SKEMA KERJA ISOLASI MIKROBA PENGHASIL ANTIBIOTIK 1

SKEMA KERJA ISOLASI MIKROBA PENGHASIL ANTIBIOTIK
1. PENGAMBILAN DAN PENGOLAHAN SAMPEL
Bakteri endofit
Fungi endofit
Actinomycetes
Bakteri Asam Laktat
Sampel tanaman
Sampel tanah dipanaskan pada suhu 60oC
Sampel digerus dalam lumpang steril
Sterilisasi permukaan
(etanol (10 detik) → hipoklorit (10 detik) → air steril (1 menit))
Dibuat pengenceran 10-1 sampai 10-5
menggunakan air steril dalam vial.
Dibuat pengenceran 10-1 sampai 10-5
menggunakan air steril dalam vial.
Dipotong kecil-kecil
2. PENGISOLASIAN
Bakteri endofit
Fungi endofit
Actinomycetes
10-1
10-3
Bakteri Asam Laktat
10-5
10-1
10-3
10-5
Sampel yang telah dipotong dan
disterilisasi permukaan digerus
kemudian dibuat pengenceran 10-1
sampai 10-5
Sampel yang telah dipotong dan
disterilisasi permukaan
Diambil 1 ml menggunakan spoit steril
(Cawan petri berisi medium PDA)
(BUAT TRIPLO)
(Cawan petri berisi medium SNA)
(Cawan petri berisi medium MRSA + CaCO3 1%)
(Cawan petri berisi medium NA)
Diinkubasi 5-7 x 24 jam pada 25oC
Diinkubasi 7 x 24 jam pada 37oC
Diinkubasi 2-3 x 24 jam pada 37oC
Diambil 1 ml menggunakan spoit steril
Ditanam langsung
Diambil 1 ml menggunakan spoit steril
Diinkubasi 2-5 x 24 jam pada 37oC
3. PEMURNIAN DAN PEREMAJAAN
Bakteri endofit
Fungi endofit
Actinomycetes
Bakteri Asam Laktat
TERDAPAT BANYAK KOLONI MIKROBA YANG TUMBUH DALAM MEDIUM
Dipilih
Koloni dengan ciri bakteri pada
umumnya (tidak berfilamen
dan/atau berlendir) dan memiliki
zona bening di sekitarnya.
Dipilih
Koloni dengan ciri fungi pada
umumnya (berfilamen)dan memiliki
zona bening di sekitarnya.
Diambil masing-masing 1 koloni
yang dipilih menggunakan ose steril
Diambil masing-masing 1 koloni yang
dipilih menggunakan ose steril
DIPINDAHKAN
Dipilih
Koloni dengan ciri berfilamen dengan
konsistensi berbubuk dan melekat
erat pada permukaan agar. Memiliki
warna dan mengkilap.
Diambil masing-masing 1 koloni yang
dipilih menggunakan ose steril
DIPINDAHKAN
Cawan petri dengan medium NA
baru
Cawan petri dengan medium PDA
baru
Inkubasi 2-5 x 24 jam pada 37oC
Inkubasi 5-7 x 24 jam pada 25oC
Dipilih koloni dengan zona bening di
sekitarnya.
Diambil masing-masing 1 koloni yang
dipilih menggunakan ose steril
DIPINDAHKAN
DIPINDAHKAN
Cawan petri dengan medium SNA baru
Inkubasi 7 x 24 jam pada 37oC
Cawan petri dengan medium MRSA +
CaCO3 baru
Inkubasi 2- 3 x 24 jam pada 37oC
Catatan :
Jika koloni yang memenuhi kriteria lebih dari 1 koloni, maka semua koloni yang memenuhi kriteria dimurnikan dengan cara seperti di atas.
Jika setelah 1 kali tahap pemurnian, hasil yang diperoleh masih terdapat lebih dari 1 jenis koloni, maka proses pemurnian dilanjutkan terus hingga diperoleh koloni yang murni.
