapa laporan dalam jurnal ilmiah yang menyatakan bahwa kadar glikotoksin dalam sirkulasi akan meningkat setelah asupan makanan kaya glikotoksin (Peppa et al., 2008; Contreras dan Novakofski, 2010). Hasil penelitian dan analisis data dari kelompok Kontrol menunjukkan peningkatan kadar serum CML secara bermakna. Sedangkan hasil analisis data dari kelompok Perlakuan menunjukkan bahwa tidak ada penurunan kadar serum CML tapi juga tidak terjadi peningkatan kadar serum CML yang bermakna. Ekstrak ubi jalar ungu dapat mencegah kenaikan kadar serum CML terutama karena kandungan antosianin, yang berfungsi sebagai antioksidan, anti-inflamasi dan AGEs inhibitor. Seperti yang dilaporkan dalam banyak jurnal ilmiah antosianin paling dikenal sebagai antioksidan (Wrolstad, 2001; Wang dan Stoner, 2008; Shipp dan AbdelAal, 2010). Beberapa penelitian melaporkan efek anti-inflamasi antosianin, yang walaupun mekanismenya belum dapat dijelaskan secara pasti, antosianin dilaporkan dapat menurunkan beberapa petanda inflamasi (Karlsen et al., 2007). Antosianin dilaporkan dapat menghambat tahap awal proses glikasi, tapi 59 antosianin memang tidak dapat mendegradasi CML yang sudah terbentuk (Vauzour et al., 2010). Ketiga efek biologis antosianin inilah yang dapat mencegah terjadinya stress oksidatif dan inflamasi kronik yang dicetus oleh akumulasi CML, sehingga dengan demikian dapat mencegah pembentukan CML yang berkepanjangan (Matsuda et al., 2002; Yawadio et al., 2007; Wang dan Stoner, 2008; Shipp dan Abdel-Aal, 2010). Hasil uji komparatif antara kelompok Kontrol dan Perlakuan sebelum perlakuan, menunjukkan nilai p > 0,05 yang berarti bahwa tidak ada perbedaan bermakna antara kadar serum CML dari kedua kelompok sebelum perlakuan. Data hasil penelitian dari kelompok Perlakuan menunjukkan bahwa tidak ada penurunan kadar serum CML setelah pemberian ekstrak ubi jalar ungu, sebaliknya terjadi peningkatan kadar serum CML. Peningkatan kadar serum CML pada kelompok Perlakuan memang lebih sedikit dibandingkan dengan peningkatan yang terjadi pada kelompok Kontrol. Walaupun demikian, hasil uji komparatif antara kelompok Kontrol dan Perlakuan sesudah pemberian ekstrak ubi jalar ungu menunjukkan nilai p > 0,05 yang berarti bahwa tidak ada perbedaan bermakna antara kadar serum CML dari kedua kelompok sesudah perlakuan. Ini berarti bahwa walaupun pemberian esktrak ubi jalar ungu dapat mencegah peningkatan kadar serum CML, tapi efek tersebut tidak cukup bermakna bila dibandingkan dengan kelompok yang tidak mendapatkan ekstrak ubi jalar ungu. Ada beberapa hal yang mungkin dapat menjelaskan hasil uji komparatif tersebut. Pertama, asupan harian makanan tinggi glikotoksin, yang sudah mengandung AGEs (CML), menyebabkan akumulasi CML dan antosianin 60 memang tidak dapat mendegradasi CML. Kedua, dosis antosianin 7 mg belum cukup untuk mencegah peningkatan kadar serum CML secara bermakna. Ketiga, durasi pemberian ekstrak ubi jalar ungu tidak cukup lama untuk menghasilkan efek seperti yang diharapkan dari hipotesis penelitian. 