UNIVERSITAS INDONESIA SKRIPSI
advertisement
UNIVERSITAS INDONESIA “STUDI ESTERIFIKASI ANTARA SUKROSA DENGAN ASAM LEMAK HASIL HIDROLISIS MINYAK KELAPA MENGGUNAKAN LIPASE Candida rugosa EC 3.1.1.3 TERIMMOBILISASI SILIKA GEL 60” SKRIPSI TRI DESTIYANTI 0806453043 FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM STUDI KIMIA DEPOK 2012 Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 UNIVERSITAS INDONESIA “STUDI ESTERIFIKASI ANTARA SUKROSA DENGAN ASAM LEMAK HASIL HIDROLISIS MINYAK KELAPA MENGGUNAKAN LIPASE Candida rugosa EC 3.1.1.3 TERIMMOBILISASI SILIKA GEL 60” SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar sarjana sains TRI DESTIYANTI 0806453043 FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM STUDI KIMIA DEPOK 2012 Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS Skripsi ini merupakan hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar Nama : Tri Destiyanti NPM : 0806453043 Tanda Tangan : Tanggal : 4 Juli 2012 ii Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 HALAMAN PENGESAHAN Skripsi ini diajukan oleh : Nama : Tri Destiyanti NPM : 0806453043 Program Studi : Kimia S1 Reguler Judul Skripsi : Studi Esterifikasi antara Sukrosa dengan Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Menggunakan Lipase Candida rugosa EC 3.1.1.3 Terimmobilisasi Silika Gel 60 Telah berhasil dipertahankan dihadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia. DEWAN PENGUJI Pembimbing I : Prof. Dr. Sumi Hudiyono PWS Pembimbing II : Dra. Sri Handayani, M.Biomed Penguji : Dr. rer. nat Budiawan Penguji : Dra. Siswati Setiasih, Apt., M.Si Penguji : Prof. Dr. Soleh Kosela Ditetapkan di : Depok Tanggal : 4 Juli 2012 iii Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat, berkah dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir yang berjudul “Studi Esterifikasi antara Sukrosa dengan Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Menggunakan Lipase Candida rugosa EC 3.1.1.3 Terimmobilisasi Silika Gel 60” ini tepat pada waktunya. Tugas akhir ini disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan akademis untuk meraih gelar Sarjana Sains di Program Studi S1 Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia. Dalam penyusunan tugas akhir ini, penulis banyak mendapatkan bantuan selama penelitian maupun dalam penyusunan tugas akhir serta bimbingan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada : 1. Bapak Prof. Dr. Sumi Hudiyono, PWS dan Ibu Dra. Sri Handayani M.Biomed, selaku dosen pembimbing, yang telah membimbing, memberi pengarahan, bantuan moril dan materil dalam penyusunan tugas akhir ini. Terima kasih atas segala bantuan serta diskusinya. 2. Bapak Dr. Ridla Bakri, selaku Ketua Departemen Kimia, Universitas Indonesia. 3. Ibu Dr.Yuni Krisyuningsih Krisnandi S.Si., M.Sc., selaku Pembimbing Akademis penulis selama empat tahun menimba ilmu di Departemen Kimia FMIPA UI. 4. Kedua orangtua serta kedua kakakku tercinta atas saran, motivasi, perhatian, kasih sayang, do’a yang tak pernah putus, dan dukungan baik moril dan materil yang tak kan habis terbalas oleh penulis dan menjadi semangat bagi penulis sehingga dapat menyelesaikan tugas akhir ini. 5. Seluruh Bapak dan Ibu dosen Departemen Kimia FMIPA UI yang telah memberikan ilmu yang bermanfaat. iv Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 6. Mba Emma, Mba Tri, Mba Ina, Mba Cucu, selaku laboran Departemen Kimia, yang telah membantu penulis dalam mendapatkan bahan-bahan penelitian dan berdiskusi mengenai penelitian. 7. Kak Awe dan Kak Ika, yang telah bersedia memberikan petunjuk dan bantuan serta diskusinya tentang penelitian. 8. Sari, Dilah, Dian, Bali, dan Qnoy sebagai teman seperjuangan dalam melaksanakan penelitian ini. Terima kasih telah membantu berdiskusi dan menanggung beban bersama dalam penelitian ini. 9. Dewi, Putri, Lita, Lala, Azizah, Aning, Silmi, Nisa dan Amel terima kasih telah menjadi sahabat penulis di Departemen Kimia. 10. Teman-teman penelitian, Prilly, Decil, Adi, Esti, Putri, Daniel, Intan, Rasti, Uni, Lidya, Hafiez, Kak Widi, Mas Boy, Rakhmat, Linyo, Kak Fani, Dewi, Rina, Nia, Mika, Helen, Reza, Hadi, Andi, Asa, Michu, Khusnul, One, Asef, Kak Habibah, Inna, Irna, dan teman-teman lainnya, terima kasih atas bantuannya selama penelitian ini. 11. Kakak dan teman-teman Laboratorium Afiliasi Departemen Kimia FMIPA UI, terima kasih atas segala bantuannya. 12. Seluruh karyawan Departemen Kimia FMIPA UI atas segala bantuannya, terutama untuk Bapak Sutrisno, Pak Amin, Pak Kiri, Pak Wito, dll. 13. Teman-teman angkatan 2008 yang selama empat tahun terakhir ini telah menjadi bagian hidup penulis. 14. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah membantu dalam penelitian dan penyusunan tugas akhir ini. Dalam penulisan tugas akhir ini, disadari masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, sangat diharapkan saran dan kritik yang membangun demi kesempurnaan penulisan di masa yang akan datang. Akhir kata penulis berharap semoga tugas akhir ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu di masa mendatang. Penulis, 2012 v Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Sebagai sivitas akademik Universitas Indonesia, saya yang bertanda tangan di bawah ini : Nama : Tri Destiyanti NPM : 0806453043 Program Studi : S1 Kimia Reguler Departemen : Kimia Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Jenis Karya : Skripsi demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada Universitas Indonesia Hak Bebas Royalti Noneksklusif (Non-exclusive RoyaltyFree Right) atas karya ilmiah saya yang berjudul : Studi Esterifikasi antara Sukrosa dengan Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Menggunakan Lipase Candida rugosa EC 3.1.1.3 Terimmobilisasi Silika Gel 60 beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti Noneksklusif ini Universitas Indonesia berhak menyimpan, mengalihmedia/formatkan, mengelola dalam bentuk pangkalan data (database), merawat, dan memublikasikan tugas akhir saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis/pencipta dan sebagai pemilik Hak Cipta. Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di : Depok Pada tanggal : 4 Juli 2012 Yang menyatakan, (Tri Destiyanti) vi Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 ABSTRAK Nama : Tri Destiyanti Program Studi : S1 Kimia Reguler Judul : Studi Esterifikasi antara Sukrosa dengan Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Menggunakan Lipase Candida rugosa EC 3.1.1.3 Terimmobilisasi pada Silika Gel 60 Sintesis ester asam lemak hidrolisat minyak kelapa secara enzimatik dapat dilakukan dengan menggunakan lipase dalam kondisi sedikit air. Immobilisasi merupakan teknik modifikasi enzim yang dilakukan dengan bantuan media agar enzim dapat digunakan secara kontinyu dan berulang. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan studi reaksi esterifikasi antara sukrosa dengan asam lemak hasil hidrolisis minyak kelapa menggunakan enzim lipase Candida rugosa yang terimmobilisasi pada silika gel 60. Persentase loading terbesar adalah 69,84% pada immobilisasi lipase yaitu pada 1000 mg silika gel 60 tanpa pencucian dan efisiensi immobilisasi lipase terbesar adalh 32,33% yaitu pada 500 mg silika gel 60 dengan pencucian. Kondisi optimum esterifikasi diperoleh pada waktu inkubasi 32 jam, temperatur reaksi 37 0C, rasio mol sukrosa dengan asam lemak 1:32, dan berat molecular sieve 0,1 g dengan % konversi sebesar 4,47 % . Kata kunci : esterifikasi, sukrosa, emulsifier, lipase Candida rugosa, immobilisasi, silika gel 60, asam lemak hidrolisat minyak kelapa, molecular sieve. xiv + 72 halaman : 27 gambar, 11 tabel, 16 lampiran Daftar Pustaka : 54 (1978-2012) vii Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 ABSTRACT Name : Tri Destiyanti Study Program : Chemistry Title : Esterification Study of Sucrose Ester with Hydrolized Coconut Oil Fatty Acid using Silica Gel 60 Immobilized Lipase of Candida rugosa EC 3.1.1.3 Enzymatic synthetis of hydrolized coconut oil fatty acid ester could be carried out in minimum amount of water with lipase as biocatalyst. Enzyme immobilization is a recovery technique which using media so its can be used continously. In this study, sucrose esters were synthesized by enzymatic esterification between hydrolized coconut oil fatty acids and sucrose using silica gel 60 immobilized lipase of Candida rugosa. The maximum loading percentage of immobilization (69,84%) was achieved at 1000 mg of unwashed silica gel 60 and the maximum percentage efficiency of immobilization (32,33%) was achieved at 500 mg of buffer-washed silica gel 60. The optimum conditions of esterification were achieved at incubation time 32 h, temperature 30 0C, substrate sucrose to fatty acid molar ratio 1:32, and weight of molecular sieve is 0,1 g with conversion percentage of 4,47 %. Keyword : esterification, sucrose, emulsifier, Candida rugosa, immobilized, silica gel 60, coconut oil, and molecular sieve. xiv + 72 pages : 27 pictures, 11 tables, 16 appendixes References : 54 (1978-2012) viii Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 DAFTAR ISI ISI HAL HALAMAN JUDUL…………………………………………….. i PERNYATAAN ORISINALITAS……………………………… ii LEMBAR PENGESAHAN……………………………………… iii KATA PENGANTAR…………………………………………… iv LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH…. vi ABSTRAK………………………………………………………. vii DAFTAR ISI…………………………………………………….. ix DAFTAR GAMBAR…………………………………………….. xii DAFTAR TABEL……………………………………………….. xiii DAFTAR LAMPIRAN………………………………………….. xiv BAB 1 PENDAHULUAN……………………………………….. 1 1.1 Latar Belakang…………………………………………. 1 1.2 Rumusan Masalah………………………………………. 2 1.3 Tujuan Penelitian………………………………………. 3 1.4 Hipotesis………………………………………………. 3 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA…………………………………. 4 2.1 Tanaman Kelapa………………………………………. 4 2.2 Minyak Kelapa…………………………………………. 4 2.3 Asam Lemak…………………………………………… 6 2.4 Sukrosa………………………………………………… 6 2.5 Enzim………………………………………………….. 7 2.5.1 Klasifikasi Enzim……………………………. 8 2.5.2 Kerja Enzim………………………………...... 9 2.6 Lipase…………………………………………………. 11 2.7 Immobilisasi Enzim……………………………………. 13 2.8 Silika Gel………………………………………………. 15 2.9 Molecular Sieve………………………………………… 16 ix Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 2.10 Esterifikasi…………………………………………….. 18 2.11 Ester Sukrosa………………………………………….. 19 2.12 Emulsifier……………………………………………… 21 2.13 Instrumentasi FT-IR…………………………………… 22 BAB 3 METODE PENELITIAN…………………………………. 23 3.1 Alat dan Bahan…………………………………………… 24 3.1.1 Alat…………………………………………….. 24 3.1.2 Bahan………………………………………….. 24 3.2 Prosedur Percobaan………………………………………. 25 3.2.1 Hidrolisis Minyak Kelapa……………………… 25 3.2.2 Penentuan Aktivitas Free Lipase……………… 25 3.2.3 Immobilisasi Lipase dengan Silika Gel 60……. 26 3.2.4 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry 26 3.2.5 Esterifikasi Asam Lemak dengan Sukrosa……. 27 3.2.6 Sentrifugasi Hasil Reaksi……………………… 28 3.2.7 Penentuan % Konversi …………………………… 28 3.2.8 Analisis Produk………………………………… 28 3.2.9 Uji Kualitatif Sederhana Emulsifier……………. 29 3.2.10 Penentuan Jenis Emulsi……………………….. 29 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………. 30 4.1 Hidrolisis Trigliserida…………………………………….. 30 4.2 Penentuan Aktivitas Free Lipase………………………..... 32 4.3 Immobilisasi Lipase dengan Silika Gel 60………………. 33 4.4 Reaksi Esterifikasi antara Sukrosa dan Asam Lemak …… 37 4.5 Identifikasi dengan FT-IR………………………………… 40 4.6 Optimasi Esterifikasi………………………………………. 42 4.6.1 Optimasi Temperatur……………………………….. 42 4.6.2 Optimasi Rasio Substrat……………………….. 43 4.6.3 Optimasi Waktu Inkubasi………………………. 45 4.6.7 Optimasi Molecular sieve……………………… 46 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN.…………………………… x Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 48 5.1 Kesimpulan…………………………………………….. 48 5.2 Saran……………………………………………………. 48 DAFTAR PUSTAKA………………………………………………. 50 LAMPIRAN……………………………………………………….. 55 xi Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 DAFTAR GAMBAR Gambar hal Gambar 2.1 Tanaman Kelapa…………………………………… 4 Gambar 2.2 Daging Buah Kelapa (Kopra)….…………………… 5 Gambar 2.3 Struktur Sukrosa …………………….……………. 7 Gambar 2.4 Penurunan Energi Aktivasi oleh Enzim …………… 9 Gambar 2.5 Mekanisme Kerja Enzim ……………….…………. 10 Gambar 2.6 Struktur 3 dimensi lipase ….……………………….. 12 Gambar 2.7 Metode Immobilisasi Enzim ……………………….. 15 Gambar 2.8 Molecular sieve ……………………………………. 17 Gambar 2.9 Reaksi Esterifikasi Berkatalis Asam ….…………… 18 Gambar 2.10 Hubungan Derajat Esterifikasi dengan Ester Sukrosa 20 Gambar 2.11 Struktur Poliester Sukrosa …….………………… 21 Gambar 2.12 Hubungan HLB dengan Emulsifier………………. 21 Gambar 3.1 Skema Kerja Penelitian…………………………….. 23 Gambar 4.1 Reaksi Hidrolisis Trigliserida Berkatalis Basa……… 31 Gambar 4.2 Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa……… 32 Gambar 4.3 Spektrum FT-IR Silika Gel 60……………………… 34 Gambar 4.4 Kurva Kalibrasi Standar Immobilisasi Enzim………. 