DETEKSI SEL DONOR IKAN GURAME

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
4.1.1 Transplantasi sel
Keberhasilan transplantasi sel gonad gurame pada larva nila ditunjukkan
pada Gambar 4 yang ditandai dengan adanya sel-sel merah yang berpendar. Selsel yang berpendar tersebut adalah sel gonad gurame yang telah ditandai dengan
PKH-26. Sel-sel gonad menyebar ke seluruh bagian tubuh larva, tetapi yang
paling banyak ditemukan adalah pada bagian rongga antara dorsal dan kuning
telur (Gambar 4A). Hal ini disebabkan karena lokasi penyuntikkan sel berada
pada bagian tersebut. Penyuntikkan sel menggunakan PKH-26 dimaksudkan
untuk mengetahui keberhasilan penyuntikkan sebelum larva nila transplan
tersebut dianalisis menggunakan PCR.
C
D
Gambar 4. Tempat kolonisasi sel donor dalam tubuh larva ikan nila resipien.
Kolonisasi sel donor pada bagian rongga perut antara dorsal dan
kuning telur (A), sel donor tekolonisasi di bagian kepala (B), sel donor
terkolonisasi di bagian ekor (C), dan sel donor terkolonisasi di bagian
dekat anus (D).
4.1.2 Ekstraksi DNA
Seperti ditampilkan pada Gambar 5, 6, dan 7, pita-pita DNA menunjukkan
keberhasilan ekstraksi. Pada sampel 10.000 dan 20.000 sel pita DNA sangat tipis
sekali dan hampir tidak terlihat, sedangkan pada sampel sel 1.250 - 5.000 pita
DNA tidak terlihat. Gambar 5 menunjukkan hasil ekstraksi dari 20.000 – 80.000
sel gonad ikan gurame, Gambar 6 menunjukkan hasil ekstraksi dari sel gonad ikan
gurame sebanyak 1250 – 20.000 sel dan hasil ekstraksi sel gonad gurame
berbanding gonad nila sebanyak 1:1 – 1:104. Sedangkan untuk Gambar 7
menunjukkan hasil ekstraksi dari nila transplan yang sudah disuntikkan sel donor
sebanyak 1.250 - 80.000 sel. Larva nila transplan tersebut sebelumnya sudah
diamati menggunakan mikroskop fluoresen. Selain menggunakan elektroforesis,
pengecekan DNA juga dilakukan secara kuantitatif yaitu dengan menggunakan
GeneQuant sehingga konsentrasi DNA dapat diketahui.
M
20
30
40
60
80
Gambar 5. Elektroforesis DNA hasil ekstraksi dari sel gonad ikan gurame
sebanyak 20.000-80.000 sel. M adalah marker DNA, sementara angka
di atas gambar adalah jumlah sel 20.000 – 80.000.
M
1,25 2,5
5
10
20
M
1:1 1:10 1:102 1:103 1:104
Gambar 6. Elektroforesis DNA hasil ekstraksi dari sel gonad ikan gurame
sebanyak 1.250 – 20.000 sel dan dari campuran sel ikan gurame dan
ikan nila dengan perbandingan berbeda. M adalah marker DNA,
sementara angka di atas gambar adalah jumlah sel 1.250– 20.000 sel.
M
1,25 2,5
5
10
20
M
20
30
40
60
80
Gambar 7. Elektroforesis DNA hasil ekstraksi dari larva ikan nila transplan
dengan jumlah sel donor berbeda. M adalah marker DNA, sementara
angka di atas gambar adalah jumlah sel yang ditransplantasikan yaitu
1.250 – 80.000 sel.
Tabel 1 menampilkan hasil pengukuran konsentrasi DNA menggunakan
GeneQuant. Konsentrasi DNA sel gurame yang paling tinggi adalah dari hasil
ekstraksi 80.000 sel yaitu sebesar 124 µg/mL, sedangkan konsentrasi DNA
terkecil adalah 8 µg/mL pada sampel 1.250 sel. Kisaran rasio yang diperoleh dari
sampel tersebut berkisar antara 1,543 -1,936. Hal ini menunjukkan bahwa kualitas
DNA hasil ekstraksi relatif bagus.