6.2 Peranan Ubi Jalar Ungu terhadap Proses Penuaan Beberapa jurnal ilmiah telah melaporkan manfaat polifenol, termasuk antosianin sebagai penghambat pembentukan AGEs (Matsuda et al., 2003; Wang dan Stoner, 2008; Vauzour et al., 2010; Shipp dan Abdel-Aal, 2010). Kemudian beberapa penelitian yang menggunakan bahan makanan kaya antosianin, termasuk ubi jalar ungu, telah dilakukan untuk membuktikan efek antioksidan dan antiinflamasi dari antosianin, yang bermanfaat untuk meredam efek buruk akumulasi AGEs terhadap jaringan tubuh, dengan mengukur perubahan pada petanda stres oksidatif dan inflamasi kronik (Kano et al., 2005; Jawi dkk., 2008; Suda et al., 2008). Sampai saat penelitian ini dilakukan, belum ada penelitian yang secara spesifik melaporkan pengaruh antosianin atau bahan makanan kaya antosianin terhadap kadar serum CML. Penelitian in vitro oleh Matsuda memastikan bahwa beberapa bahan fenolik, termasuk antosianin, dapat menghambat proses glikasi. Walaupun demikian, kelemahan dari suatu penelitian in vitro adalah tidak memperhitungkan pengaruh absorbsi dan metabolisme antosianin dalam tubuh. 61 Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak umbi ubi jalar ungu yang mengandung antosianin 7 mg tidak menurunkan kadar serum CML, tapi mungkin dapat mencegah peningkatan kadar serum CML. Tiga kemungkinan penyebab seperti yang diuraikan sebelumnya dapat menjawab pertanyaan mengapa antosianin 7 mg tidak menurunkan kadar serum CML, sehingga hipotesis dari penelitian ini tidak terbukti. 62 BAB VII SIMPULAN DAN SARAN 7.1 Simpulan Berdasarkan hasil penelitian pemberian ekstrak umbi ubi jalar ungu pada tikus wistar yang diberi diet tinggi glikotoksin selama 8 minggu, didapatkan simpulan sebagai berikut : Pemberian ekstrak umbi ubi jalar ungu 2,4 ml (antosianin 7 mg) tidak dapat menurunkan kadar serum CML. 7.2 Saran Sebagai saran dari penelitian ini adalah : 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui dosis optimal antosianin yang dapat mencegah peningkatan kadar serum CML. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang pengaruh antosianin terhadap akumulasi AGEs di berbagai jaringan tubuh selain serum. 63 DAFTAR PUSTAKA Bengmark, S. 2007. Advanced Glycation and Lipoxidation End Products – Amplifiers of Inflammation : The Role of Food. In : Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, Volume 31, No. 5, 2007 : p. 430-440. CGIAR (Consultative Group on International Agricultural Research), Research & Impact : Areas of Research : Sweet Potato. 2004. Available from : http://www.cgiar.org/impact/research/sweetpotato.html. Accessed at : March 5th, 2011. Contreras, C.L., Novakofski, K.C. 2010. Dietary Advanced Glycation End Products and Aging. In : Nutrients, Volume 2, 2010 : p. 1247-1265. Dalal, M., Ferrucci, L., Sun, K., Beck, J., Fried, L.P., Semba, R.D. 2009. Elevated Serum Advanced Glycation End Products and Poor Grip Strength in Older Community-Dwelling Women. In : Journal of Gerontology : Medical Sciences, Vol 64A, No 1, 2009 : p. 132-137. Ferreira, A.E.N., Ponces, A., Voit, E.O. 2003. A Quantitative Model of The Generation of N-carboxymethyl-lysine In The Maillard Reaction Between Collagen and Glucose. In : Biochemical Journal Immediate Publication, BJ20030496, 2003 : p. 1-45. Goldberg, T., Cai, W., Peppa, M., Dardaine, V., Baliga, B.S., Uribarri, J., Vlassara, H. 2004. Advanced Glycoxidation End Products in Commonly Consumed Foods. In : Journal of The American Dietetic Association, Volume 104, Number 8, 2004 : p. 1287-1291. Goldin, A., Beckman, J.A., Schmidt, A.M., Creager, M.A. 2006. Advanced Glycation End Products: Sparking the Development of Diabetic Vascular Injury. In : Circulation: Journal of the American Heart Association, Volume 114, 2006 ; p. 597-605. Harada, K., Kano, M., Takayanagi, T., Yamakawa, O., Ishikawa, F. 2004. Absorption of Acylated Anthocyanins in Rats and Humans after Ingesting an Extract of Ipomoea batatas Purlpe Sweet Potato Tuber. In : Bioscience Biotechnology Biochemistry, 68(7), 2004 : p. 1500-1507. Jawi, I.M., Suprapta, D.N., Subawa, A.A.N. 2008. Ubi Jalar Ungu Menurunkan Kadar MDA dalam Darah dan Hati Mencit setelah Aktivitas Fisik Maksimal. Dalam : Jurnal Veteriner, Volume 9, No 2, Juni 2008 : hal. 65-72. 