35 Gambar 4.5 Kurva % Loading Immobilisasi Lipase…………….. 36 Gambar 4.6 Kurva % Efisiensi Immobilisasi Lipase……………. 37 Gambarr 4.7 Hasil Reaksi Esterifikasi Setelah Terminasi………. 39 Gambar 4.8 Hasil Uji Emulsifier Produk Esterifikasi………….. 40 Gambar 4.9 Spektrum FT-IR Asam Lemak Minyak Kelapa…….. 41 Gambar 4.10 Spektrum FT-IR Sukrosa……………………………. 42 Gambar 4.11 Grafik Temperatur vs % Konversi Esterifikasi……. 43 Gambar 4.12 Grafik Rasio Substrat vs % Konversi Esterifikasi….. 44 Gambar 4.13 Grafik Waktu Inkubasi vs % Konversi Esterifikasi… 46 Gambar 4.14 Grafik Berat Molecular sieve vs % Konversi………. 47 xii Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 DAFTAR TABEL Tabel Hal Tabel 2.1 Komposisi Asam Lemak Minyak Kelapa…………………. 5 Tabel 2.2 Klasifikasi Enzim……………………………………………….. 8 Tabel 4.1 Identifikasi Spektra FT-IR Silika Gel 60………………… 34 Tabel 4.2 Tabel Korelasi Konsentrasi Standar dengan Absorbansi…… 35 Tabel 4.3 Tabel% Loading dan % Aktivitas Lipase Terimmobilisasi… 36 Tabel 4.4 Tabel Korelasi Spektrum FT-IR Asam Lemak Minyak Kelapa 41 Tabel 4.5 Tabel Korelasi Spektrum FT-IR Sukrosa…………………. 42 Tabel 4.6 Pengaruh Temperatur terhadap % Konversi Ester Sukrosa… 43 Tabel 4.7 Pengaruh Rasio Sukrosa : Asam Lemak terhadap % Konversi 44 Tabel 4.8 Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap % Konversi Ester Sukrosa 46 Tabel 4.9 PengaruhMolecular sieve terhadap % Konversi Esterifikasi… 47 xiii Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Hal Lampiran 1. Komposisi Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa 55 Lampiran 2. Perhitungan BM Hidrolisat Minyak Kelapa ……….. 56 Lampiran 3. Perhitungan Rasio Bahan …………………………… 57 Lampiran 4. Perhitungan Aktivitas Free Lipase ……….………… 58 Lampiran 5 Data % Loading dan Efisiensi Immobilisasi………… 59 Lampiran 6. Perhitungan % Loading dan Efisiensi Immobilisasi…. 60 Lampiran 7. Data Titrasi Asam Lemak Sisa Variasi Temperatur… 61 Lampiran 8. Data Titrasi Asam Lemak Sisa Variasi Rasio Substrat 62 Lampiran 9. Data Titrasi Asam Lemak Sisa Variasi Waktu Inkubasi 63 Lampiran 10. Data Titrasi Asam Lemak Sisa Variasi Molecular sieve 64 Lampiran 11. Perhitungan Konversi dan Perkiraan Derajat Substitusi 65 Lampiran 12. Data Spesifikasi Lipase Candida rugosa …………… 66 Lampiran 13. Data Analisis Minyak Kelapa……………………..… 68 Lampiran 14. Spektrum FT-IR Asam Lemak Minyak Kelapa ….… 69 Lampiran 15. Spektrum FT-IR Sukrosa ……………………… 70 Lampiran 16. Spektrum FT-IR Silika Gel 60……………………… 71 xiv Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Emulsifier merupakan suatu senyawa aktif penurun tegangan permukaan yang sangat potensial dan banyak diaplikasikan secara luas dalam bidang industri, seperti industri pangan, farmasi, detergen, kosmetik, dll. Seiring dengan meningkatnya kesadaran akan kesehatan dan lingkungan yang baik, permintaan akan emulsifier yang ramah lingkungan dan mudah terdegradasi semakin meningkat. Salah satu emulsifier yang memenuhi kriteria tersebut adalah ester asam lemak sukrosa dengan derajat substitusi rendah. (Rakmi, 2000). Ester asam lemak sukrosa dapat diperoleh melalui reaksi esterifikasi antara sukrosa dengan asam lemak yang dapat dihidrolisis dari minyak kelapa. Reaksi esterifikasi ini dilakukan secara enzimatis karena lebih mudah dilakukan, ramah lingkungan, dan meminimalisasi produk samping yang terbentuk, dibandingkan dengan sintesis secara kimiawi (Sakidja,1998). Lipase merupakan jenis enzim hidrolase yang dapat menghidrolisis ikatan gliserida pada trigliserida pada minyak atau lemak. Namun, pada kondisi tertentu, lipase juga dapat mengkatalisis reaksi kebalikan dari hidrolisis, yaitu reaksi esterifikasi (Banu OZTURK, 2001). Pada penelitian-penelitian sebelumnya, telah berhasil disintesis ester asam lemak sukrosa secara enzimatis menggunakan lipase.(Barkah dan Noviangsih, 2011). Immobilisasi enzim merupakan teknik efisiensi enzim yang dilakukan dengan bantuan media yang dapat mencegah terlarutnya enzim, sehingga dapat mempertahankan aktivitas katalitik enzim tersebut. Dengan immobilisasi, enzim dapat digunakan secara kontinyu dan berulang-ulang. (Praswati, et al., 2007). Reaksi esterifikasi adalah reaksi reversible yang menghasilkan air sebagai produk samping. Dalam keadaan banyak air, reaksi akan bergeser ke arah hidrolisis. Oleh karena itu, penting untuk mengurangi air tersebut. Salah satu cara untuk meminimalisasi air adalah dengan menggunakan molecular sieve sebagai penarik air. Universitas Indonesia 4 Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 2 Pada penelitian ini, dilakukan sintesis ester asam lemak sukrosa menggunakan lipase yang diimmobilisasi menggunakan media silika gel 60. Asam lemak diperoleh dari hidrolisis minyak kelapa. Lipase yang telah diimmobilisasi ditentukan % loading dan efisiensi immobilisasinya. Dalam penelitian ini, dilakukan juga penentuan aktiviats dari free lipase sebagai pembanding. Lipase terimmobilisasi dengan efisiensi optimum kemudian digunakan untuk reaksi esterifikasi. Produk hasil esterifikasi dikarakterisasi dengan instrumentasi FT-IR dan dilakukan uji kualitatif emulsifier sederhana. Untuk menghasilkan produk ester asam lemak sukrosa dengan persentase konversi yang tinggi, perlu dilakukan studi optimasi kondisi reaksi esterifikasi, yang meliputi optimasi waktu reaksi, temperatur reaksi, perbandingan konsentrasi antara sukrosa dengan asam lemak hasil hidrolisis minyak kelapa, dan penggunaan molecular sieve untuk penarik air, karena esterifikasi berada pada kondisi sedikit air. 1.2 Perumusan Masalah Lipase yang berasal dari Candida rugosa dapat digunakan sebagai katalis dalam reaksi esterifikasi antara sukrosa dengan asam lemak minyak kelapa. Kebutuhan enzim lipase yang semakin meningkat akan mengakibatkan penggunaan lipase yang tidak terbatas, sehingga dibutuhkan teknik immobilisasi enzim untuk mengefisiensikan penggunaan lipase tersebut. Pada penelitian ini dilakukan studi mengenai aktivitas katalitik lipase Candida rugosa yang telah diimmobilisasi dalam matriks silika gel 60 pada reaksi esterifikasi tersebut dan melihat bagaimana pengaruh immobilisasi terhadap peningkatan katalitik lipase. Untuk memperoleh % konversi esterifikasi yang cukup tinggi, digunakan molecular sieve sebagai penarik air dan dilihat pengaruhnya dalam peningkatan reaksi esterifikasi. Selain itu, ditentukan juga kondisi optimum untuk reaksi esterifikasi antara sukrosa dengan asam lemak hasil hidrolisis minyak kelapa. Produk esterifikasi yang terbentuk, dikarakterisasi dan diuji emulsifier sederhana sehingga dapat ditentukan apakah produk esterifikasi tersebut dapat bertindak sebagai emulsifier atau tidak. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 3 1.3 Tujuan Penelitian 1. Mengetahui apakah lipase terimmobilisasi dapat digunakan sebagai katalis dalam reaksi esterifikasi antara sukrosa dengan asam lemak hasil hidrolisis minyak kelapa. 2. Melihat pengaruh immobilisasi terhadap peningkatan katalitik enzim lipase dan pengaruh penggunaan molecular sieve dalam peningkatan reaksi esterifikasi. 3. Mencari kondisi optimum dari reaksi esterifikasi antara sukrosa dengan asam lemak minyak kelapa dengan bantuan enzim lipase terimmobilisasi sebagai katalis. 1.4 Hipotesis 1. Lipase Candida rugosa dapat digunakan sebagai katalis dalam reaksi esterifikasi antara sukrosa dengan asam lemak hasil hidrolisis minyak kelapa. 2. Immobilisasi enzim dengan silika gel 60 dapat mempertahankan aktivitas katalitik enzim. 3. Waktu reaksi, temperatur, molecular sieve serta perbandingan konsentrasi sukrosa dengan asam lemak dapat berpengaruh terhadap sintesis ester asam lemak sukrosa. 4. Ester sukrosa dengan derajat substitusi rendah dapat berperan sebagai emulsifier. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tanaman Kelapa Tanaman kelapa (Cocos nucifera L) merupakan tanaman serbaguna atau tanaman yang mempunyai nilai ekonomi tinggi. Pohon kelapa sering disebut pohon kehidupan (tree of life) karena hampir seluruh bagian dari pohon, akar, batang, daun, dan buahnya dapat dipergunakan untuk kebutuhan kehidupan manusia sehari-hari (http://lc.bppt.go.id/iptek/index.php). Gambar 2.1 menunjukkan bentuk fisik dari tanaman kelapa. Taksonomi dari tumbuhan kelapa adalah sebagai berikut : Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Super Divisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Sub Kelas : Arecidae Ordo : Arecales Famili : Arecaceae Genus : Cocos Spesies : Cocos nucifera L Gambar 2.1 Tanaman Kelapa (www.plantamor.com) 2.2 Minyak Kelapa Minyak kelapa adalah minyak nabati yang berasal dari daging buah kelapa tua, baik dalam bentuk segar maupun daging kering (kopra). Minyak ini merupakan senyawa netral dan larut dalam pelarut minyak yang umumnya tidak larut dalam air. Minyak kelapa adalah ester dari gliserol dengan berbagai asam monokarboksilat berantai lurus, yang dikenal dengan nama asam lemak, yang terbagi dalam asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh (Gazuini, 1993). Gambar 2.2 menunjukkan bentuk fisik kopra, penghasil buah kelapa. Universitas Indonesia 23 Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 5 Gambar 2.2 Daging Buah Kelapa (Kopra), Penghasil Minyak Kelapa [Sumber : www.coconutmic.com/id/produksi/buahkelapa] Minyak kelapa merupakan sumber utama asam laurat, karena memiliki kandungan asam laurat lebih dari 50 %. Tabel 2.1 memperlihatkan komposisi asam lemak dari minyak kelapa. Tabel 2.1 Komposisi Asam Lemak Minyak Kelapa [Sumber: Ketaren, 1986] Pada Tabel 2.1 terlihat bahwa minyak kelapa memiliki asam lemak jenuh sekitar 92% , hanya sekitar 8% yang berupa asam lemak tak jenuh yaitu oleat dan linoleat. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 6 2.3 Asam Lemak Asam lemak ialah asam yang diperoleh dari penyabunan minyak dan lemak, yang merupakan asam organik berantai panjang yang memiliki atom karbon dari 4 sampai 24. Senyawa ini memiliki gugus karboksil tunggal dan ekor hidrokarbon non polar yang panjang, yang menyebabkan kebanyakan lipid tidak larut dalam air dan tampak berminyak atau berlemak (Hart, Craine, Hart, 2003). Asam lemak tidak terdapat secara bebas atau berbentuk tunggal di dalam sel atau jaringan, tetapi terdapat dalam bentuk yang terikat secara kovalen pada berbagai kelas lipida yang berbeda. Namun, asam lemak dapat dibebaskan dari ikatan ini oleh hidrolisis secara kimiawi ataupun enzimatik. (Albert L. Lehninger, 2005). Hampir semua asam lemak di alam memiliki jumlah atom karbon genap dan yang paling dominan adalah 16-18 atom karbon. Asam lemak yang umum dijumpai bersifat tidak larut dalam air, tetapi dapat terdispersi menjadi misel di dalam NaOH atau KOH encer yang mengubah asam lemak menjadi sabun. (Albert L. Lehninger, 2005). Sifat fisika asam lemak bergantung pada komposisi asam lemak pembentuknya. Titik didih asam lemak bertambah dengan kenaikan berat molekul asam lemak. Asam lemak tidak jenuh dengan jumlah atom C yang sama dengan asam lemak jenuh memiliki titik didih yang lebih rendah (Lurgi, 1989). Titik beku asam lemak bertambah dengan pertambahan berat molekul dan berkurang dengan pertambahan ketidakjenuhan asam lemak. Titik beku dapat dikorelasikan dengan tingkat ketidakjenuhan suatu asam lemak dan digunakan secara luas untuk mengidentifikasikan kemurnian asam lemak (Unichema International, 1998). 2.4 Sukrosa Salah satu disakarida komersial yang paling penting ialah sukrosa (C11H22O11), yang biasa dikenal sebagai gula pasir, karena lebih dari 100 juta ton diproduksi setiap tahun di dunia. Sukrosa terjadi dalam semua tumbuhan fotosintetik, yang berfungsi sebagai sumber energi. Senyawa ini diperoleh secara komersial dari batang tebu dan bit gula, yang kadarnya 14-20% dari cairan tumbuhan tersebut (Harold Hart, Lesie E. Craine, dan David J. Hart, 2003). Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 7 Sukrosa merupakan disakarida yang disintesis dari monosakarida Dglukosa dan D-fruktosa melalui ikatan glikosidik. Ikatan ini menghubungkan atom C-1 anomerik dari α-D-glukosa dan C-2 anomerik dari β-D-fruktosa, melalui suatu jembatan oksigen yang menghasilkan suatu ikatan α-(1-2). Dalam struktur sukrosa - baik glukosa maupun fruktosa yang menyusunnya - tidak memiliki gugus hemiasetal, sehingga sukrosa di dalam air tidak berada pada keadaan kesetimbangan dengan suatu bentuk aldehid atau keton. (Albert L. Lehninger, 2005). Gambar 2.3 menunjukkan struktur formula dari sukrosa. Sukrosa α-D-glukopiranosa-β-D-fruktofuranosa Glu(α1↔β2)Fru Gambar 2.3 Struktur Sukrosa [Sumber: Lehninger, 2005 (dengan pengolahan kembali)] 2.5 Enzim Enzim merupakan suatu biomolekul yang memiliki kemampuan untuk mengkatalisis suatu reaksi kimia tanpa habis bereaksi. Dalam beberapa sumber, enzim diartikan sebagai katalis biologis yang diperlukan oleh semua sel hidup untuk melaksanakan reaksi biokimia, di dalam maupun di luar sel, dan juga berperan mendukung hampir semua reaksi kimia untuk mempertahankan homeostasis tubuh. Enzim umumnya berupa protein, kecuali ribozym, yang bekerja dengan cara mengikat reaktan (substrat) kemudian mengubahnya menjadi produk, lalu melepaskan produk tersebut dengan membebaskan kembali enzimnya. Substrat tersebut diikat pada sisi pengikatan yang spesifik dari molekul enzim, melalui interaksi dengan residu asam amino yang menyusun enzim tersebut (Albert L. Lehninger, 2005). Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 8 Banyak enzim memerlukan molekul kecil non-protein sebagai kofaktor / koenzim untuk aktivitas katalitiknya. Koenzim adalah suatu senyawa organik yang terikat lemah (non-kovalen), umumnya berupa vitamin yang termodifikasi (misalnya thiamin pirofosfat, piridoksal fosfat, NADH), sedangkan kofaktor adalah ion anorganik yang jumlahnya satu atau lebih seperti Fe2+, Mg2+, Mn2+, atau Zn2+. Pada beberapa enzim, koenzim atau ion logam terikat kuat / terikat secara permanen yang disebut gugus prostetik. Enzim yang strukturnya sempurna dan aktif mengkatalisis bersama dengan koenzim / gugus logamnya disebut holoenzim. Koenzim dan ion logam bersifat stabil sewaktu pemanasan, sedangkan bagian protein enzim yang disebut apoenzim terdenaturasi oleh pemanasan. (Albert L. Lehninger, 2005). APOENZIM protein (inaktif) + KOENZIM non-protein → HOLOENZIM enzim aktif 2.5.1 Klasifikasi Enzim Pada umumnya, enzim diberi nama dengan menambahkan akhiran –ase kepada nama substratnya, tetapi banyak enzim yang telah dinamakan dengan tidak menerangkan substratnya, seperti pepsin dan tripsin. (Albert L. Lehninger, 2005). Tabel 2.2 berikut ini menunjukkan klasifikasi enzim secara internasional : Kelas Enzim Tabel 2.2. Klasifikasi Enzim Tipe Reaksi Oksidoreduktase Mengkatalisis reaksi redoks (transfer elektron atau proton) Transferase Transfer atom atau gugus dari suatu substrat ke lainnya Hidrolase Reaksi hidrolisis Liase Pelepasan gugus dari suatu substrat selain dengan cara hidrolisis, sering meninggalkan ikatan rangkap Isomerase Reaksi isomerasi Ligase Pembentukan ikatan baru yang disertai dengan pemutusan ATP atau nukleosida trifosfat lainnya [Sumber: Albert. L. Lehninger, Principle of Biochemistry, 2005] Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 9 2.5.2 Kerja Enzim Enzim bekerja dengan cara bereaksi dengan molekul substrat untuk menghasilkan senyawa intermediet melalui suatu reaksi kimia organik. Enzim meningkatkan kecepatan reaksi kimia dengan menurunkan energi aktivasi. Energi aktivasi adalah jumlah energi dalam kalori yang diperlukan untuk membawa semua molekul pada 1 mol senyawa pada suhu tertentu menuju tingkat transisi pada puncak batas energi. E+S ↔ ES ↔ ES* ↔ P+E dengan E : enzim, S: substrat, ES: kompleks enzim substrat, ES*: senyawa antara pada keadaan transisi, P: produk (Albert L. Lehninger, 2005). Gambar 2.4 merupakan ilustrasi yang menggambarkan fenomena tersebut. E n e r g i Tanpa Katalis Dengan Katalis Kecepatan Reaksi Gambar 2.4 Penurunan Energi Aktivasi oleh Enzim [Sumber: Harper’s Ilustrated Biochemistry, 2003 (dengan pengolahan kembali)] Kerja suatu enzim bersifat spesifik terhadap reaksi yang dikatalisisnya. Pada umumnya, terdapat empat tipe spesifisitas enzim, yaitu: Spesifik absolut : satu enzim hanya mengkatalisis satu substrat (reaksi). Spesifik ikatan : enzim hanya mengkatalisis satu tipe reaksi tertentu dengan substrat yang memiliki ikatan tertentu. Spesifik gugus fungsi : enzim hanya mengkatalisis substrat dengan gugus fungsi tertentu (asam amino, fosfat, metil). Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 10 Spesifik stereokimia : enzim hanya mengkatalisis substrat dengan stereokimia tertentu. Ada dua hipotesis tentang cara kerja enzim, yaitu model lock and key dan model induced fit. Mekanisme lock and key dikemukakan oleh seorang ilmuwan berkebangsaan Jerman bernama Emil Fischer. Pada model lock and key, substrat atau bagian substrat harus mempunyai bentuk yang sangat tepat dengan sisi katalitik enzim. Substrat ditarik oleh sisi katalitik enzim yang cocok untuk substrat tersebut, sehingga terbentuk kompleks enzim substrat. Pada model induced fit, lokasi aktif beberapa enzim mempunyai konfigurasi yang tidak kaku. Enzim berubah bentuk menyesuaikan diri dengan bentuk substrat setelah terjadi pengikatan. Jadi, tautan yang cocok pada keduanya dapat diinduksi ketika terbentuk kompleks enzim-substrat. Gambar 2.5 menunjukkan mekanisme kerja enzim dengan model lock and key dan induced fit: 1. Model Lock and Key 2. Model Induced Fit Gambar 2.5 Mekanisme Kerja Enzim (1) Model Lock and Key, (2) Model Induced Fit [Sumber: kimia.upi.edu (dengan pengolahan kembali)] Dalam melakukan aktivitasnya sebagai katalis, enzim harus berada pada kondisi yang sesuai, sehingga kerja enzim menjadi optimal. Ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas katalisis enzim, di antaranya: Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 11 Konsentrasi substrat : pada konsentrasi enzim yang konstan sampai batas tertentu, jika konsentrasi substrat relatif rendah, maka laju reaksi meningkat secara linier dengan bertambahnya konsentrasi substrat. pH : setiap enzim memiliki pH optimum dan pada pH tersebut laju reaksi katalisis maksimum. Pada perubahan pH yang lebih rendah dari nilai pH optimum, aktivitas katalitik enzim cenderung menurun, karena terjadi perubahan ionisasi dari gugus fungsi pada pusat aktif enzim, sedangkan pada perubahan pH yang besar, akan terjadi denaturasi protein enzim. Suhu / temperatur : meningkatnya temperatur akan meningkatkan laju reaksi, karena kenaikan temperatur akan meningkatkan energi kinetik molekul-molekul. Di atas temperatur optimumnya, enzim akan terdenaturasi sehingga menurunkan aktivitas katalitiknya. Konsentrasi enzim : konsentrasi enzim berbanding lurus dengan laju reaksi. Semakin tinggi konsentrasi enzim maka laju reaksi juga akan meningkat. Aktivator dan inhibitor : aktivator adalah senyawa yang dapat meningkatkan aktivitas enzim, misalnya Zn2+ merupakan aktivator enzim karbonik anhidrase, sedangkan inhibitor adalah senyawa yang dapat menghambat aktivitas enzim. (Albert L.Lehninger, 2005). 2.6 Lipase Lipase (triasilgliserol ester hidrolase, EC. 3.1.1.3) adalah enzim yang memilki kemampuan mensintesis minyak atau lemak. Lipase juga mengkatalisis hidrolisis triasilgliserol pada interfase minyak dalam air dan akan membentuk ikatan ester pada lingkungan dengan kondisi sedikit air. Reaksi yang mungkin terjadi pada kondisi lingkungan tersebut adalah esterifikasi, transesterifikasi, polimerisasi, laktonisasi (Divakar dan Manohar, 2007). Reaksi yang dikatalisis oleh lipase berlangsung pada sisi aktif enzim. Sisi aktif lipase terdiri atas trio residu asam amino yaitu serin, histidin, dan aspartat. Dalam struktur enzim, sisi aktif ini tersembunyi di balik suatu tutup, Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 12 yaitu polipeptida yang sering disebut lid enzim. Secara fisiologis lid enzim tersebut berfungsi untuk mencegah kerusakan proteolitik asam-asam amino sisi aktif, yang akan berdampak negatif terhadap aktivitas enzim. Lid bersifat fleksibel dan pada waktu membuka menyebabkan substrat dapat mencapai sisi aktif enzim. Lid mengandung residu triptofan (Trp) yang bersifat nonpolar. Pada saat enzim inaktif, sisi aktif lipase masih berada dalam keadaan tertutup karena lid berinteraksi dengan residu hidrofobik di sekitar inti katalitik. Keberadaan lingkungan hidrofobik (nonpolar) di sekitar enzim akan memberikan kesempatan bagi lid untuk membuka, karena adanya interaksi antara area nonpolar lid dengan lingkungan hidrofobik. Perubahan struktur yang menyebabkan terbukanya sisi aktif ini, menyebabkan substrat mudah untuk berafinitas dengan sisi aktif lipase, sehingga terjadi proses katalisis. (Brady et al, 1990). Gambar 2.6 menunjukkan struktur tiga dimensi dari lipase. Gambar 2.6 Struktur tiga dimensi Lipase [Sumber: Bei Gao,et.al., 2010] Lipase dapat diperoleh dari hewan, mikroorganisme, dan tumbuhan. Lipase yang berasal dari mikroorganisme lebih umum digunakan, baik untuk kebutuhan laboratorium maupun industri. Keuntungan memproduksi lipase dari mikroorganisme adalah produksi enzim dapat ditingkatkan dalam skala besar dalam ruangan yang relatif terbatas. Salah satu mikroorganisme yang mampu menghasilkan lipase dengan aktivitas yang cukup tinggi adalah khamir Candida Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 13 rugosa, karena khamir ini memiliki kemampuan hidup di berbagai lingkungan yang terdapat kandungan makanan atau nutrisi yang kompleks (Banu OZTURK, 2001). Oleh sebab itu, pada penelitian ini digunakan lipase yang berasal dari Candida rugosa. Keunggulan reaksi enzimatis dibandingkan reaksi kimia biasa adalah spesifisitasnya. Spesifisitas enzim adalah kemampuan suatu enzim untuk mendiskriminasi substrat-substratnya berdasarkan perbedaan afinitas substrat dalam mencapai sisi aktif enzim, membentuk kompleks enzim-substrat, dan akhirnya membentuk produk. Spesifisitas suatu enzim merupakan ciri khas yang berkaitan dengan struktur tiga dimensi yang dimiliki oleh enzim tersebut. Spesifisitas lipase terhadap substrat dapat diklasifikasikan sebagai berikut: Spesifisitas jenis lipid, yaitu kemampuan lipase untuk bereaksi dengan jenis lipid tertentu. Misalnya, lipase asal pankreas memiliki tingkat hidrolisis terhadap triasilgliserol lebih tinggi dibandingkan diasilgliserol dan monoasilgliserol. Spesifisitas posisi, yaitu kemampuan lipase untuk menghidrolisis ikatan ester pada triasilgliserol pada posisi primer (sn-1 dan sn-3) atau posisi sekunder (sn-2). Produk yang dihasilkan tidak hanya asam lemak bebas dan gliserol, melainkan juga monogliserida dan digliserida. Spesifisitas asam lemak, yaitu berdasarkan pada panjang rantai dan / atau derajat ketidakjenuhan asam lemak. Spesifisitas alkohol, yaitu berhubungan dengan reaksi sintesis ester karena setiap lipase memiliki perbedaan dalam aktivitas esterifikasinya terhadap jenis alkohol. (Banu OZTURK, 2001). 2.7 Immobilisasi Enzim Sebagian enzim berada tidak dalam keadaan bebasnya, terutama dalam struktur membran sel, atau yang biasa disebut in vivo. Immobilisasi enzim artinya membuat enzim mendekati keadaan in vivo, sehingga enzim tersebut memiliki efisiensi dan stabilitas yang baik, dapat dipakai berulang kali, ekonomis (untuk Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 14 industri), dan secara teknologi dapat dikontrol dengan baik. Terdapat empat metode immobilisasi enzim, yaitu inklusi dalam matriks (gel, polimer, mikro kapsul, dan serat), adsorpsi dengan media interaksi sekunder pada suport organik dan mineral, melalui ikatan kovalen, dan enkapsulasi (P.W.Carr dan L.D Bowers, 1980). Prinsip immobilisasi inklusi adalah mengikat atau menjebak enzim dalam suatu matriks secara fisik. Kelebihan metode ini adalah reaksi polimerisasi/gelifikasi sudah banyak dikenal, resiko denaturasi kecil, dan dapat digunakan untuk semua enzim. Kekurangan dari metode ini adalah adanya lokalisasi enzim dalam polimer, problem sterik untuk difusi, dan terkadang sifat mekanik gel kurang baik terutama untuk reaktor tetap. Prinsip dari imobilisasi adsorpsi adalah retensi enzim pada permukaan fase solid melalui interaksi sekunder antara gugus fungsi enzim dengan suport. Interaksi yang terjadi dapat berupa ikatan hidrogen, Van der Waals, ikatan ionik, transfer muatan, pertukaran ligan, dan chemosorption. Kelebihan metode ini adalah proses adsorpsi cukup sederhana yaitu hanya dengan melakukan kontak antara enzim dengan suport. Jika aktivitas enzim menurun dapat dilakukan regenerasi dengan cara desorpsi dan diganti dengan enzim aktif. Kelemahan metode ini adalah resiko desorpsi yang cukup tinggi, afinitas enzim terhadap suport sangat bergantung pada gugus fungsi di permukaan enzim, problem sterik, dan kapasitas adsorpsi juga sangat bergantung pada luas permukaan suport yang tersedia (P.W.Carr dan L.D Bowers, 1980). Immobilisasi kovalen memiliki kelebihan utama yaitu kemungkinan desorpsi pada immobilisasi dapat dihindari dengan cara pembentukan ikatan kovalen. Ada dua metode pada immobilisasi ini yaitu dengan suport dan tanpa suport. Kelebihan lain dari metode immobilisasi ini adalah kuat ikatannya terhadap pencucian, variasi pH, dan kuat ion, metode aktivasi dan rendemen yang baik, strukturnya rigid, serta resisten terhadap denaturasi. Kekurangan dari metode imobilisasi ini adalah reaksi lebih kompleks, suport organik kurang memberikan sifat mekanik yang baik dan sensitif terhadap mikroorganisme, Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 15 suport mineral mempunyai sifat mekanik lebih baik tetapi dengan