Tabel 1. Konsentrasi DNA hasil ekstraksi dari sel gonad ikan gurame dengan
jumlah sel berbeda
Sampel
Rasio
DNA (µg/mL)
1250
1,936
8
2500
1,676
12
5000
1,780
12
10.000
1,543
16
20.000
1,690
16
30.000
1,773
24
40.000
1,618
32
60.000
1,654
48
80.000
1,760
124
Berdasarkan Tabel 2, terlihat bahwa semakin banyak sel yang diekstrasi
maka semakin besar konsentrasi DNA hasil ekstraksi. Konsentrasi DNA yang
paling besar terdapat pada sel dengan perbandingan 1 : 104 yaitu sebesar 2884
µg/mL, sedangkan konsentrasi DNA terendah didapatkan dari sel dengan
perbandingan 1:1 yaitu sebesar 24 µg/mL.
Tabel 2. Konsentrasi DNA hasil ekstraksi dari campuran sel gonad ikan gurame
dan ikan nila
Sampel
Rasio
DNA (µg/mL)
1:1
1,212
24
1:10
1,179
28
2
1,735
128
1:103
1,817
744
1:104
1,806
2884
1:10
Tabel 3 memperlihatkan adanya perbedaan konsentrasi DNA dan
konsentrasi tertinggi adalah 1132
µg/mL yaitu diperoleh pada larva yang
disuntikan sel gurame sebanyak 60.000 sel. Kemudian untuk konsentrasi terendah
didapat dari larva yang disuntik sel gonad gurame sebanyak 1.250 sel yaitu
sebesar 524 µg/mL.
Tabel 3. Konsentrasi DNA hasil ekstraksi dari larva nila resipien
Sampel
Rasio
DNA (µg/mL)
1250
1,744
524
2500
1,794
588
5000
1,816
724
10.000
1,793
544
20.000
1,812
636
30.000
1,764
960
40.000
1,803
904
60.000
1,775
1132
80.000
1,722
676
4.1.3 Amplifikasi DNA dengan PCR
Berdasarkan Gambar 8A dapat dilihat bahwa jumlah minimum sel gonad
gurame dengan produk PCR dapat terdeteksi adalah 10.000 sel. Jumlah minimum
sel gonad donor yang dapat terdeteksi oleh PCR tersebut selanjutnya digunakan
sebagai jumlah sel gonad gurame yang dicampurkan dengan sel gonad nila
resipien. Hasil PCR perbandingan tersebut ditunjukkan oleh Gambar 9A dengan
perbandingan 1 : 104 sel (sel gurame : sel nila) masih dapat terdeteksi oleh PCR.
Kondisi riil dalam pendeteksian sel gonad donor dengan menggunakan PCR
ditunjukkan oleh Gambar 10A dimana sel tersebut sudah disuntikkan ke dalam
tubuh larva.
Pada hasil PCR nila transplan (Gambar 10A), pita DNA hanya ditemukan
pada larva yang disuntik gonad gurame sebanyak 40.000 sel dan 80.000 sel. Hasil
tersebut berbeda dengan hasil pendeteksian sebelum disuntikkan ke dalam larva
resipien (Gambar 8A dan Gambar 9A). Selain itu, PCR β-aktin juga dilakukan
sebagai kontrol internal loading DNA dalam proses PCR (Gambar 8B, 9B, dan
10B). Pada PCR β-aktin gurame (Gambar 8B), terlihat adanya pita DNA dari
10.000 sel – 80.000 sel. PCR β-aktin pada campuran sel nila dan gurame (Gambar
9B), terlihat adanya pita dari 1:1 sampai 1:104. Begitu juga untuk PCR β-aktin
nila transplan terdapat pita – pita DNA (Gambar 10B).