64 Jiang, J.M., Wang, Z., Li, D.D. 2004. Effects of AGEs on Oxidation Stress and Antioxidation Abilities in Cultured Astrocytes. In : Biomedical and Environmental Sciences, Volume 17, 2004 : p. 79–86. Kandarakis, E.D., Piperi, C., Korkolopoulou, P., Kandaraki, E., Levidou, J., Papalois, A., Patsouris, E., Papavassiliou, A. G. 2007. Accumulation of Dietary Glycotoxins in The Reproductive System of Normal Female Rat. In : Journal of Molecular Medicine, 85, 2007 : p. 1413-1420. Kano, M., Takayanagi, T., Harada, K., Makino, K., Ishikawa, F. 2005. Antioxidant Activity of Anthocyanions from Purple Sweetpotato, Ipomoea batatas cultivar Ayamurasaki. In : Bioscience, Biotechnology, Biochemistry, Volume 69, 2005 : p. 979–988. Karlsen, A., Retterstol, L., Laake, P., Paur, I., Kjolsrud-Bohn, S., Sandvik, L., Blomhoff, R. 2007. Anthocyanins Inhibit Nuclear Factor-KB Activation in Monocytes and Reduce Plasma Concentration of Pro-Inflammatory Mediators in Healthy Adults. In : The Journal of Nutrition, Vol. 137, 2007 : p. 1951-1954. Kaufmann, K. 2011. Pyridoxamine : A Universal Weapon Against Aging. Available from : http://www.antiaging-systems.com/articles/197-pyridoxamine-auniversal-weapon-against-aging. Accessed at : May 19, 2011. Matsuda, H., Morikawa, T., Toguchida, I., Yoshikawa, M. 2002. Structural Requirements of Flavonoids and Related Compounds for Aldose Reductase Inhibitory Activity. In : Chemistry Pharmaceutical Bulletin, 50(6), 2002 : p. 788795. Matsuda, H., Wang, T., Managi, H., Yoshikawa, M. 2003. Structural Requirements of Flavonoids for Inhibition of Protein Glycation and Radical Scavenging Activities. In : Bioorganic & Medical Chemistry, Volume 11, 2003 : p. 5317-5323. Meerwaldt, R., Links, T., Zeebregts, C., Tio, R., Hillebrands, J. L., Smit, A. 2008. The Clinical Relevance of Assesing Advanced Glycation Endproducts Accumulation in Diabetes. In : Cardiovascular Diabetology, 7 : 29, 2008 : p. 1-8. Negrean, M. 2006. Advanced Glycation Endproducts (AGE) and Their Role in the Pathogenesis of Chronic Complication of Diabetes Mellitus. In : Medica, A Journal of Clinical Medicine, Volume 1, No. 2, 2006 : p. 59-66. 65 Negrean, M., Stirban, A., Stratmann, B., Gawlowski, T., Horstmann, T., Gotting, C., Kleesiek, K., Mueller-Roesel, M., Koschinsky, T., Uribarri, J., Vlassara, H., Tschoepe, D. 2007. Effects of Low- and High-Advanced Glycation Endproduct Meals on Macro- and Microvascular Endothelial Function and Oxidative Stress in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus. In : American Journal of Clinical Nutrition, 85, 2007 : p. 1236-1243. Odetti, P., Monacelli, F. 2008. Glycotoxins : A Possible Threat to Health? In : Mediterranian Journal of Nutrition and Metabolism, 1, 2008 : p. 63-67. Onorato, J.M., Jenkins, A.J., Thorpe, S.R., Baynes, J.W. 2000. Pyridoxamine, an Inhibitor of Advanced Glycation Reactions, also Inhibits Advanced Lipoxidation Reactions. In : The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 