kapasitas penggabungan yang lebih rendah. (P.W. Carr dan L.D. Bowers, 1980). Teknik mikroenkapsulasi adalah suatu teknik yang menggunakan enzim atau sel mikroba yang dilingkupi oleh membran polimer semipermeabel yang bulat dengan diameter 1-100 μm. Walaupun molekul enzim atau sel mikroba dilingkupi oleh membran, substrat maupun produk dapat berdifusi secara bebas melalui membran. Bahan yang digunakan adalah liposom-polimer (Cao, 2005). Ilustrasi dari keempat metode immobilisasi enzim ditunjukkan pada Gambar 2.7. a. Metode Adsorpsi b. Metode Ikatan Kovalen c. Metode Entrapment d. Metode Enkapsulasi Gambar 2.7 Metode Immobilisasi Enzim (a) Adsorpsi, (b) Ikatan Kovalen, (c) Entrapment, (d) Enkapsulasi Enzim [Sumber: Josh Haacker’s Illustrated, 2007 dalam Ichiro Chibata (1978) (dengan pengolahan kembali)] 2.8 Silika Gel Silika gel merupakan bentuk silika (SiO2) yang memiliki pori dan amorphous. Material ini tersusun dari kumpulan jaringan pori mikroskopis yang saling berhubungan, dengan luas permukaan 700-800 m2/g. Silika gel memiliki pori yang besar dengan diameter antara 5-3000 Å. Struktur inilah yang memberikan kemampuan silika gel dapat bertindak sebagai media pengabsorb (desiccant). Molekul air melekat pada permukaan gel karena gel ini memiliki tekanan uap yang lebih rendah daripada udara sekelilingnya. Saat kesetimbangan tekanan tercapai, tak ada lagi adsorpsi yang muncul. Dengan demikian, lebih Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 16 tinggi kelembaban udara lingkungan, akan lebih banyak jumlah air yang teradsorpsi. (Steven Weintaurb, 2002). Silika gel memiliki banyak sifat, di antaranya : Dapat mengadsorpsi uap air 1-3 kali beratnya sendiri. Dapat diregenerasi dan digunakan kembali jika diperlukan, yaitu dengan memanaskan silika gel akan menghilangkan uap air yang teradsorpsi dan dapat dipakai kembali. Merupakan materi yang sangat inert, tidak dapat bereaksi secara normal dengan materi lain, dengan pengecualian unsur alkali yang kuat serta asam hidroflourik. Merupakan materi yang tidak beracun dan tidak terbakar. (Praswati PDK Wulan, 2007). Silika biasanya dimanfaatkan untuk berbagai keperluan dengan berbagai ukuran bergantung aplikasi yang dibutuhkan. Sebagai contoh dalam industri ban, karet, gelas, semen, beton, keramik, tekstil, kertas, kosmetik, elektronik, cat, film, pasta gigi, dan lain-lain. Untuk proses penghalusan atau memperkecil ukuran dari silika umumnya digunakan metode milling. Silika dengan ukuran yang halus inilah yang biasanya banyak digunakan dalam industri. Pada penelitian ini digunakan silika gel 60 sebagai media immobilisasi enzim, dengan ukuran pori 0,040-0,063 mm (230-400 mesh). 2.9 Molecular Sieve Molecular sieve adalah unit material yang memiliki pori-pori kecil atau halus dengan ukuran yang telah distandarisasi dan diseragamkan. Pori-pori tersebut dapat dengan selektif melanjutkan atau menangkap molekul-molekul yang lewat berdasarkan besar-kecilnya ukuran molekul. Atas cara kerjanya tersebut material ini sering disebut sebagai desiccant. Kemampuan molecular sieve dalam menangkap molekul H2O cukup tinggi, yaitu sampai 20-25% dari berat molecular sieve. Molecular sieve dapat diregenerasi dengan metoda pemanasan dan purging. Jenis molecular sieve yang banyak digunakan untuk menangkap H2O adalah silika gel. Jenis-jenis lain yang banyak digunakan di Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 17 industri adalah zeolite, alumina, lime, dan karbon aktif. (Migas Indonesia, 2007). Gambar 2.8 menggambarkan bentuk fisik dari molecular sieve. Gambar 2.8 Molecular sieve [Sumber: Caledon, 1993] Berdasarkan kemampuan adsorbsinya, molecular sieve dapat dibagi menjadi 5 tipe, yaitu: Tipe 3A , yaitu yang memiliki pori sebesar 3 Å dan merupakan adsorben untuk NH3, H2O, dan cairan yang bersifat polar. Tipe 4A, yaitu yang memiliki pori sebesar 4 Å dan merupakan adsorben untuk H2O, CO2, SO2, H2S, C2H4, C2H6, C3H6, etanol, cairan yang bersifat nonpolar dan gas. Tipe 5A, yaitu yang memiliki pori sebesar 5 Å dan merupakan adsorben untuk senyawa hidrokarbon (sampai n-C4H10), alkohol (sampai C4H9OH), dan mercaptan (sampai C4H9SH). Tipe 10x, yaitu yang memiliki pori sebesar 8 Å dan merupakan adsorben untuk senyawa hidrokarbon bercabang dan aromatik. Tipe 13x, yaitu yang memiliki pori sebesar 10 Å dan merupakan adsorben untuk di-n-butilamin, tetap tidak untuk tri-n-butilamin. Dalam beberapa penelitian, molecular sieve bekerja layaknya adsorben yang dapat menarik air, sehingga mencegah terjadinya reaksi hidrolisis dan dapat mendorong kesetimbangan bergeser ke arah esterifikasi. Oleh karena itu, molecular sieve digunakan untuk penyaringan hasil reaksi esterifikasi. (Verma, dkk, 2011). Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 18 2.10 Esterifikasi Ester adalah turunan asam karboksilat, dengan gugus hidroksi (-OH) dari asam karboksilat digantikan oleh gugus alkoksi (-OR). Kebanyakan ester merupakan zat yang berbau enak, menyebabkan cita rasa dan harum dari banyak buah-buahan dan bunga, seperti pentil asetat yang berbau pisang. Campuran ester digunakan dalam parfum dan cita rasa buatan (Hart, Craine, Hart, 2003). Reaksi pembentukan suatu ester disebut sebagai reaksi esterifikasi. Reaksi ini berlangsung antara asam karboksilat dengan alkohol. Bila dilakukan tanpa katalis, maka reaksi ini akan berjalan dengan lambat. Reaksi esterifikasi biasanya menggunakan katalis asam kuat seperti H2SO4. Reaksi esterifikasi yang berkataliskan asam merupakan reaksi yang reversibel, sehingga untuk memperoleh hasil yang tinggi, kesetimbangan harus bergeser ke arah produk. (Devidek, 1990). Menurut prinsip Le Chatelier, penambahan salah satu reaktan secara berlebihan pada sistem kesetimbangan menyebabkan pergeseran reaksi yang mengarah ke pembentukan produk. Selain dengan katalis asam, reaksi esterifikasi juga dapat berlangsung dengan bantuan enzim sebagai katalis. Gambar 2.9 berikut menunjukkan gambaran reaksi esterifikasi dengan katalis asam: Gambar 2.9 Reaksi esterifikasi dengan katalis asam [Sumber: Harold Hart, Lesie Craine, dan David J. Hart, 2003] Reaksi esterifikasi secara enzimatis lebih banyak digunakan karena sintesis secara enzimatis membutuhkan kondisi reaksi yang lunak (pada suhu dan tekanan rendah), ramah lingkungan, memiliki efisiensi katalisis yang tinggi, serta memilki regioselektifitas yang tinggi sehingga meminimalisasi terbentuknya produk samping (Sakidja, 1998). Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 19 Salah satu korelasi terbaik antara aktivitas enzim lipase dalam reaksi esterifikasi adalah hidrofobisitas pelarut (Laane et al., 1987). Parameter hidrofobisitas pelarut dapat ditentukan dengan menggunakan nilai log P. Fungsi log P adalah untuk mengetahui kecenderungan proporsional antara aktivitas katalitik yang tinggi dengan hidrofobisitas yang tinggi pula. (Reslow, et al. 1987 dan Singh 2007). Pada umumnya, aktivitas katalisis suatu biokatalisis dibagi atas: (i) tinggi pada pelarut dengan nilai log P >4 (misalnya dekanol, heksadekana, heptana, oktana) (ii) sedang pada pelarut dengan nilai log P antara 2 dan 4 ( misalnya heptanol, toluen, oktanol, heksana) (iii) rendah pada pelarut dengan nilai log P dibawah 2 (misalnya alkohol-alkohol rantai pendek serta pelarut organik larut air) (Laane et.al, 1987). Pada penelitian ini, hal yang perlu diperhatikan dalam memilih pelarut adalah tingkat perbedaan kepolaran dengan sukrosa. Sukrosa merupakan senyawa yang bersifat polar, sehingga semakin besar nilai log P dari pelarut, maka perbedaan kepolaran antara sukrosa dengan pelarut akan semakin tinggi, sehingga kemungkinan terjadinya kontak antara sukrosa dengan asam lemak minyak kelapa akan semakin kecil. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya mengenai reaksi esterifikasi enzimatis menggunakan enzim lipase, diketahui bahwa pelarut organik yang memberikan persentase konversi tertinggi adalah nheksana. n-Heksana merupakan pelarut organik yang memiliki nilai log P = 3,5 (Syamsul, et al, 2010). Oleh karena itulah pada reaksi esterifikasi kali ini digunakan pelarut n-heksana. 2.11. Ester Asam Lemak Sukrosa Ester asam lemak sukrosa merupakan ester non-ionikyang memiliki gugus yang bersifat lipofilik dan hidrofilik. Ester ini bersifat tidak dapat dicerna (nondigestible), tidak dapat diserap, dan merupakan bahan yang sifat fisik dan kimianya menyerupai minyak atau lemak konvensional (Akoh dan Swanson, 1994). Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 20 Sifat ester sukrosa bergantung pada derajat esterifikasi dari sukrosa. Semakin tinggi derajat esterifikasinya, ester sukrosa semakin mendekati sifat lipofilik. Semakin pendek dan tidak jenuh kostituen asam lemak, ester sukrosa akan semakin bersifat hidrofilik. Derajat esterifikasi dan kostituen asam lemak akan menghasilkan sifat fungsional dan sifat fisiko-kimia yang berbeda dari ester sukrosa (Harringan dan Breene, 1989). Hubungan antara derajat esterifikasi dengan ester sukrosa asam lemak ditunjukkan pada Gambar 2.10. Gambar 2.10 Hubungan Derajat Esterifikasi dengan Sifat Ester Sukrosa [Sumber: Harringan dan Breene, 1989] Ester asam lemak sukrosa memiliki banyak kegunaan bergantung pada derajat substitusinya. Ester sukrosa dengan derajat substitusi 1-3 dapat digunakan sebagai emulsifier non-ionik karena memilki karakteristik emulsifying, solubilizing, dan foaming yang baik. Selain itu, ester sukrosa memiliki sifat biodegradable yang baik dan ramah lingkungan, tidak toksik, tidak menyebabkan iritasi kulit, tidak berbau dan tidak berasa, karena berasal dari bahan alami, yaitu sukrosa dan asam lemak. Ester sukrosa dapat diaplikasikan secara luas dalam bidang industri makanan, detergen, kosmetik, dll. (Rakmi, 2000). Gambar 2.11 menunjukkan struktur poliester sukrosa: Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 21 Olestra Poliester Sukrosa dengan 6-8 Asam Lemak Gambar 2.11 Struktur Polieser Sukrosa atau Olestra [Sumber: extoxnet.orst.edu] Ester sukrosa asam lemak digunakan sebagai emulsifier dalam sistem minyak dalam air (o/w) dan air dalam minyak (w/o). Salah satu faktor yang mempengaruhi jenis emulsi tersebut adalah derajat substitusi dari ester sukrosa yang digunakan. Karakteristik dari surfaktan / emulsifier dapat diklasifikasikan berdasarkan nilai Hydrophilic-Lipophilic Balance (HLB). Pada ester asam lemak sukrosa, klasifikasi HLB didasarkan pada gugus asil (bercabang atau tidak), derajat esterifikasi (mono, di-, tri-, dan seterusnya), serta pada derajat polimerisasi karbohidrat (monosakarida atau disakarida) (Whitehurst, 2004). Pada Gambar 2.12 ditunjukkan hubungan HLB dengan emulsifiers. HLB dan Emulsifier dalam Minyak / Air minyak air Hidrofilik Kesetimbangan Lipofilik HLB tinggi HLB tepat HLB rendah Gambar 2.12 Hubungan HLB dan Emulsifiers [Sumber: Whitehurst, 2004 (dengan pengolahan kembali)] 2.12 Emulsifier Emulsifier atau zat pengemulsi didefinisikan sebagai senyawa yang mempunyai aktivitas permukaan (surface-active agents) sehingga dapat Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 22 menurunkan tegangan permukaan (surface tension) antara udara-cairan dan cairan-cairan yang terdapat dalam suatu sistem. Kemampuannya menurunkan tegangan permukaan menjadi hal menarik karena emulsifier memiliki keunikan struktur kimia yang mampu menyatukan dua senyawa berbeda polaritasnya. Daya kerja emulsifier mampu menurunkan tegangan permukaan yang dicirikan oleh bagian lipofilik (non-polar) dan hidrofilik (polar) yang terdapat pada struktur kimianya. Ukuran relatif bagian hidrofilik dan lipofilik zat pengemulsi menjadi faktor utama yang menentukan perilakunya dalam pengemulsian. Bila emulsifier tersebut lebih terikat pada air atau lebih larut dalam air (polar) maka dapat lebih membantu terjadinya dispersi minyak dalam air sehingga terjadilah emulsi minyak dalam air (o/w), contohnya susu. Bila emulsifier lebih larut dalam minyak (nonpolar) terjadilah emulsi air dalam minyak (w/o), contoh margarin dan mentega. (P.W. Atkins, 1999). 2.13 Instrumentasi FT-IR Spektroskopi infra merah adalah salah satu teknik spektroskopi yang banyak digunakan untuk analisis suatu senyawa. Tujuan utama dari spektroskopi ini adalah menentukan gugus fungsi yang ada pada suatu senyawa, karena setiap gugus fungsi memiliki karakteristik infra merah yang berbeda-beda. Absorbsi radiasi infra merah sesuai dengan tingkat energi vibrasi dan rotasi pada ikatan kovalen yang mengalami perubahan momen dipol dalam suatu molekul. Hal ini berarti hampir seluruh molekul yang berikatan kovalen dapat mengabsorbsi radiasi infra merah. Hanya molekul-molekul diatomik tertentu misalnya H2, N2, dan O2 yang tidak dapat mengabsorbsi infra merah, karena vibrasi dan rotasinya tidak menghasilkan perubahan momen dipol. Daerah spektrum elektronik infra merah terletak antara 13.000 sampai 10 cm-1, atau antara 0,78 sampai 1000 μm. Bila suatu molekul menyerap sinar IR maka di dalam molekul akan terjadi perubahan tingkat energi vibrasi/rotasi, tetapi hanya transisi vibrasi/rotasi yang dapat menyebabkan perubahan momen dipol yang aktif mengabsorbsi sinar IR (Sunardi, 2005). Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 BAB 3 METODE PENELITIAN Secara umum, penelitian ini terdiri atas beberapa tahapan, yaitu hidrolisis minyak kelapa untuk mendapatkan asam lemak, immobilisasi enzim lipase dengan silika gel 60, sintesis ester asam lemak sukrosa, analisis produk dengan instrumentasi FT-IR, dan uji sederhana produk hasil reaksi sebagai emulsifier. Optimasi reaksi esterifikasi dilakukan pada beberapa variabel yaitu optimasi waktu reaksi, suhu, perbandingan mmol antara sukrosa dengan asam lemak, dan berat molecular sieve. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia. Lipase Asam Lemak Hasil Hidrolisis Silika Gel Sukrosa Optimasi esterifikasi immobilisasi -waktu inkubasi -temperatur Enzim Terimmobilisasi - rasio substrat -molecular sieve Produk Ester Analisis: Gambar 3.1 Skematik Prosedur Kerja - FTIR - Derajat substitusi - Uji Emulsifier Universitas Indonesia 23 Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 24 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat-alat yang digunakan Pada penelitian ini, alat-alat yang digunakan meliputi alat-alat gelas yang digunakan di Laboratorium Biokimia seperti beaker glass, labu ukur, batang pengaduk, botol timbang, corong biasa, corong pisah, gelas ukur, pipet tetes, pipet ukur, pipet gondok, erlenmeyer, buret, labu bulat leher tiga, termometer, piknometer, tabung reaksi, dan tabung centrifuge. Selain itu juga digunakan spatula, bulb, neraca analitis, pH meter, hot plate stirrer, oven, horizontal incubator shaker, dan instrumentasi yang digunakan adalah FT-IR. 3.1.2 Bahan-bahan yang digunakan Enzim Enzim yang digunakan pada penelitian ini adalah lipase yang berasal dari Candida rugosa yang diperoleh dari Sigma-Aldrich dengan spesifikasi sebagai berikut: Bentuk fisik : padat Warna : kuning muda Aktivitas spesifik : 2,45 U/mg (1 U sesuai dengan banyaknya enzim yang menyebabkan penglepasan 1 Umol asam oleat dari triolein sebagai substrat per menit pada suhu 40oC dan pH 7). Minyak Kelapa, yang diperoleh dari salah satu supermarket yang ada di Kota Depok. Silika gel 60, yang diperoleh dari Merck, dengan spesifikasi: Bentuk fisik : butiran halus Warna : putih Ukuran pori : 0,040-0,063 mm, 230-400 mesh Bahan Kimia Bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini adalah sukrosa, KOH, etanol 95%, HCL 3N, aseton, n-heksana, Na2SO4 anhidrat, aquadest, buffer tris-HCl (0,05 M pH 7), NaOH 0,5 N, serta indikator fenolftalein, Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 25 pereaksi Lowry yang diperoleh dari Laboratorium Biokimia Departemen Kimia FMIPA UI dan CV Dwinika. Molecular sieve (3 Å x 1,5 mm). 3.2 Prosedur Penelitian 3.2.1 Hidrolisis asam lemak dari minyak kelapa Sebanyak 20 g minyak kelapa dimasukkan ke dalam labu bulat leher tiga, kemudian ke dalam minyak ditambahkan 100 mL KOH 1 M dalam alkohol 95%. Campuran ini kemudian dipanaskan dengan sistem refluks selama 1 jam pada suhu 62,20C, disertai pengadukan dengan magnetic stirrer. Setelah dipanaskan, ke dalam campuran ditambahkan 50 mL aquadest, kemudian ditambahkan 35 mL HCl 3 N. Setelah itu, dilakukan pemisahan antara fase organik yang merupakan asam lemak dengan fase air. Fase organik diekstraksi dengan 50 mL n-heksana sebanyak dua kali ekstraksi untuk menghilangkan fase air yang masih tercampur dengan asam lemak. Selanjutnya, ke dalam fase organik ditambahkan 1 g Na2SO4 anhidrat. Setelah itu, larutan tersebut didekantasi untuk memisahkan padatan Na2SO4. Selanjutnya, pelarut n-heksana diuapkan menggunakan rotary evaporator sampai filtrat yang dihasilkan pekat. 3.2.2 Penentuan Aktivitas Free Lipase Dalam labu erlenmeyer dicampurkan 0,425 mL sampel minyak kelapa, 7,65 mL buffer tris-HCl (0,1 M pH 7), dan 0,5 g gum Arabic, kemudian campuran diaduk sampai rata. Dalam labu erlenmeyer lainnya disiapkan 0,015 g enzim dalam 1,5 mL buffer tris HCl pH 7. Setelah itu kedua campuran dicampur, kemudian diinkubasi dalam horizontal incubator shaker 150 rpm pada suhu 300C selama 1 jam. Untuk tahap terminasi, campuran yang telah diinkubasi ditambahkan 10 mL larutan aseton : alkohol (1:1 v/v), kemudian diberikan 2-3 tetes indikator fenolftalein dan dititrasi dengan NaOH 0,5 N. Dilakukan hal yang sama untuk blanko (dengan larutan enzim yang sudah dinon-aktifkan dengan pemanasan). Aktivitas free lipase dihitung dengan persamaan: Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 26 ( − )× × 1000 × Keterangan: A = volume titrasi sampel B = volume titrasi blanko w = massa sampel minyak kelapa t = waktu inkubasi Dilakukan hal yang sama untuk sampel enzim yang telah terimmobilisasi, untuk menentukan aktivitas enzim terimmobilisasi. 3.2.3 Immobilisasi enzim dengan matriks Silika Gel 60 Sebelum lipase diimmobilisasi, matriks dicuci terlebih dahulu dengan air distilasi sebanyak tiga kali, kemudian diikuti dengan buffer tris-HCl (0,1 M, pH 7,0). Setelah itu, sekitar 40 mg lipase murni disuspensikan dalam 5 mL buffer tris-HCl (0,1 M, pH 7,0) dan ditambahkan ke dalam matriks silika gel 60, kemudian suspensi diinkubasi disertai pengadukan selama 3 jam pada suhu 370C dalam erlenmeyer. Selanjutnya, lipase terimmobilisasi dicuci kembali menggunakan tris buffer HCl (0,1 M, pH 7,0) sebanyak lima kali pencucian. Lipase yang telah diimmobilisasi disuspensikan dalam tris buffer pada suhu 40C sampai digunakan untuk prosedur selanjutnya. Pada penelitian ini diakukan variasi berat silika gel 60 terhadap lipase, yaitu sebanyak 100, 250, 500, 750, dan 1000 mg silika dengan melakukan pencucian terhadap lipase terimmobil dan yang tanpa pencucian. 3.2.4 Penentuan kadar protein enzim dengan metode Lowry Untuk penenetuan kadar protein enzim dan loading efficiency dari enzim yang terimmobilisasi digunakan metode Lowry. Disiapkan reagen pereaksi Lowry, yaitu: Reagen A : 2 g Na2CO3 dalam 100 mL NaOH 0,1 N Reagen B1 : 0,1 g CuSO4 dalam 10 mL aquadest Reagen B2 : 0,27 g natrium potassium tartrat dalam 10 mL aquadest Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 27 Untuk membuat pereaksi Lowry sebanyak 98 mL reagen A dicampurkan dengan 1 mL reagen B1 dan 1 ml reagen B2 dalam labu ukur 100 mL. Larutan standar yang digunakan adalah BSA 400 ppm. Volume larutan BSA divariasikan dari 0,1 hingga 0,5 mL. Kemudian masing-masing larutan standar ditambahkan dengan 5 mL pereaksi Lowry dan buffer tris HCl pH 7 hingga volumenya mencapai 6 mL. Campuran diaduk hingga homogen dan diinkubasi selama 10 menit. Ke dalam campuran ditambahkan 0,5 mL reagen Follin-Ciocalteu, diaduk hingga homogen dan diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Absorbansi standar BSA diukur dengan berbagai konsentrasi pada panjang gelombang 700 nm, dan dilakukan hal yang sama pada sampel filtrat lipase yang telah terimmobilisasi. Perhitungan loading efficiency enzim yang terimmobilisasi dapat ditentukan dengan persamaan: − × 100 % Keterangan: Ci = konsentrasi awal Vi = volume awal Cf = konsentrasi akhir Vf = volume akhir Untuk menentukan aktivitas spesifik dari enzim terimmobilisasi dapat ditentukan dengan persamaan : Aktivitas spesifik (U/mg) = 3.2.5 Esterifikasi asam lemak dengan karbohidrat menggunakan enzim terimmobilisasi Sukrosa 0,1 M , asam lemak, serta n-heksana sebagai pelarut dicampurkan ke dalam erlenmeyer 100 mL. Perbandingan volume sukrosa dan asam lemak hasil hidrolisis minyak kelapa yang ditambahkan adalah 1:3 mL yang sebanding dengan 1:120 mmol. n-Heksana yang dibutuhkan untuk reaksi adalah 1:1 terhadap volume substrat. Kemudian dilakukan inkubasi selama ± 10 menit dalam horizontal incubator shaker pada suhu reaksi yang dikehendaki. Setelah itu, dilakukan penambahan enzim lipase yang telah diimmobilisasi, dengan jumlah Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 28 enzim yang ditambahkan adalah 5% dari berat total substrat. Setelah itu dilakukan inkubasi kembali pada horizontal incubator shaker dengan kecepatan 200 rpm pada suhu dan waktu reaksi yang dibutuhkan. Percobaan dilakukan secara triplo dengan menyertakan blanko sebagai faktor koreksi. Untuk mengetahui pengaruh waktu reaksi, temperatur, serta rasio asam lemak hasil hidrolisis : sukrosa terhadap reaksi esterifikasi, dilakukan optimasi untuk variabel waktu reaksi yaitu pada 4, 8, 16, 32, dan 64 jam, serta temperatur reaksi pada 30, 35, 37, 40, serta 450C. Perbandingan konsentrasi antara asam lemak hasil hidrolisis dengan sukrosa dilakukan dengan mengubah jumlah asam lemak yang ditambahkan sedangkan sukrosa dibuat tetap. Variasi perbandingan mmol sukrosa dengan asam lemak adalah 1:16, 1:32, 1:64, dan 1:80. Molecular sieve (3 Å x 1,5 mm) ditambahkan dengan variasi konsentrasi yaitu 100, 300, 500 dan 700 mg per volume reaksi. 3.2.6 Sentrifugasi Hasil Reaksi Esterifikasi Proses sentrifugasi dilakukan untuk merusak emulsi yang dihasilkan dari reaksi esterifikasi. Proses ini dilakukan dengan kecepatan 3400 rpm selama 15 menit. Setelah dilakukan proses sentrifugasi hasil reaksi akan terpisah menjadi tiga fase. Fase organik yang berupa asam lemak yang terlarut dalam n-heksana lalu dipisahkan. 3.2.7 Penentuan % Konversi Untuk penentuan % konversi dilakukan proses titrasi. Titrasi dilakukan pada fase organik yang merupakan asam lemak sisa yang terlarut dalam nheksana. Sebanyak 1 mL aliquot kemudian dititrasi dengan NaOH 0,5 N dengan menggunakan fenolftalein sebagai indikator titik akhir titrasi. Titrasi dilakukan sebanyak dua kali, baik terhadap blanko maupun sampel. 3.2.8 Analisis Produk Analisis produk dilakukan dengan menggunakan instrumentasi FT-IR. Identifikasi dengan FT-IR dilakukan terhadap produk, sukrosa, dan asam lemak hasil hidrolisis. Sebelum dilakukan pengukuran FT-IR, produk hasil reaksi Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 29 terlebih dahulu dikeringkan di oven pada suhu 600 C. Produk dan sukrosa yang berbentuk padat kemudian dibuat pelet dengan mencampurkannya dengan kalium bromida lalu dilakukan pengukuran FT-IR. 3.2.9 Uji Sederhana Kemampuan Ester Sukrosa Hasil Sintesis sebagai Emulsifier Uji ini dilakukan dengan mencampurkan sejumlah air dengan minyak, lalu dilakukan penambahan ester sukrosa hasil sintesis sambil terus dikocok dan melihat perubahan yang terjadi. Apabila terbentuk emulsi, dilakukan pengamatan terhadap kestabilan emulsi selama 24 jam. 3.2.10 Penentuan Jenis Emulsi dengan Menggunakan Mikroskop Uji ini dilakukan untuk mengetahui jenis emulsi yang terbentuk pada tahapan 3.2.9 di atas. Uji dilakukan dengan meneteskan satu tetes emulsi pada kaca preparat, lalu dilakukan penambahan eosin sebagai zat pewarna. Setelah itu, dilakukan pengamatan dengan mikroskop untuk mengetahui apakah emulsi yang terbentuk emulsi minyak dalam air (o/w) atau air dalam minyak (w/o). Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Hidrolisis Trigliserida Reaksi hidrolisis bertujuan untuk menghidrolisis minyak / lemak sehingga dihasilkan asam lemak bebas yang selanjutnya digunakan untuk reaksi esterifikasi. Reaksi hidrolisis dapat dilakukan dengan menggunakan katalis asam maupun basa. Namun reaksi hidrolisis dengan katalis basa lebih banyak digunakan dibandingkan dengan katalis asam. Hal ini disebabkan reaksi dengan katalis basa bersifat irreversible, sehingga dapat menghasilkan rendemen asam lemak yang lebih baik daripada dengan katalis asam. Pada penelitian ini, sebanyak 20 g minyak kelapa dihidrolisis menggunakan katalis basa, yaitu KOH dalam etanol 95%. Penggunaan KOH sebagai katalis dalam reaksi hidrolisis minyak lebih baik daripada NaOH. Sifat kalium lebih reaktif dan mudah membentuk garam asam lemak jika dibandingkan dengan natrium. Garam yang terbentuk pada reaksi hidrolisis dengan menggunakan KOH bersifat lebih larut dalam air bila dibandingkan dengan natrium. (Hasnisa, 2008). Etanol berfungsi sebagai medium perantara dan membantu mempercepat proses hidrolisis trigliserida. Penggunaan etanol membuat KOH dan minyak dapat melakukan kontak sehingga reaksi dapat berjalan. Hal ini disebabkan etanol merupakan pelarut yang bersifat kurang polar dibandingkan dengan air, namun kepolaran etanol berada di antara KOH dan minyak sehingga etanol dapat menurunkan perbedaan kepolaran antara KOH yang bersifat polar dan minyak kelapa yang bersifat nonpolar. Dengan kepolaran etanol yang berada di antara KOH dan minyak kelapa, baik minyak dan KOH dapat larut dalam etanol, sehingga kemungkinan terjadinya interaksi lebih besar dibandingkan dengan air sebagai pelarut KOH. Reaksi hidrolisis trigliserida ditunjukkan pada Gambar 4.1. 