BAB III METODOLOGI PENELITIAN Penelitian akan diawali

16
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian akan diawali dengan preparasi alat dan bahan untuk sampling
sel folikel akar rambut. Sampel kemudian dilisis, diamplifikasi dan disekuensing
dengan metode dideoksi Sanger. Hasil sekuensing kemudian dianalisis sehingga
diperoleh data variasi mutasi daerah HVI mtDNA.
3.1
Bagan Alir Penelitian
Garis besar keseluruhan tahapan penelitian yang akan dilakukan dapat
dilihat pada Gambar 3.1.
Sampel mtDNA
(sel folikel akar rambut)
• Lisis sampel
Templat mtDNA
• Amplifikasi dengan teknik PCR
• Deteksi dengan elektroforesis gel
Fragmen mtDNAagarosa
daerah
Hipervariabel I (HVI)
• Sekuensing
Urutan nukleotida mtDNA daerah
Hipervariabel I(HVI)
• Analisis hasil sekuensing dengan
program DNAstar versi 4
Variasi muatasi daerah HVI mtDNA pada
populasi dataran tinggi
Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian Secara Garis Besar.
17
3.2
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, pipet mikro
+ tip 0.5 -10 µL, pipet mikro+ tip 10-100 µL, tabung eppendorf 200 µL, tabung
eppendorf 500 µL, tabung eppendorf 1500 µL, gelas kimia 50 mL, gelas kimia
100mL, gelas kimia 500mL, water bath, thermometer, microsentrifuge, mesin
GeneAmp® PCR System 2700, set alat elektroforesis, dan lampu UV. Alat-alat
seperti cawan petri, tabung eppendorf dan tip disterilisasi sebelum dipakai.
Adapun bahan-bahan yang digunakan adalah sel folikel akar rambut,
etanol teknis, buffer lisis (500 mM Tris-HCl pH 8,5, 10 mM EDTA pH 8, dan 5%
Tween-20), enzim proteinase K, ddH2O, primer M1 (20pmol/µL), primer HV2R
(20pmol/µL), buffer PCR 10 x (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9,0 pada suhu
25˚C, 1% Triton X-100, 20 mM MgCl2), enzim Taq DNA Polimerase (5 unit/µL),
campuran dNTP (10mM), agarosa, buffer TAE 1 x, larutan EtBr, loading buffer
(sukrosa 50%, EDTA 0,1 M pH 8, bromfenol biru 0,1% pH 8), dan marker.
1.3
Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Riset (Research Laboratory)
Jurusan Pendidikan Kimia (Gedung JICA lantai 5), laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Pendidikan Biologi (Gedung JICA lantai 2) FPMIPA Universitas
Pendidikan Indonesia (UPI), Jl. Dr. Setiabudhi No.229 Bandung, dan
Laboratorium Biokimia Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung (ITB).
18
3.4
Pengumpulan Sampel Mentah mtDNA Manusia
Pengumpulan sampel dilakukan pada minggu ke-1 bulan Maret 2010 di
dataran tinggi Gunung Papandayan yang mempunyai ketinggian 2400 dpl. Sampel
diperoleh dengan mengambil ±7 helai sel folikel akar rambut dari 20 penduduk
sekitar. Pengambilan sel akar rambut menggunakan pinset, dan sarung tangan. Sel
folikel akar rambut dimasukkan kedalam plastik obat yang telah diberi kode
sampel dan disimpan ke dalam thermos es, sebelum dimasukkan ke dalam lemari
es.
3.5
Penyiapan Templat dengan Lisis Sel
Templat mtDNA yang akan diamplifikasi diperoleh dari hasil lisis sel
folikel akar rambut. Sel akar rambut dari sampel diambil menggunakan pinset.
Dipotong bagian akar rambutnya sekitar 7 mm pada cawan petri menggunakan
ujung pinset. Masukkan potongan sel folikel akar rambut ke dalam tabung
eppendorf 1500µL, kemudian ditambahkan ddH2O 170 µL, buffer lisis sebanyak
20 µL, dan enzim proteinase K sebanyak 10 µL. Selanjutnya, tabung eppendorf
dibungkus dengan parafilm, dan dilisis selama satu jam pada suhu 55oC.
Dideaktivasi selama 10 menit pada suhu 95oC dan disentrifuse selama tiga menit
pada kecepatan 14000 rpm. Setelah proses sentrifugasi, diambil supernatannya
sebanyak ± 150 µL dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1500 µL yang
baru.
19
3.6
Amplifikasi mtDNA Daerah D-loop
Amplifikasi mtDNA daerah D-loop mtDNA manusia dilakukan dengan
proses PCR. Pereaksi PCR yang terdiri dari 5 µL templat mtDNA hasil lisis; 0,5
µL primer M1 (20 pmol/µL); 0,5 µL primer HV2R (20 pmol/µL); 2,5 µL buffer
PCR 10 x (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9 pada suhu 25˚C; 1,0% Triton X100; 15 mM MgCl2); 0,2 µL enzim Taq DNA Polimerase (5 unit/µL); 0,5 µL
campuran dNTP 10 mM; dan ditambah 15,8 µL ddH2O steril sehingga volumenya
mencapai 25µL. Semua pereaksi PCR selain templat mtDNA biasa disebut master
mix. Master mix 20µL dimasukkan dalam tabung eppendorf 200µL kemudian
ditambahkan templat mtDNA 5µL, kemudian siap dimasukkan kedalam alat PCR.