M
+
1,25 2,5
5
10
20
30
40
60
80
-
A
B
Gambar 8. Hasil PCR dengan primer GH (A) dan β-aktin (B) menggunakan DNA
dari sel gonad gurame 1.250-80.000 sel. M: marker DNA; (+): kontrol
positif; (-): kontrol negatif; 1,25: 1.250 sel; 2,5: 2.500 sel; 5: 5.000 sel;
10: 10.000 sel; 20: 20.000 sel; 30: 30.000 sel; 40: 40.000 sel; 60:
60.000 sel; dan 80: 80.000 sel
M
+
1:1
1:10
1:102
1:103 1:104
-
A
B
Gambar 9. Hasil PCR dengan primer GH (A) dan β-aktin (B) menggunakan DNA
dari campuran sel gonad ikan gurame dan ikan nila. M: marker DNA;
(+): kontrol positif; (-): kontrol negatif; 1,25: 1.250 sel; 2,5: 2.500 sel;
5: 5.000 sel; 10: 10.000 sel; 20: 20.000 sel; 30: 30.000 sel; 40: 40.000
sel; 60: 60.000 sel; dan 80: 80.000 sel
M
+
1,25 2,5
5
10
20
30
40
60 80
-
A
B
Gambar 10. Hasil PCR dengan primer GH (A) dan β-aktin (B) menggunakan
DNA dari larva ikan nila hasil transplantasi. M: marker DNA; (+):
kontrol positif; (-): kontrol negatif; 1,25: 1.250 sel; 2,5: 2.500 sel; 5:
5.000 sel; 10: 10.000 sel; 20: 20.000 sel; 30: 30.000 sel; 40: 40.000 sel;
60: 60.000 sel; dan 80: 80.000 sel
4.2 Pembahasan
Teknologi transplatasi sel atau teknologi induk semang diduga akan
berperan penting bagi perkembangan reproduksi ikan – ikan yang memiliki waktu
matang gonad yang lambat. Sebagai langkah awal dalam pengembangan teknologi
transplantasi sel, pada penelitian ini telah dilakukan pengembangan metode
deteksi sel donor dalam tubuh resipien menggunakan metode PCR. Umumnya
deteksi sel donor dilakukan melalui beberapa cara seperti histologi, penggunaan
sel GFP dan sel yang diberi label PKH-26. Pada mulanya, PGC ikan dapat
dikenali dengan histologi berdasarkan karakter morfologinya, seperti ukuran, rasio
nukleositoplastomik, granular nuclear chromation (Patino & Takashima 1995
dalam Yoshizaki et al., 2000). Berdasarkan penelitian Moore (1937) dalam
Yoshizaki et al. (2000) bahwa secara histologi, PGC ikan rainbow trout dapat
dideteksi pada tahap mesoderm ketika mendekati blastopore, sembilan hari
setelah fertilisasi. Selain itu, Wolke et al. (2002) dalam Takeuchi et al. (2002)
menyimpulkan bahwa dengan menggunakan gen GFP sebagai reporter, sel gonad
ikan transgenik yang membawa gen GFP dengan promoter vasa akan mudah
dibedakan, yaitu sel terlihat berpendar hijau bila diamati menggunakan mikroskop
fluoresen. Keberadaan mikroskop fluoresen di Indonesia masih sangat terbatas,
maka penggunaan metode ini untuk deteksi sel donor masih relatif sulit. Selain itu
pembuatan ikan transgenik juga membutuhkan waktu yang relatif lama.
Pada tahap awal penelitian, dilakukan pengujian sensitivitas PCR dalam
deteksi sel gonad ikan gurame menggunakan DNA hasil ekstraksi dari 1.250
sampai 80.000 sel. Metode yang digunakan adalah metode PCR dengan primer
spesifik gurame (Marlina, 2009). Menurut Okutsu et al. (2008) bahwa sel
germinal donor ikan rainbow trout dapat dideteksi menggunakan primer spesifik
berdasarkan sekuen gen vasa, yang diamplifikasi dengan metode PCR, sehingga
hanya DNA dari sel germinal ikan rainbow trout saja yang dideteksi oleh primer
tersebut. Primer yang digunakan pada penelitian ini adalah primer GH dan β-aktin
sebagai kontrol internal. Menurut Marlina (2009) bahwa marker molekular GH
dan vasa dapat dijadikan sebagai penanda untuk mendeteksi sel germinal donor
(ikan gurame) di dalam gonad resipien (ikan nila). Marker molekular GH lebih
sensitif dibandingkan vasa dalam mendeteksi sel donor ikan gurame, dengan
kemampuan mendeteksi 1 sel gurame di antara 104 sel nila. Akan tetapi, pada
penelitian Marlina (2009) DNA yang dideteksi adalah DNA murni hasil ekstraksi
dari sirip ekor. Pada penelitian ini digunakan DNA dari sel yang telah ditentukan
jumlahnya kemudian diekstraksi dan diamplifikasi menggunakan PCR. Selain itu
pada penelitian ini juga dilakukan penyuntikkan larva menggunakan sel gonad
gurame yang diberi pewarna PKH-26. Hal ini dilakukan untuk mengetahui
keberhasilan penyuntikan pada larva dan untuk membandingkan sensitivitas PCR
dengan mikroskop fluoresen.
Seperti ditunjukkan pada Gambar 4, terlihat bahwa sel donor dalam tubuh
larva yang disuntik dengan sel gonad gurame yang diberi pewarna PKH-26 dapat
terdeteksi. Hal ini diperlihatkan dengan adanya sel-sel yang berpendar merah
yang terlihat di dalam tubuh larva (ditunjukkan dengan tanda panah). Sel-sel
donor dominan terkolonisasi di rongga yang terletak antara kuning telur dan
dorsal (Gambar 4A), sebagian menyebar ke kepala (Gambar 4B), ekor (Gambar
4C), dan dekat anus (Gambar 4D). Penyebaran sel donor ke bagian lain tubuh
ikan resipien selain rongga perut diduga akibat dari tekanan sewaktu injeksi.