30 Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 31 Gambar 4.1 Reaksi Hidrolisis Trigliserida dengan Katalis Basa [Sumber: Hasnisa dan Jumat Salimon, 2008] Pada tahap selanjutnya, campuran yang telah direfluks ditambahkan dengan aquadest dan HCl yang berfungsi untuk memisahkan senyawa-senyawa lipid yang tidak tersabunkan. Hal ini disebabkan reaksi yang berlangsung terjadi dalam suasana basa, sehingga hasil yang diperoleh adalah lipid yang tidak tersabunkan berupa garam kalium asam lemak. Asam lemak bebas akan diperoleh bila larutan diasamkan, karena itu dilakukan penambahan HCl untuk membentuk membentuk senyawa asam lemaknya. Untuk memisahkan asam lemak yang terbentuk, dilakukan ekstraksi menggunakan pelarut n-heksana. Pada tahap ekstraksi akan diperoleh dua lapisan, yaitu lapisan atas berupa senyawa asam lemak yang berada pada fasa n-heksana, dan lapisan bawah berupa senyawa yang larut dalam fasa air yang terdiri dari garam KCl dan etanol. Kemudian lapisan atas yang berupa asam lemak dipisahkan dan ditambahkan dengan Na2SO4 untuk menarik air dan asam lemak diuapkan dengan rotary evaporator untuk menghilangkan sisa n-heksana yang mungkin masih terdapat dalam asam lemak tersebut. Pada reaksi hidrolisis trigliserida dari minyak kelapa diperoleh asam lemak yang berwarna bening kekuningan dan berwujud cair pada suhu ruang. Hal ini disebabkan komposisi dari minyak kelapa sebagian besar tersusun dari asam lemak rantai sedang. Hidrolisis 20 g minyak kelapa ini menghasilkan 18,56 g Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 32 asam lemak, sehingga % perolehan hidrolisis adalah 92,8%. Asam lemak hasil hidrolisis minyak kelapa ditunjukkan pada Gambar 4.2 Gambar 4.2 Asam Lemak hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Berdasarkan hasil analisis sebelumnya, kandungan asam lemak tertinggi dalam minyak kelapa yang digunakan adalah asam lemak dengan rantai karbon sedang, yaitu asam laurat dengan rantai karbon 12, sehingga asam lemak berwujud cair pada suhu ruang (Balai Besar Industi Agro, 2010). 3.2 Penentuan Aktivitas Free Lipase Aktivitas dari lipase bebas diperoleh melalui reaksi hidrolisis, karena reaksi ini paling mudah diamati dan dilakukan. Pengamatan ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan lipase bebas dalam menghidrolisis trigliserida dalam minyak kelapa. Pengukuran aktivitas free lipase dilakukan dengan metode titrimetri dengan fenolftalein sebagai indikator warna. Semakin banyak volume NaOH yang dibutuhkan untuk titrasi, semakin banyak asam lemak bebas yang dihasilkan, yang berarti aktivitas enzim semakin tinggi. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 μmol produk per detik pada kondisi percobaan, sedangkan aktivitas spesifik enzim adalah jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 μmol produk per detik per mg protein enzim. Melalui metode titrimetri ini, didapatkan aktivitas enzim lipase bebas sebesar 35,26 U/ml dan aktivitas spesifiknya sebesar 2,32 U/mg. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 33 3.3 Immobilisasi Enzim dengan Silika Gel 60 Lipase akan mengkatalis reaksi pada interface dan untuk menghasilkan kecepatan reaksi yang tinggi dibutuhkan area interface yang lebih hidrofilik. Hal ini dapat dicapai dengan menggunakan surfaktan atau dengan mengimmobilisasi enzim lipase pada partikel pendukung macroporous. Immobilisasi lipase biasanya dipilih untuk proses esterifikasi (Rozendaal, 1997). Immobilisasi lipase akan memperbaiki stabilitas, pemisahan produk, dan pemisahan enzim dari reaksi untuk digunakan kembali (Nawani et al., 2006). Immobilisasi enzim dilakukan dengan cara mengadsorpsikan enzim ke dalam partikel macroporous dengan interaksi ionik atau hidrofobik. Immobilisasi lipase dengan silika gel 60 merupakan immobilisasi secara adsorpsi fisik, yaitu lipase diikat pada matriks silika gel 60 yang tidak larut air. Silika gel merupakan partikel adsorben alamiah, yang akan menyerap air pada batas tertentu. (Praswati PDK Wulan, 2007). Lipase yang terlarut pada molekul air akan ikut teradsorpsi seiring teradsorpsinya molekul air pada silika gel 60. Dalam hal ini, gaya ikatan yang mempengaruhi ikatan lipase dengan support silika gel 60 adalah gaya ikatan antara molekul air dengan lipase, yaitu ikatan ionik dan gaya Van der Waals. Pada penelitian ini dilakukan variasi berat silika gel 60 yang digunakan untuk immobilisasi enzim lipase. Silika gel 60 yang digunakan dikarakterisasi menggunakan instrumentasi FT-IR yang ditunjukkan pada Gambar 4.3 dan Tabel 4.1. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 34 Si-OH Si-O O-H Gambar 4.3 Spektrum FT-IR Silika Gel 60 Tabel 4.1 Identifikasi Spektrum FT-IR Silika Gel 60 Bilangan Gelombang (cm-1) Jenis Gugus Fungsi 3236-3550 O-H 2301-2378 Si-OH 1616-1635 Si-O Berdasarkan data spektrum yang diperoleh terdapat pita serapan yang cukup tajam pada bilangan gelombang 2344 cm-1 yang menunjukkan serapan untuk gugus fungsi Si-OH dan pada 1627 cm-1 yang menunjukkan serapan untuk Si-O. Kedua serapan ini menunjukkan gugus fungsi yang terdapat pada silika gel 60. Untuk menentukan banyaknya enzim yang terperangkap dalam matriks silika gel 60 ditentukan % loading dari enzim terimmobilisasi menggunakan Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 35 metode Lowry dan ditentukan aktivitasnya melalui reaksi hidrolisis dengan metode yang sama dengan penentuan aktivitas free lipase. Larutan standar yang digunakan adalah larutan Bovine Serum Albumin (BSA) (Praswati PDK Wulan, 2007). Pada Tabel 4.2 ditunjukkan pengukuran absorbansi standar dan pada Gambar 4.4 ditunjukkan kurva kalibrasi standar tersebut. Tabel 4.2 Tabel Korelasi Konsentrasi Standar dengan Absorbansi konsentrasi standard (ppm) 6,67 13,33 20 26,67 33,33 Absorbansi standard 0,129 0,246 0,337 0,48 0,574 Absorbansi standard 0.7 y = 0.016x + 0.016 R² = 0.996 0.6 0.5 0.4 Series1 0.3 0.2 Linear (Series1) 0.1 Linear (Series1) 0 0 10 20 30 40 Konsentrasi standard (ppm) Gambar 4.4 Kurva Kalibrasi Standar Immobilisasi Lipase Dari persamaan kurva standar diperoleh konsentrasi masing-masing sampel enzim terimmobilisasi, sehingga dapat ditentukan % loading (% enzim yang terperangkap di dalam matriks) dan % aktivitas dari lipase terimmobil tersebut. Gambaran % loading dan efisiensi immobilisasi ditunjukkan pada Tabel 4.3 dan Gambar 4.5 serta 4.6. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 36 Tabel 4.3 Penentuan % Loading dan % Aktivitas Enzim Lipase Terimmobilisasi Silika Gel 60 sampel silika (mg) 100 250 500 750 1000 % Loading Dengan pencucian 15,84 23,4 20,64 59,95 40,7 % Efisiensi immobilisasi Tanpa pencucian 27,37 28,34 45,63 61,28 69,84 Dengan pencucian 14,65 18,9 32,33 4,22 8,49 Tanpa pencucian 24,56 10,56 3,32 6,38 4,18 80 70 % Loading 60 50 40 dengan pencucian 30 tanpa pencucian 20 10 0 0 200 400 600 800 1000 1200 berat silika gel 60 (mg) Gambar 4.5 Kurva % Loading Lipase Terimmobilisasi Silika Gel 60 Dari kurva % loading immobilisasi lipase, terlihat % loading optimum terjadi pada berat silika gel 1000 mg tanpa pencucian dengan % loading 69,84 %. Namun, semakin banyak enzim yang teperangkap di dalam matriks silika gel 60, akan semakin kecil aktivitas dari enzim immobil tersebut. Semakin banyak enzim yang terperangkap akan menutupi sisi aktif dari lipase tersebut. Trend grafik untuk lipase terimmobilisasi tanpa pencucian cenderung lebih linier daripada lipase terimmobilisasi dengan pencucian. Hal ini disebabkan pencucian yang tidak merata dan volume buffer tris HCl yang digunakan untuk pencucian jumlahnya Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 37 berbeda untuk tiap sampel lipase immobil, sehingga diperoleh trend grafik yang fluktuatif. Efisiensi Immobilisasi 35 30 25 20 15 dengan pencucian 10 tanpa pencucian 5 0 0 500 1000 1500 berat silika gel 60 (mg) Gambar 4.6 Kurva Efisiensi Immobilisasi Lipase dengan Silika Gel 60 Berdasarkan kurva efisiensi immobilisasi, terlihat bahwa aktivitas maksimum terjadi pada lipase terimmobilisasi silika gel 60 dengan pencucian, yaitu pada berat silika 500 mg dengan % efisiensi immobilisasi sebesar 32,33 %, sedangkan untuk lipase terimmobilisasi tanpa pencucian efisiensinya cenderung menurun. Hal ini disebabkan, pada lipase terimmobilisasi tanpa pencucian masih terdapat lipase bebas. Pencucian enzim lipase terimmobil bertujuan untuk menghilangkan lipase yang tidak berikatan dengan matriks silika gel 60 tersebut, sehingga lipase terimmobilisasi akan mudah berikatan dengan substrat dan cenderung menaikkan efisiensinya. 3.4 Esterifikasi Sukrosa dengan Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Enzim lipase merupakan enzim yang secara spesifik mengkatalisis reaksi hidrolisis, tetapi pada kondisi sedikit air lipase dapat mengkatalisis reaksi esterifikasi. Dalam reaksi esterifikasi, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas katalitik enzim, yaitu perbandingan substrat asam lemak minyak kelapa dan sukrosa, suhu reaksi, pH, pelarut yang digunakan dan waktu inkubasi. Pada penelitian ini dilakukan beberapa variasi optimasi untuk reaksi Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 38 esterifikasi yaitu variasi waktu inkubasi, suhu reaksi, rasio substrat, dan berat molecular sieve. Walaupun dalam reaksi esterifikasi, kondisi yang dibutuhkan adalah sedikit air, sehingga digunakan pelarut organik, tetapi air tetap dibutuhkan untuk aktivitas katalitik enzim. Air berperan dalam seluruh interaksi non kovalen seperti ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, dan interaksi elektrostatik yang dapat mempertahankan konformasi katalitik alami suatu enzim (Zaks dan Russel, 1988). Jumlah air minimum yang dibutuhkan suatu enzim untuk dapat mempertahankan aktivitas katalitiknya disebut air esensial. Air yang dibutuhkan hanya sejumlah kecil saja, asalkan jumlah air tersebut dapat membantu enzim melakukan perannya sebagai katalis (Klibanov, 1986). Faktor lain yang mempengaruhi aktivitas katalitik enzim adalah pH. Enzim akan bekerja optimum pada pH optimum. Setiap enzim memiliki karakter yang berbeda sehingga kondisi optimum pH akan spesifik untuk tiap enzim. Kondisi pH yang jauh dari kondisii spesifik akan menyebabkan inaktivasi enzim karena enzim mengalami kerusakan struktur protein (Albert L. Lehninger, 2005). Dalam penelitian ini, enzim dilarutkan dalam buffer tris-HCl pH 7 sehingga reaksi esterifikasi dilakukan dengan pH 7. Hal ini didasarkan pada penelitian sebelumnya, lipase yang terimmobilisasi dalam matriks silika gel bekerja optimal pada pH 7. (Praswati PDK Wulan, 2007). Pada penelitian ini, esterifikasi juga dilakukan dengan menggunakan molecular sieve sebagai penarik air untuk menghindari terjadinya reaksi hidrolisis dan dapat mendorong reaksi kesetimbangan cenderung ke arah reaksi esterifikasi. Kemampuan molecular sieve dalam menangkap molekul air cukup tinggi, yaitu sampai 20-25% dari berat molecular sieve itu sendiri. (Migas Indonesia, 2007). Reaksi esterifikasi dilakukan dengan mencampurkan sukrosa dan asam lemak, lipase terimmobilisasi, dan pelarut n-heksana. Lipase terimmobilisasi yang ditambahkan adalah sebanyak 150 mg. Pencampuran ini akan menghasilkan dua lapisan yang tidak saling bercampur pada awal reaksi karena adanya perbedaan kepolaran antara sukrosa dengan asam lemak dan n-heksana. Untuk blanko, dilakukan hal yang sama dengan sampel, penambahan enzim lipase tidak Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 39 dilakukan tetapi blanko diisi dengan 150 mg silika gel 60 murni. Agar tetap terjadi kontak antara sukrosa dengan asam lemak dilakukan proses inkubasi campuran reaksi pada horizontal incubator shaker. Setelah proses inkubasi, terlihat perbedaan yang signifikan antara erlenmeyer yang berisi blanko dengan erlenmeyer berisi sampel. Pada dasar erlenmeyer berisi sampel terlihat adanya sedikit gumpalan seperti gel yang berwarana putih keruh, sedangkan pada erlenmeyer blanko tidak terjadi perubahan dibandingkan dengan sebelum proses inkubasi. Hal ini menandakan produk esterifikasi telah terbentuk walaupun jumlahnya sedikit. Reaksi esterifikasi diterminasi dengan melakukan pemanasan pada suhu tinggi untuk menginaktifkan enzim lipase. Pada suhu tinggi enzim dapat terdenaturasi karena adanya pembukaan parsial struktur sekunder, tersier, dan/atau kuartener molekul enzim , dan juga adanya perubahan struktur primer enzim karena kerusakan asam-asam amino tertentu pada suhu tinggi. (Ahern dan Klibanov, 1987). Gambar 4.7 menunjukkan hasil reaksi esterifikasi setelah terminasi. Gambar 4.7 Hasil Esterifikasi Setelah Terminasi Setelah proses terminasi, dilakukan titrasi balik untuk fasa organik. Titrasi ini dilakukan dengan NaOH sebagai titran dan fenolftalein sebagai indikator warna. Pada proses titrasi, terjadi reaksi saponifikasi antara asam lemak dengan NaOH membentuk garam Na-asam lemak. RCOOH + NaOH RCOO-Na+ + H2O Dari titrasi ini, dapat ditentukan banyaknya asam lemak yang bereaksi sehingga dapat diperoleh % konversi dari ester sukrosa. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 40 Pada penelitian ini, produk hasil esterifikasi yang terbentuk jumlahnya sangat sedikit sehingga sulit diisolasi dan dikarakterisasi menggunakan instrumentasi FT-IR. Selanjutnya, dilakukan uji emulsifier sederhana dari produk hasil reaksi esterifikasi, dengan mencampurkan minyak, air, dan produk esterifikasi dalam erlenmeyer atau tabung reaksi. Gambar 4.8 menunjukkan hasil uji emulsifier dari produk esterifikasi. Gambar 4.8 Hasil Uji Emulsifier Sederhana Produk Esterifikasi Dari hasil uji emulsifier sederhana, terlihat produk esterifikasi mampu menyatukan minyak dan air pada awalnya. Namun, setelah didiamkan beberapa jam, minyak dan air terlihat memisah. Hal ini disebabkan produk esterifikasi yang masih terlalu sedikit. 3.5 Identifikasi dengan FT-IR Analisis produk dilakukan dengan menggunakan instrumentasi FT-IR. Pengukuran dengan menggunakan FT-IR dilakukan pada sukrosa dan asam lemak minyak kelapa. Spektrum asam lemak minyak kelapa ditunjukkan pada Gambar 4.9 dan Tabel 4.4. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 41 Gambar 4.9 Spektrum FT-IR Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Tabel 4.4 Tabel Korelasi Spektrum FT-IR Asam Lemak Minyak Kelapa Bilangan Gelombang (cm-1) Gugus Fungsi 3000-2850 C-H 1725-1700 C=O (Asam Karboksilat) 1463,97 -CH2 1450-1375 -CH3 Berdasarkan data spektrum yang diperoleh terdapat pita serapan yang tajam pada bilangan gelombang 2924 dan 2854 cm-1 yang menunjukkan serapan untuk golongan rantai karbon dari asam lemak. Berdasarkan hasil analisis, kandungan asam lemak tertinggi dalam minyak kelapa yang digunakan adalah asam lemak dengan rantai karbon sedang, yaitu asam laurat yang memiliki 12 rantai karbon. Oleh karena itu serapan untuk ikatan C-H dalam -CH2 dan –CH memiliki serapan yang tinggi. Pita serapan pada bilangan gelombang 1700-1725 cm-1 menunjukkan serapan untuk C=O karbonil untuk asam karboksilat. Pada spektrum IR asam lemak minyak kelapa, serapan C=O muncul pada bilangan gelombang 1710 cm-1. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 42 Gambar 4.10 Spektrum FT-IR Sukrosa Tabel 4.5 Tabel Korelasi Spektrum FT-IR Sukrosa Bilangan Gelombang (cm-1) Gugus Fungsi 3650-3200 O-H 3000-2850 C-H Pada Gambar 4.10 dan Tabel 4.5 dapat dilihat spektrum sukrosa. Serapan lebar pada bilangan gelombang 3383 dan 3334 cm-1 menunjukkan serapan O-H alkohol yang terdapat pada sukrosa. Sukrosa merupakan disakarida yang terdiri dari unit glukosa dan fruktosa serta memiliki 8 gugus hidroksil. Pita serapan pada bilangan gelombang 2935 cm-1 menunjukkan serapan untuk ikatan C-H dalam – CH2 dan –CH. 3.6 Optimasi Esterifikasi 3.6.1 Optimasi Temperatur Salah satu faktor yang mempengaruhi aktivitas katalitik enzim adalah temperatur reaksi. Optimasi temperatur dilakukan dengan kondisi rasio 1:16, berat molecular sieve 0,1 g, dan waktu inkubasi 8 jam. Pengaruh temperatur reaksi Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 43 terhadap % konversi sintesis ester sukrosa ditunjukkan pada Gambar 4.11 dan Tabel 4.7. Tabel 4.7 Pengaruh Temperatur terhadap % Konversi Ester Sukrosa %Konversi T (oC) 30 35 37 40 45 % Konversi 2,125 2,94 4,125 2,96 0,94 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 %konversi 0 10 20 30 40 50 Temperatur (0C) Gambar 4.8 Grafik Hubungan Temperatur Reaksi vs % Konversi Ester Sukrosa Pada variasi temperatur reaksi, diperoleh temperatur optimum untuk reaksi esterifikasi antara sukrosa dengan asam lemak minyak kelapa adalah 37oC. Kecepatan reaksi esterifikasi enzimatis meningkat seiring dengan meningkatnya temperatur reaksi. Namun, di atas temperatur optimum enzim akan menjadi inaktif karena adanya perubahan struktur tersier enzim karena kerusakan asamasam amino tertentu (Ahern dan Klibanov, 1987). 3.6.2 Optimasi Rasio Substrat Reaksi esterifikasi merupakan reaksi kesetimbangan yang sesuai dengan konsep Le Chatelier. Agar reaksi esterifikasi berjalan optimal, maka kesetimbangan diupayakan bergeser ke arah sisi pembentukan ester dengan menggunakan reaktan berlebih atau dengan membuang salah satu produk (Yoo, Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 44 et.al., 2006). Reaktan berlebih yang dipilih dalam reaksi esterifikasi ini adalah asam lemak minyak kelapa, dengan perbandingan volume asam lemak minyak kelapa dan sukrosa 3:1. Hal ini disebabkan dalam kondisi terdapat pelarut organik dan kandungan air yang sedikit, lipase cenderung bekerja dalam reaksi esterifikasi daripada reaksi hidrolisis (Joseph, et. al., 2008). Dengan konsentrasi asam lemak yang berlebih, maka kandungan air dalam campuran dapat diminimalisasi dibandingkan dengan menggunakan sukrosa yang berlebih. Optimasi rasio substrat dilakukan pada kondisi temperatur reaksi 37oC, berat molecular sieve 0,1 g, dan waktu inkubasi 8 jam. Pengaruh penambahan asam lemak terhadap persen konversi ester asam lemak sukrosa ditunjukkan dalam Gambar 4.12 dan Tabel 4.8 berikut: Tabel 4.8 Pengaruh Rasio Sukrosa : Asam Lemak terhadap % Konversi Rasio Sukrosa : Asam Lemak (mmol) 1:16 % Konversi 2,5 1:32 3,34 1:64 2,5 1:80 1,83 4 3.5 % Konversi 3 2.5 2 1.5 % konversi 1 0.5 0 0 20 40 60 80 100 Rasio Substrat Gambar 4.12 Grafik Hubungan Rasio Substrat vs % Konversi Ester Sukrosa Pada variasi rasio sukrosa : asam lemak (mmol), diperoleh rasio substrat optimum pada rasio 1:32 dengan % konversi 3,34 %. Pertambahan konsentrasi Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 45 substrat akan meningkatkan aktivitas enzim hingga tercapai konsentrasi optimum (Lehninger, 2005). Namun, setelah titik optimum tercapai, akan terjadi penurunan % konversi. Hal ini disebabkan substrat yang berlebih akan bertindak sebagai inhibitor yang mengakibatkan penurunan aktivitas dari enzim tersebut. (Reed, Michael C., 2010). 3.6.3 Optimasi Waktu Inkubasi Optimasi waktu reaksi dilakukan untuk mengetahui waktu yang dibutuhkan untuk menghasilkan ester sukrosa dengan % konversi yang lebih tinggi. Reaksi dilakukan dengan variasi waktu 4, 8, 16, 32, dan 64 jam, pada kondisi rasio substrat 1:32, temperatur 37 oC, dan berat molecular sieve 0,1 g. Pengaruh waktu inkubasi terhadap % konversi ester sukrosa ditunjukkan pada Tabel 4.9 dan Gambar 4.13 berikut: Tabel 4.9 Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap % Konversi Ester Sukrosa waktu (jam) 4 8 16 32 64 % konversi 2,5 3,125 9,59 12,1 3,34 Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 46 14 % konversi 12 10 8 6 % konversi 4 2 0 0 20 40 60 80 Waktu (jam) Gambar 4.13 Grafik Hubungan Waktu Inkubasi vs % Konversi Ester Sukrosa Pada variasi waktu inkubasi, diperoleh waktu optimum untuk sintesis ester asam lemak sukrosa adalah 32 jam dengan % konversi 12,1 %. Setelah waktu optimum tercapai, akan terjadi penurunan % konversi yang disebabkan meningkatnya volume air yang dihasilkan dari produk samping hasil esterifikasi seiring dengan semakin panjangnya waktu inkubasi. Peningkatan volume air dapat menyebabkan enzim cenderung mengarahkan ke reaksi hidrolisis (Villenueve, et.al., 2003). 3.6.4 Optimasi Molecular sieve Molecular sieve digunakan untuk menarik air sehingga mencegah terjadinya reaksi hidrolisis. Dengan demikian diharapkan reaksi kesetimbangan bergeser kea rah produk esterifikasi sehingga dapat meningkatkan % konversi dari reaksi esterifikasi tersebut. Pada penelitian ini dilakukan variasi berat molecular sieve, yaitu 0,1, 0,3, 0,5, dan 0,7 g, dengan kondisi rasio substrat 1:32, temperatur 37oC, dan waktu inkubasi 32 jam. Pengaruh berat molecular sieve ditunjukkan pada Tabel 4.10 dan Gambar 4.14 berikut: Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 47 Tabel 4.10 Pengaruh Berat Molecular sieve terhadap % Konversi Ester Sukrosa berat ms (g) 0,1 0,3 0,5 0,7 % konversi 4,47 1,4 2,8 2,6 5 % konversi 4 3 2 % konversi 1 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 berat molecular sieve (g) Gambar 4.13 Grafik Hubungan Berat Molecular Sieve vs % Konversi Ester Asam Lemak Sukrosa Berdasarkan grafik di atas diperoleh berat optimum molecular sieve adalah 0, 1 g. Hal ini berarti keadaan setimbang telah tercapai pada saat berat molecular sieve 0,1 g, sehingga kesetimbangan reaksi bergeser ke arah produk ester. Namun, pada saat melebihi berat optimum, molecular sieve cenderung menghalangi pergerakan substrat untuk berinteraksi dengan enzim, sehingga % konversi esterifikasi menurun seiring dengan kenaikan berat molecular sieve tersebut. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Dari hasil penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa : 1. Lipase Candida rugosa yang terimmobilisasi dalam matriks silika gel 60 dapat digunakan sebagai katalis dalam reaksi esterifikasi antara sukrosa dan asam lemak hasil hidrolisis minyak kelapa. 2. Dari hasil hidrolisis asam lemak minyak kelapa diperoleh persentase perolehan sebesar 92.8 %. 3. Persentase loading terbesar pada immobilisasi lipase yaitu pada 1000 mg silika gel 60 tanpa pencucian sebesar 69,84%. 4. Efisiensi immobilisasi lipase terbesar yaitu pada 500 mg silika gel 60 dengan pencucian sebesar 32,33% . 5. Kondisi optimum untuk reaksi esterifikasi antara sukrosa dengan asam lemak minyak kelapa menggunakan lipase terimmobilisasi silika gel 60 yaitu pada suhu 37 oC, rasio substrat 1:32, waktu inkubasi 32 jam, dan berat molecular sieve 0,1 g dengan % konversi sebesar 4,47%. 6. Ester sukrosa dengan derajat substitusi rendah dapat bertindak sebagai emulsifier. 5.2 Saran 1. Uji efisiensi atau uji keberulangan terhadap enzim lipase terimmobilisasi. 2. Mencari metode pemurnian yang lebih baik untuk senyawa ester hasil sintesis dan cara yang tepat untuk uji adanya gugus ester yang dapat dilakukan secara sederhana. 3. Optimasi konsentrasi enzim yang dibutuhkan untuk reaksi esterifikasi enzimatis antara sukrosa dengan asam lemak minyak kelapa. 4. Mencari metode uji emulsifier dari produk ester sukrosa yang lebih baik tetapi mudah untuk dilakukan. 48 Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 49 5. Melakukan optimasi berbagai variasi dari immobilisasi lipase dengan silika gel 60, sehingga dapat diperoleh lipase terimmobilisasi dengan aktivitas yang lebih tinggi. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 DAFTAR PUSTAKA Akoh, C.C., dan Swanson B.G. (1998). Carbohydrate Polyester as Fat Substitutes. Marcel Deccer, Inc, New York. Atkins, P.W. (1999). Physical Chemistry 6th Edition. University Lecturer and Fellow of Lincoln College, Oxford. Barkah, Awaliatul. (2011). Studi Reaksi Esterifikasi antara Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa dengan Sukrosa Menggunakan Lipase Candida rugosa E.C.3.1.1.3. Skripsi, Departemen Kimia Universitas Indonesia. Depok. Bei Gao, et.al. (2010). Improving the catalytic activity of lipase LipK107 from Proteus sp. by site-directed mutagenesis in the lid domain based on computer simulation. J. of Molecular Catalysis. Vol. 68, 286-291. Brady, et.al. (1990). A Serine Protease Triad Forms The Catalytic Center of A Triacylglycerol Lipase. J. of Enzyme Technology. Vol.343, 767-770. Cao, Linqiu. (2005). Immobilized Enzymes: Science or Art? J. of Chemical Biology. Vol. 9, 217-226. Dandekar, P.P. and V.B. Patravale. (2009). Enzymatic Synthesis of Fructose Esters from Mango Kernel Fat. Indian J. of Chem. Tech. Vol. 16, 317-32 Divakar S. dan B. Manohar. (2007). Use of Lipases in the Industrial Production of Ester. Di dalam: J Polaina dan A P MacCabe (Eds). Industrial Enzymes: 283-300. Springer. Netherlands. Elif Yilmaz, K. Can, M. Sezgin, and M. Yilmaz. (2011). Immobilization of Candida rugosa Lipase on Glass Beads for Enantioselective Hydrolysis of Racemic Naproxen Methyl Ester. Bioresource Technology, Vol. 102, no. 2, pp 499 – 506. Elisabeth, Trisia H N. (2002). Mempelajari Stabilitas Enzim Lipase Ekstraselular dari Kapang Rhizopus Orizae TR32 dalam Pelarut Heksana, Toluen, dan Benzen. Institut Pertanian Bogor. Ferrer, et al. (2005). Synthesis of sugar esters in solvent mixtures by lipases from Thermomyces lanuginosus and Candida antarctica B, and their 50 Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 51 antimicrobial properties. Departamento de Biocatálisis, Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, Spain. Garcia, T., A. Coteron, M. Martinez and J. Aracil. (1999). Kinetic model for the esterification of oleic acid and cetyl alcohol using an immobilized lipase as catalyst. J. Chem. Eng. Sci., 55: 1411-1423. Gazuini. (1993). Peran Minyak Kelapa dalam Berbagai Industri. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Harold Hart, Leslie E. Craine, dan David J. Hart. (2003). Organic Chemistry, A Short Course, 7th Edition. Houghton Mifflin Company, USA. Harringan, K. A. dan W.M. Breene. (1989). Fat Substitutes: Sucrose Ester and Simplesse. Cereal Food World. Vol. 34 : 216-267. Hashim, Hasnisa binti dan Jumat Salimon. (2008). Kajian Pengoptimuman Tindak Balas Hidrolisis Minyak Kacang Soya. Pusat Pengajian Sains Kimia dan Teknologi Makanan, Fakulti Sains dan Teknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia, Bangi, Selangor, Malaysia. http://lc.bppt.go.id/iptek/index.php. Kamis, 26 Januari 2012. http://kimia.upi.edu/kerjaenzim/index.php. Jum’at, 8 Juni 2012. http://www.coconutmic.com/id/produksi/buahkelapa. Jum’at, 8 Juni 2012. http://extoxnet.ersc.edu/poliester/olestra. Jum’at, 8 Juni 2012. http://www.plantamor.com/index.php?plant=365. Kamis, 26 Januari 2012. In Sang Yoo, Sang Joon Park, and Hyon Hee Yoon. 2007. Enzymatic Synthesis of Sugar Fatty Acid Esters. J. Ind. Eng. Chem., Vol. 13, No. 1, 1-6 Joseph, et.al. (2008). Cold Active Microbial Lipases: Some Hot Issues and Recent Development. J. of Biotechnological Advance. Vol. 26, 457-470. Josh Haacker’s Illustrated. (2007). Di dalam Ichiro Chibata. (1978). Immobilized Enzymes. Kodansha Ltd. Halsted Press. Ketaren, S. (1986). Pengantar Teknologi Minyak dan Lemak Pangan. Jakarta: Universitas Indonesia. Klibanov, A. M. (1986). Enzymes that work in organic solvents. Chemtech. 16: 354-144 Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 52 Laane, C, Tramper, J, dan Lilly, M. D. (Eds). (1987). Biocatalysis in organic media. Elsevier, Amsterdam. Lehninger, Albert L. (2005). Principles of Biochemistry. The John Hopkins University. Worth Publisher, Inc. Lurgi GmbH. (1989). Boiling Diagram of Fatty Acid. Lurgi, Frankfurt, Germany. Macrae, A.R. (1983). Extracellular microbial lipases. Di dalam W.M. Fogatty. Microbial enzyme and biotechnology. Appl. Scie. Publ. London. Murray, k. Robert, et al. (2003). Harper’s illustrated biochemistry, twenty-sixth edition. United States of America : The McGraw-Hill Companies, Inc. Nancy Estherlita Kitu. (2000). Sintesis Mono- dan Diasil Gliserol dari Destilat Asam Lemak Minyak Kelapa Melalui Reaksi Esterifikasi dengan Katalis Lipase Rhizomucor miehei. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Nawani, Neerupma et.al. (2006). Immobilization and stability studies of a lipase from thermophilic Bacillus sp: The effect of process parameters on immobilization of enzyme. Vol. 9 No. 5. Novianingsih, Ika. (2011). Studi Reaksi Sintesis Ester Sukrosa secara Enzimatis Menggunakan Lipase Candida rugosa EC 3.1.1.3 antara Sukrosa dengan Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Sawit. Skripsi, Departemen Kimia Universitas Indonesia. Depok. ÖZTÜRK, Banu. (2001). Immobilization of Lipase from Candida rugosa on Hydrophobic and Hydrophilic Supports. İzmir Institute of Technology, Turkey. PDK Wulan, Praswati et.al. (2007). Reaksi Hidrolisis Minyak Zaitun Menggunakan Lipase Rhizopus oryzae yang di Imobilisasi Melalui Metode Adsorpsi. Departemen Teknik Kimia Universitas Indonesia, Depok. Pusat Data dan Informasi Migas Indonesia. (2007). Outlook Komunitas Migas Indonesia. Carr, P.W. and L.D. Bowers. (1980). Immobilized Enzymes in Analytical and Clinical Chemistry, Fundamentals and Applications. Willey, New York. Rahman, Rakmi Abdul dan Tjahjono Herawan. (2000). Properties of Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 53 Biosurfactant Enzimatically Prepared from Fructose and Palm Fatty Acid. Journal of Oil Palm Research Vol. 1.2 No. 1, June 2000, p. 117.122. Reed, Michael C., Anna L., H. Frederik N. (2010). The biological significance of substrate inhibition: A mechanism with diverse functions. Department of Mathematics and Department of Biology, Duke University, Durham, USA. Reslow, M, Adlercreutz, P., dan Mattiasson, B. (1987). Organic solvents for bioorganic synthesis. 1. Optimation of parameters for chymotrypsin catalyzed process. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26: 1-8. Rozendaal. (1997). Inesterification of Oil and Fat. Di dalam: Gunstone, et.al (eds). Lipid Technologies and Applications. Marcel Dekker, Inc. New York-Bassel- Hong Kong. Sakidja. 1998. Sintesis Poliester Asam Lemak Sukrosa dari Minyak Kelapa Sebagai Bahan Pengganti Lemak Untuk Makanan Rendah Kalori. Disertasi. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor. Singh, M. (2007). Transesterification of primary and secondary alcohols using Pseudomonas aeruginosa lipase. India. National Institute of Pharmaceutical Education and Research. Sugiharni, Nanik. (2010). Isolasi lipase ekstrak kasar dari pseudomonas fluorescens sebagai biokatalisator dalam studi pendahuluan reaksi esterifikasi antara asam lemak minyak kelapa dengan sukrosa. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia. Sunardi. (2005). Diktat Analisa Instrumentasi. Departemen Kimia FMIPA Universitas Indonesia. Depok. Syamsul M.W, K. (2010). Green synthesis of lauryl palmitate via lipase-catalyzed reaction. Faculty of Science and Technology, Universiti Sains Islam Malaysia (USIM), Malaysia. Unichema International. (1998). Fatty Acid Data Book 2nd Edition. Unichema, Republic of German. Verma, Madan Lal, Wamik Azmi, Shamsher Singh Kanwar. (2011). Enzymatic Synthesis of Isopropyl Acetate by Immobilized Bacillus cereus Lipase in Organic Medium. Enzyme Research, Vol 2011. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 54 Villeneuve P., Muderhwa J.M., Graille J., Haas M.J. (2000). “Customizing lipases for biocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approaches. Journal of molecular catalysis B: enzymatic, 9, issues 4-6, 113-148. Weintaurb, Steven. (2002). Demystifying Silica Gel. In Objects Specialty Groups Postprints. Washington, DC: American Institute of Conservation. Vol. 9, 1-24. Whitehurst, Robert J. (2004). Emulsifier in Food Technology. Blackwell Publishing. Yamamoto, T. and K. Kimani. 1986. Production of Sucrose Fatty Acid Polyester. US Patent, No. 4,611,055. Zaks, A. dan Russell, A. J. 1988. Enzymes in organic solvents: properties and applications. J. Biotechnol. 8: 259-270.60. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 LAMPIRAN Lampiran 1: Tabel Komposisi Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa [Sumber : Laboratorium Analisis Balai Besar Industri Agro (BBIA)] 55 Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 56 Lampiran 2: Perhitungan Berat Molekul Hidrolisat Asam Lemak Minyak Kelapa [Sumber : Nancy Estherlita Kitu, Sintesis Mono- dan Diasil Gliserol dari Destilat Asam Lemak Minyak Kelapa Melalui Reaksi Esterifikasi dengan Katalis Lipase Rhizomucor miehei, 2000, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor] Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 57 Lampiran 3 : Perhitungan Penentuan Rasio Bahan 1. Menentukan ρ Asam Lemak untuk menentukan ρ asam lemak digunakan pikno berukuran 10 ml massa asam lemak = 8.3788 g maka ρ asam lemak = , = 0,83788 ≈ 0,838 2. Pembuatan Buffer tris HCl 0.1 M = × = 0,1 = × 0,1 × = 0,01 = 0,01 × 121,14 = 1,2114 × 3,423 = 0,3423 3. Menentukan Massa Sukrosa 1 ml sukrosa 0,1M = 0,1 mmol = × = 0,1 × 10 4. Menentukan Massa dan Mol Asam Lemak = × = 0,838 = = 2,514 207,896 ×3 = 2,514 = 0,012 5. Menentukan Volume Pelarut ( n – heksana) Volume sukrosa + volume asam lemak = 1 mL + 3 mL = 4 mL Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 58 Lampiran 4 : Perhitungan Aktivitas Free Lipase Tabel Hasil Titrasi dengan NaOH 0,05 N Berat Enzim (mg) Sampel Volum NaOH (mL) blanko 6,04 I 22,50 II 23,10 15,20 mg Volume rata-rata sampel = 22,80 mL Berat minyak kelapa = 0,389 g Waktu = 60 menit Aktivitas Free Lipase: = ( − )× × 1000 × = (22,80 − 6,04) × 0,05 × 1000 0,389 × 60 = 35,26 U/mL Aktivitas spesifik Free Lipase: = 35,26 U/mL = 2,32 U/mg 15,20 mg Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 59 Lampiran 5: Data % Loading dan Efisiensi Immobilisasi Lipase Tabel Kurva Absorbasnsi Standar Absorbansi blanko = 0,117 Konsentrasi standar (ppm) 6,67 13,33 20 26,67 33,33 Absorbansi standard 0,246 0,363 0,454 0,597 0,691 Absorbansi standard-blanko 0,129 0,246 0,337 0,48 0,574 Tabel % Loading dan Efisiensi Immobilisasi Lipase sampel silika (mg) kontrol 100 (dicuci) 250 (dicuci) 500 (dicuci) 750 (dicuci) 1000 (dicuci) 100 (tanpa cuci) 250 (tanpa cuci) 500 (tanpa cuci) 750 (tanpa cuci) 1000 (tanpa cuci) Absorbansi 0,74 0,48 0,32 0,35 0,38 0,28 0,43 0,31 0,27 0,37 0,32 konsentrasi (ppm) 36,01 10,38 11,03 12,87 14,42 8,54 8,72 10,32 7,83 13,94 10,86 volume (mL) 10 25 25 25 10 25 25 25 25 10 10 % loading aktivitas (U/mg) % immobil 27,93 23,4 10,64 59,95 40,7 39,45 28,34 45,63 61,28 69,84 0,19 0,44 0,75 0,10 0,20 0,39 0,24 0,08 0,15 0,10 8,19 18,9 32,33 4,22 8,49 16,81 10,56 3,319 6,38 4,18 Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 60 Lampiran 6: Perhitungan % Loading dan Efisiensi Immobilisasi 1. Perhitungan % Loading % loading dihitung dengan menggunakan persamaan: – × 100 % Contoh: pada berat silika 100 mg dengan pencucian diperoleh konsentrasi lipase 10,38 ppm dengan volume 25 mL. Konsentrasi kontrol sebesar 36,005 ppm dengan volume 10 mL. % = × 100% = ( , ) ( × ( , × , × ) ) × 100% = 27,93% 2. Perhitungan Efisiensi Immobilisasi Efisiensi Immobilisasi dihitung dengan membandingkan aktivitas spesifik lipase terimmobilisasi dengan aktivitas spesifik free lipase. Contoh : pada berat silika 100 mg dengan pencucian Aktivitas spesifik = 0,19 U/mg Akttivitas Free Lipase = 2,32 U/mg Efisiensi Immobilisasi = , / , / × 100% = 8,19% Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 61 Lampiran 7 : Data Titrasi Asam Lemak Sisa Variasi Suhu Reaksi Tabel Hasil Titrasi Asam Lemak Sisa dengan NaOH 0,051 N Suhu (oC) 30 oC 35oC 37oC o 40 C 45oC Sampel Volum NaOH (mL) Blanko 12,4 I 11,8 II 11,7 III 11,8 Blanko 12,45 I 11,7 II 11,6 III 11,3 Blanko 15,4 I 14 II 14,1 III 14 Blanko 16,7 I 15,6 II 15,9 III 15,8 Blanko 18,8 I 18,4 II 18,6 III 18,5 % Konversi 2,125 2,94 4,375 2,96 0,94 Dengan kondisi: Waktu inkubasi 8 jam, rasio substrat 1:16, dan berat molecular sieve 0,1 g. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 62 Lampiran 8 : Data Titrasi Asam Lemak Sisa Variasi Rasio Substrat Tabel Hasil Titrasi Asam Lemak Sisa dengan NaOH 0,103 N Rasio Substrat 1:16 1:32 1:64 1:80 Sampel Volum NaOH (mL) Blanko 14,5 I 14,1 II 13,9 III 14,3 Blanko 26,8 I 25,8 II 25,3 III 26,1 Blanko 36,6 I 34,8 II 35,2 III 35 Blanko 57,4 I 55,8 II 56,2 III 55,7 % Konversi 2,5 3,34 2,5 1,83 Dengan kondisi: Temperatur 37oC, waktu inkubasi 8 jam, dan berat molecular sieve 0,1 g. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 63 Lampiran 9: Data Titrasi Asam Lemak Sisa Variasi Waktu Inkubasi Tabel Hasil Titrasi Asam Lemak Sisa dengan NaOH 0,05 N Waktu Inkubasi 4 jam 8 jam 16 jam 32 jam 64 jam Sampel Volum NaOH (mL) Blanko 22,2 I 21,8 II 21,6 III 20,7 Blanko 11,3 I 10,9 II 10,7 III 10,8 Blanko 21,2 I 18 II 18,9 III 17,5 Blanko 23,2 I 19,8 II 19 III 19,1 Blanko 18,3 I 17,1 II 17,6 III 17 % Konversi 2,5 3,125 9,59 12,1 3,34 Dengan kondisi : Temperatur 37oC, rasio substrat 1:32, berat molecular sieve 0,1 g. Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 64 Lampiran 10: Data Titrasi Asam Lemak Sisa Variasi Berat Molecular Sieve Tabel Hasil Titrasi Asam Lemak Sisa dengan NaOH 0,094 N Berat Molecular Sieve (g) 0,1 0,3 0,5 0,7 Sampel Volum NaOH (mL) Blanko 24,4 I 22,4 II 22,8 III 23,7 Blanko 22,6 I 22,2 II 22,1 Blanko 22,4 I 21,5 II 21,5 Blanko 18,8 I 18,1 II 17,8 % Konversi 4,47 1,4 2,8 2,6 Dengan kondisi : Waktu inkubasi 32 jam, temperatur 37oC, rasio substrat 1:32 Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 65 Lampiran 11 : Perhitungan Konversi dan Perkiraan Derajat Esterifikasi (DS) Ester Asam Lemak Sukrosa dari Minyak Kelapa 1. Perhitungan % Konversi Mmol asam lemak yang bereaksi : = ( − % )× × = × 100% 2. Perhitungan Kasar Perkiraan Derajat Substitusi (DS) Ester Sukrosa yang Terbentuk: Pada kondisi optimum, diperoleh % konversi sebesar 4,47 %, maka mmol asam lemak yang bereaksi adalah 0,0447 mmol. = = , , = 0,447 ≈ 0,45 Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 66 Lampiran 12: Data Spesifikasi Lipase Candida rugosa Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 67 Lampiran 13 : Data Analisis Komposisi Minyak Kelapa Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 68 Lanjutan Lampiran 13 : Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 69 Lampiran 14 : Spektrum FT-IR Asam Lemak Minyak Kelapa Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 70 Lampiran 15: Spektrum FT-IR Sukrosa Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 71 Lampiran 16 : Spektrum FT-IR Silika Gel 60 Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012 72 Universitas Indonesia Studi eksterifikasi..., Tri Destiyanti, FMIPA UI, 2012