28, Issue of July 14, 2000 : p. 21177-21184. Pangkahila, W. 2007. Anti-Aging Medicine : Memperlambat Penuaan, Meningkatkan Kualitas Hidup. Edisi I. Penerbit Buku Kompas : hal. 8-9. Peppa, M., Brem, H., Ehrlich P., Zhang, J. G., Cai, W., Li, Z., Croitoru A., Thung, S., Vlassara, H. 2003. Adverse Effects of Dietary Glycotoxins on Wound Healing in Genetically Diabetic Mice. In : Diabetes, Volume 52, 2003 : p. 2805-2813. Peppa, M., Uribarri, J., Vlassara, H. 2008. Aging and Glycoxidant Stress. In : Hormones, 7(2), 2008 : p. 123-132. Plantamor, Situs Dunia Tumbuhan : Informasi Spesies. 2008. Available from : http://www.plantamor.com/index.php?plant=711. Accessed at : March 5th, 2011. Pocock, S. J. 2008. Clinical Trials : A Practical Approach. John Wiley & Sons Ltd. p. 1-13, 123-141. Rahbar, S., Figarola, L. 2003. Novel Inhibitors of Advanced Glycation Endproducts. In : Archives of Biochemistry and Biophysics, 419, 2003 : p. 63-79. Ramasamy, R., Vannucci, S.J., Yan, S.S.D., Herold, K., Yan, S.F., Schmidt, A.M. 2005. Advanced Glycation End Products and RAGE : A Common Thread in Aging, Diabetes, Neurodegeneration and Inflammation. In : Glycobiology, Volume 15, No 7, 2005 : p. 16R-28R. Schmidt, A.M., Yan, S.D., Yan, S.F., Stern, D.M. 2001. The Multiligand Receptor RAGE as a Progression Factor Amplifying Immune and Inflammatory Responses. In : Journal of Clinical Investigaton, Volume 108, October 2001 : p. 949-955. 66 Semba, R.D., Bandinelli, S., Sun, K., Guralnik, J.M., Ferrucci, L. 2010a. Relationship of an Advanced Glycation End Product, Plasma CarboxymethylLysine, with Slow Walking Speed in Older Adults : The InCHIANTI Study. In : European Journal of Application Physiology, Vol 108, 2010 : p. 191-195. Semba, R.D., Ferrucci, L., Fink, J.C., Sun, K., Beck, J., Dalal, M., Guralnik, J.M., Fried, L.P. 2009a. Advanced Glycation End Products and Their Circulating Receptors and Level of Kidney Function in Older Community-Dwelling Women. In : American Journal of Kidney Diseases, Volume 53, No 1, 2009 : p. 51-58. Semba, R.D., Ferrucci, L., Sun, K., Beck, J., Dalal, M., Varadhan, R., Walston, J., Guralnik, J.M., Fried, L.P. 2009b. Advanced Glycation End Products and Their Circulating Receptors Predict Cardiovascular Disease Mortality in Older Community-Dwelling Women. In : Aging Clinical and Experimental Research, 21(2), 2009 : p. 182-190. Semba, R.D., Ferrucci, L., Sun, K., Patel, K.V., Guralnik, J.M., Fried, L.P. 2009c. Elevated Serum Advanced Glycation End Products and Their Circulating Receptors are Associated with Anaemia in Older Community-Dwelling Women. In : Age and Ageing, Volume 38, 2009 : p. 283-289. Semba, R.D., Fink, J.C., Sun, K., Bandinelli, S., Guralnik, J.M., Ferrucci, L. 2009d. Carboxymethyl-Lysine, an Advanced Glycation End Product, and Decline of Renal Function in Older Community-Dwelling Adults. In : European Journal of Nutrition, Volume 48, Number 1, 2009 : p. 38-44. Semba, R.D., Najjar, S.S., Sun, K., Lakatta, E.G., Ferrucci, L. 2009e. Serum Carboxymethyl-Lysine, an Advanced Glycation End Product, Is Associated with Increased Aortic Pulse Wave Velocity in Adults. In : American Journal of Hypertension, Volume 22, Number 1, 2009 : p. 74-79. Semba, R.D., Nicklett, E.J., Ferrucci, L. 2010b. Does Accumulation of Advanced Glycation End Products Contribute to the Aging Phenotype? In : Journal of Gerontology : Medical Sciences, 