Setelah diperoleh isolat murni, maka:
Masing-masing isolate di uji antagonis (uji kemampuan menghambat pertumbuhan mikroba).
Selama proses uji antagonis, isolate murni dalam cawan petri disimpan dengan baik dalam kulkas untuk menghambat pertumbuhan bakteri (Hindari kontaminasi!)
Apabila diperoleh hasil positif setelah uji antagonis, maka dilakukan peremajaan isolat pada medium masing-masing pada agar miring dalam tabung reaksi.
Bakteri endofit : NA
Fungi endofit : PDA
Actinomycetes : SNA
BAL : MRSA
4. UJI ANTAGONIS
Bakteri endofit
Fungi endofit
Actinomycetes
Bakteri Asam Laktat
Uji antagonis bakteri
Medium NA dipadatkan dalam cawan petri
Gores sinambung biakan bakteri uji pada masing-masing cawan petri
Eschericia coli (Gram negatif)
Stahpylococcus aureus (Gram positif)
Tempelkan potongan isolat pada masing-masing cawan petri
Inkubasi 1 x 24 jam pada 37oC.
Uji antagonis Fungi
Medium PDA dipadatkan dalam cawan petri
Gores sinambung biakan Fungi pada cawan petri
Candida albicans.
Tempelkan potongan isolat pada cawan petri
Inkubasi 3 x 24 jam pada 25oC.
Catatan :
Jika pada hasil uji antagonis, isolat menunjukkan aktivitas antimikroba (terdapat zona bening), maka pengerjaan dapat dilanjutkan.
Namun, apabila hasil negatif, maka pengerjaan dilakukan berulang hingga diperoleh hasil positif.
5. PEMBENIHAN DAN PRODUKSI ANTIBIOTIK
Bakteri endofit
Fungi endofit
Actinomycetes
PEMBENIHAN (STARTER)
Dibuat sebanyak 30 ml medium produksi untuk starter
Bakteri endofit : MYB
Fungi endofit : PDY
Actinomycetes : SNB
BAL : MRSB
Dimasukkan potongan isolat ke dalam medium produksi
Inkubasi
Bakteri endofit : 5 x 24 jam, 37oC
Fungi endofit : 7 x 24 jam, 25oC
Actinomycetes : 7 x 24 jam, 37o+C
BAL : 3 x 24 jam, 37oC
(Shaker selama ±10 menit satu kali sehari)
PRODUKSI ANTIBIOTIK
Ditambahkan sebanyak 270 ml medium produksi
Bakteri Asam Laktat
Inkubasi
Bakteri endofit : 5 x 24 jam, 37oC
Fungi endofit : 7 x 24 jam, 25oC
Actinomycetes : 7 x 24 jam, 37o+C
BAL : 3 x 24 jam, 37oC
(Shaker selama ±10 menit satu kali sehari)
6. EKSTRAKSI ISOLAT
Bakteri endofit
Fungi endofit
Actinomycetes
Bakteri Asam Laktat
MEDIUM FERMENTASI + ETIL ASETAT (1 : 1)
DIMASUKKAN KE DALAM CORONG PISAH
GOJOG SELAMA ± 1 JAM
DIAMKAN HINGGA TERBENTUK 2 LAPISAN
AMBIL LAPISAN BAGIAN ATAS
UAPKAN PELARUTNYA
7. UJI DAYA HAMBAT
Bakteri endofit
Fungi endofit
Actinomycetes
METABOLIT HASIL EKSTRAKSI DILARUTKAN DALAM DMSO (CAMPURAN A)
CALUPKAN PAPER DISK DALAM CAMPURAN A
Medium NA (untuk bakteri) atau PDA (jika fungi) + biakan bakteri uji/Fungi
Inkubasi
Bakteri : 1 x 24 jam, 37oC
Fungi : 3 x 24 jam, 25oC
Bakteri Asam Laktat