Selain itu, sel-sel donor tersebut diduga akan migrasi ke rongga perut seperti
dijelaskan oleh Takeuchi et al. (2004). Pengamatan larva nila transplan di bawah
mikroskop fluoresen dimaksudkan untuk mengetahui ada atau tidaknya sel donor
di dalam tubuh larva sebelum larva tersebut dicek menggunakan PCR.
Pada pengamatan sel menggunakan mikroskop fluoresen, semakin banyak
sel yang disuntikkan maka semakin banyak sel yang masuk ke dalam tubuh larva.
Hal ini dapat dilihat dari jumlah sel yang teramati dari 1.250 – 80.000 sel
(Lampiran 1). Setelah pengamatan menggunakan mikroskop fluoresen, larva nila
transplan dianalisis menggunakan PCR dengan hasil diperlihatkan oleh Gambar
10A. Hasil PCR nila transplan menunjukkan bahwa tidak semua sel donor dalam
tubuh larva hasil injeksi dapat dideteksi oleh PCR, yaitu hanya pada larva yang
disuntik sebanyak 40.000 dan 80.000 sel. Berdasarkan hasil tersebut maka dapat
dikatakan bahwa deteksi menggunakan mikroskop fluoresen jauh lebih sensitif
dibandingkan dengan metode PCR.
Selain pengamatan menggunakan mikroskop fluoresen, analisis hasil
ekstraksi DNA dari sel pun dilakukan dalam penelitian ini yang bertujuan untuk
mengetahui ada atau tidaknya DNA hasil ekstraksi. Hasil ekstraksi sel
ditunjukkan oleh Gambar 5, 6, dan 7 yang mennunjukkan hasil positif (adanya
pita DNA).
Analisis DNA juga dilakukan secara kuantitatif menggunakan
GeneQuant. Hasil pengukuran konsentrasi DNA diperlihatkan oleh Tabel 1-3.
Berdasarkan hasil Tabel 1-2, konsentrasi DNA semakin meningkat seiring dengan
bertambahnya jumlah sel yang diekstraksi. Dengan demikian dapat dikatakan
bahwa semakin banyak jumlah sel yang diekstraksi maka akan semakin banyak
DNA genom yang diperoleh. Akan tetapi, pada Tabel 3 telihat adanya keragaman
konsentrasi DNA yang diperoleh, diduga akibat dari perbedaan ukuran larva ikan
nila.
Pembuktian adanya DNA juga dilakukan dengan PCR menggunakan
primer β-aktin (Gambar 8B, 9B, dan 10B). Berdasarkan Gambar 8B, pita DNA βaktin dapat terdeteksi dari 10.000 - 80.000 sel, sedangkan campuran sel gonad
gurame dan nila (Gambar 9B) terdapat pita – pita DNA yang jelas dan
perbandingan terkecil yang masih dapat terdeteksi adalah 1:104.
Berdasarkan hasil yang didapat pada Gambar 8A, terlihat bahwa semakin
banyak sel gurame yang diekstraksi maka semakin tebal pita DNA yang
terdeteksi. Panjang pita GH gurame yang didapat adalah 340 bp, sesuai dengan
yang diperoleh oleh Marlina (2009). Selanjutnya, jumlah minimal sel gurame
yang dapat dideteksi oleh PCR adalah 10.000 sel. Hasil yang diperoleh tersebut
lebih sensitif dibandingkan dengan yang diungkapan oleh Karanis et al. (2007)
yang menyatakan bahwa PCR mampu mengamplifikasi konsentrasi terendah yang
setara dengan 105 oosit Cryptosporidium.
Pada Gambar 9A memperlihatkan hasil PCR dengan DNA dari campuran
sel gonad gurame dan nila menunjukkan bahwa semakin kecil perbandingan sel,
maka semakin tebal pita DNA yang terdeteksi. Hal ini disebabkan karena
konsentrasi target annealing primer semakin besar. Dari hasil tersebut
perbandingan 1:104 masih dapat terdeteksi oleh PCR. Hasil yang diperoleh ini
sama dengan yang diperoleh oleh Marlina (2009), yaitu sensitivitas marker
molekuler GH dapat mendeteksi 1 sel ikan gurame di dalam 104 sel ikan nila.