Adapun urutan rinci nukleotida primer M1 dan HV2R yang digunakan dalam
proses PCR dapat dilihat pada Tabel.3.1.
Tabel 3.1. Urutan nukleotida primer M1 dan HV2R.
Primer
Urutan 5’ ke 3’
Ukuran
M1
-CACCATTAGCACCCAAAGCT-
20 nukleotida
HV2R
-CTGTTAAAAGTGCATACCGCC-
21 nukleotida
Proses PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dengan menggunakan mesin
GeneAmp® PCR System 2700. Tiap tahap siklus terdiri dari tahap denaturasi pada
suhu 94˚C selama satu menit, tahap annealing pada suhu 50°C selama satu menit
dan tahap polimerase pada suhu 72°C selama 1 menit. Sebelum siklus berjalan
dibutuhkan waktu 5 menit untuk melakukan tahap denaturasi awal, dan pada akhir
siklus diperlukan tahapan polimerasi tambahan selama 4 menit. Setelah semua
20
tahapan selesai, DNA hasil PCR disimpan pada suhu 4°C dalam mesin. Tahapan
proses PCR dapat dilihat pada Gambar 3.2.
94ºC
94ºC
72ºC
5’
72ºC
1’
1’
4’
50ºC
1’
30 siklus
Gambar 3.2. Tahapan Proses PCR.
3.7
4ºC
~
Deteksi Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Deteksi hasil PCR dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%
(h/v) menggunakan alat mini sub TM DNA Electrophoresis cell (TM minicell). Gel
agarosa dibuat dengan melarutkan 0,15 g agarosa dalam 15mL buffer TAE 1x.
Larutan tersebut dipanaskan menggunakan pemanas hingga seluruh agarosa larut
pada suhu ± 80°C. Didinginkan larutan mencapai suhu ± 60°C dan ditambahkan 2
µL larutan EtBr sambil diaduk hingga EtBr homogen dalam larutan gel. Larutan
gel dituangkan ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir untuk membuat sumur.
Setelah gel mengeras, buka sisir dari cetakan, kemudian dimasukkan 5 µL sampel
hasil PCR yang telah dicampur dengan 2 µL loading buffer ke dalam masingmasing sumur.
21
Pada proses elektroforesis ini buffer TAE 1 x digunakan sebagai running
buffer atau media penghantar arus pada tegangan 100 volt selama ± 25 menit.
Hasil elektroforesis divisualisasi dengan lampu UV seri 9814-312 nm (Cole
Parmer) di dalam ruangan khusus. Penentuan konsentrasi DNA dapat dilakukan
dengan cara membandingkan intensitas pita yang dianalisis terhadap pita-pita dari
marker yang konsentrasinya telah ditentukan sebelumnya. Marker yang digunakan
adalah pUC19/HinfI, yaitu plasmid pUC19 yang dipotong dengan enzim retriksi
HinfI. Marker ini memiliki lima pita yang masing-masing berukuran 1419 pb, 517
pb, 396 pb, 214 pb, dan 75 pb (Halimatul, 2005 dalam Lestari, 2008).
3.8
Sekuensing
Sekuensing DNA adalah proses untuk menentukan urutan nukleotida
fragmen hasil amplifikasi dengan PCR. Sekuensing ini dilakukan dengan metode
dideoksi sanger menggunakan Automatic DNA Sequence yang berdasarkan pada
metode dye terminator labeling dengan bahan serta zat pereaksi dari DYEnamic
ET terminator cycle sequencing kit (Amersham Bioscience, 2003). Tahapan
sekuensing dilakukan di laboratorium Macrogen, Inc Advancing Through
Genomics Korea. Sampel berupa fragmen mtDNA didalam tabung eppendorf 500
µL ditambah primer yang digunakan, dikirim ke laboratorium ini.
Tahapan sekuensing DNA yang akan dilakukan meliputi penyiapan DNA
templat, reaksi sekuensing menggunakan primer M1, pemurnian hasil sekuensing
dengan kolom sephadex G-50, elektroforesis pada gel poliakrilamida dan
pembacaan elektroforegram hasil sekuensing menggunakan alat Sequencing DNA
22
Analyzer. Prinsip alat Sequencing DNA Analyzer adalah merekam sinyal yang
diinduksi oleh sinar laser dan membaca fragmen-fragmen berdasarkan serapan
gelombangnya (Halimatul, 2005).
Pembacaan hasil sekuensing dapat dilihat dari data elektroforegram yang
menunjukkan warna dan tinggi puncak yang berbeda untuk tiap basa. Untuk basa
A berwarna hijau, basa G berwarna hitam, basa C berwarna biru dan basa T
berwarna merah. Analisis urutan nukleotida hasil sekuensing dilakukan
menggunakan program DNAstar versi 4.