65A(9), 2010 : p. 963-975. Semba, R.D., Patel, K.V., Sun, K., Guralnik, J.M., Ershler, W.B., Longo, D.L., Ferrucci, L. 2008. Association of Serum Carboxymethyl-Lysine, a Dominant Advanced Glycation End Product, with Anaemia in Adults : The Baltimore Longitudinal Study of Aging. In : Journal of American Geriatric Society, 56 (11), 2008 : p. 2145-2147. Shipp, J., Abdel-Aal, E.M. 2010. Food Applications and Physiological Effects of Anthocyanins as Functional Food Ingredients. In : The Open Food Science Journal, Vol. 4, 2010 : p. 7-22. 67 Spormann, T. M., Albert, F. W., Rath, T., Dietrich, H., Will, F., Stockis, J. P., Eisenbrand, G., Janzowski, C. 2008. Anthocyanin/Polyphenolic-Rich Fruit Juices Reduces Oxidative Cell Damage in an Intervention Study with Patients on Hemodialysis. In : Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 17(12), 2008 : p. 3372-3380. Suda, I., Ishikawa, F., Hatakeyama, M., Miyawaki, M., Kudo, T., Hirano, K., Ito, A., Yamakawa, O., Horiuchi, S. 2008. Intake of Purple Sweet Potato Beverage Affects on Serum Hepatic Biomarker Levels of Healthy Adult Men with Borderline Hepatitis. In : European Journal of Clinical Nutrition, 62, 2008 : p. 60-67. Truong, V.D., Deighton, N., Thompson, R.T., McFeeters, R.F., Dean, L.O., Pecota, K.V., Yencho, G.C. 2010. Characterization of Anthocyanins and Anthocyanidins in Purple-Fleshed Sweetpotatoes by HPLC-DAD/ESI-MS/MS. In : Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 2010 : p. 404-410. Vauzour, D., Mateos, A.R., Corona, G., Concha, M.J.O., Spencer, J.P.E. 2010. Polyphenols and Human Health : Prevention of Disease and Mechanisms of Action. In : Nutrients, Volume 2, 2010 : p. 1106-1131. Uribarri, J., Tuttle, K.R. 2006. Advanced Glycation End Products and Nephrotoxicity of High-Protein Diet. In : Cinical Journal of American Society of Nephrology, Volume 1, 2006 : p. 1293-1299. Uribarri, J., Woodruff, S., Goodman, S., Cai, W., Chen, X., Pyzik, R., Yong, A., Striker, G.E., Vlassara, H. 2010. Advanced Glycation End Products in Foods and a Practical Guide to Their Reduction in the Diet. In : Journal of the American Dietetic Association, Volume 110, 2010 : p. 911-916. USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 23. 2010. Available at : http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/cgi-bin/list_nut_edit.pl. Accessed at : March 5th, 2011. Vlassara, H., Cai, W., Crandall, J., Goldberg, T., Oberstein, R., Dardaine, V., Peppa, M., Rayfield, E. J. 2002. Inflammatory Mediators are Induced by Dietary Glycotoxins, A Major Risk Factor for Diabetic Angiopathy. In : PNAS, Vol. 99, No. 24, 2002 : p. 15596-15601. Voziyan, P.A., Khalifah, R.G., Thibaudeau, C., Yildiz, A., Jacob, J., Serianni, A.S., Hudson, B.G. 2003. Modification of Proteins In Vitro by Physiological Levels of Glucose. In : The Journal of Biological Chemistry, Vol. 278, No. 47, Issue of November 21, 2003 : p. 46616-46624. 68 Voziyan, P.A., Metz, T.O., Baynes, J.W., Hudson, B.G. 2002. A Post-Amadori Inhibitor Pyridoxamine Also Inhibits Chemical Modification of Proteins by Scavenging Carbonyl Intermediates of Carbohydrate and Lipid Degradation. In : The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, No. 5, Issue of February 1, 2002 : p. 3397-3403. Wang, L. S., Stoner, G. D. 2008. Anthocyanins and Their Role in Cancer Prevention. In : Cancer Letters, 269, 2008 : p. 281-290. Wrolstad, R.E. 2001. The Possible Health Benefits of Anthocyanin Pigments and Polyphenolics. In : The Linus Pauling Institute. Available at : http://lpi.oregonstate.edu/ss01/anthocyanin.html. Accessed at : December 12th, 2010. Yamagishi, S., Nakamura, K., Matsui, T., Ueda, S., Noda, Y., Imaizumi, T. 2008. Inhibitors of Advanced Glycation End Products (AGEs) : Potential Utility for The Treatment of Cardiovascular Disease. In : Cardiovascular Theraupetics, 26, 2008 : p. 50-58. Yawadio, R., Tanimori, S., Morita, N. 2007. Identification of Phenolic Compounds Isolated from Pigmented Rices and Their Aldose Reductase Inhibitory Activities. In : Food Chemistry, Volume 101, 2007 : p. 1616-1625. 69 Lampiran 1 Analisis Deskriptif Descriptives Statistic CML Kontrol Pre Mean 220.67 95% Confidence Interval for Lower Bound 172.44 Mean Upper Bound 217.24 Median 219.00 7.583E3 Std. Deviation 87.082 Minimum 105 Maximum 398 Range 293 Interquartile Range 121 Skewness .605 .580 -.085 1.121 Mean 249.87 32.940 95% Confidence Interval for Lower Bound 179.22 Mean 320.52 Kurtosis CML Perlakuan Pre 22.484 268.89 5% Trimmed Mean Variance Std. Error Upper Bound 5% Trimmed Mean 244.07 Median 205.00 Variance 1.628E4 Std. Deviation 127.577 Minimum 125 Maximum 479 Range 354 Interquartile Range 227 Skewness .915 .580 -.732 1.121 Kurtosis 70 CML Kontrol Post CML Perlakuan Post Mean 347.27 95% Confidence Interval for Lower Bound 281.04 Mean 413.50 Upper Bound 5% Trimmed Mean 347.69 Median 320.00 Variance 1.430E4 Std. Deviation 119.595 30.879 Minimum 182 Maximum 505 Range 323 Interquartile Range 243 Skewness .089 .580 Kurtosis -1.675 1.121 Mean 256.80 22.776 95% Confidence Interval for Lower Bound 207.95 Mean 305.65 Upper Bound 5% Trimmed Mean 260.44 Median 289.00 Variance 7.781E3 Std. Deviation 88.210 Minimum 84 Maximum 364 Range 280 Interquartile Range 131 Skewness -.985 .580 Kurtosis -.138 1.121 71 Lampiran 2 Uji Normalitas Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Statistic df Shapiro-Wilk Sig. Statistic df Sig. CML Kontrol Pre .145 15 .200* .945 15 .444 CML Perlakuan Pre .220 15 .050 .829 15 .009 CML Kontrol Post .179 15 .200* .894 15 .076 CML Perlakuan Post .315 15 .000 .836 15 .011 a. Lilliefors Significance Correction *. This is a lower bound of the true significance. Lampiran 3 Uji Homogenitas Levene's Test for Equality of Variances F CML sebelum perlakuan Equal variances assumed Sig. 2.675 .113 3.936 .057 Equal variances not assumed CML sesudah perlakuan Equal variances assumed Equal variances not assumed 72 Lampiran 4 Paired Samples Test Kelompok Kontrol Paired Samples Test Paired Differences 95% Confidence Interval of the Std. Mean Deviation Pair CML Kontrol Pre 1 - CML Kontrol Post 126.600 Std. Error Mean 164.963 Difference Lower 42.593 -217.954 Lampiran 5 Uji Wilcoxon Kelompok Perlakuan Test Statisticsb CML Perlakuan Post - CML Perlakuan Pre -.114a Z Asymp. Sig. (2-tailed) .910 a. Based on negative ranks. b. Wilcoxon Signed Ranks Test 73 Upper Sig. (2t -35.246 -2.972 df 14 tailed) .010 Lampiran 6 Uji Mann-Whitney Ranks Kelompok CML Pre CML Post N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol 15 15.07 226.00 Perlakuan 15 15.93 239.00 Total 30 Kontrol 15 18.27 274.00 Perlakuan 15 12.73 191.00 Total 30 Test Statisticsb CML Pre CML Post Mann-Whitney U 106.000 71.000 Wilcoxon W 226.000 191.000 -.270 -1.722 .787 .085 .806a .089a Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Kelompok 74