pengembangan vaksin hepatitis b berbasis protein

0711: Neni Nurainy dkk.
KO-223
PENGEMBANGAN VAKSIN HEPATITIS B BERBASIS PROTEIN
REKOMBINAN SUBUNIT INDONESIA
*Neni Nurainy 1) Dicky M 1) Gilang N 1)
David H. Muljono 2) Turyadi 2)
Tarwadi 3) Danang Waluyo 3) Fifit Juniarti3) Astuati 3)
Vanny Narita 4) Ade Djamal 4)
Ernawati Giri R 5) Debbie R 5) Dessy N 5)
1) PT Bio Farma (Persero) Div. Penelitian dan Pengembangan,
2) Lembaga Eijkman,
3 )Badan Pengkajian dan penerapan teknologi,
4) Universitas Al Azhar Indonesia,
5) Institut Teknologi Bandung
PT Bio Farma (Persero)
Divisi Penelitian dan Pengembangan
Jl. Pasteur No. 28 Bandung 40161
e-Mail: [email protected]
ABSTRAK
Hepatitis B masih merupakan masalah epidemiologi global, termasuk Indonesia dengan tingkat HBsAg positive yang relatif
tinggi. Indonesia pada tahun 2010 mengusulkan pada World Health Assembly tanggal 28 Juli sebagai hari Hepatitis sedunia dan
memutuskan untuk melakukan aksi pencegahan dan eliminasi Hepatitis B. Hal ini seiring dengan program WHO, bahwa pada
tahun 2012, diharapkan Western Pacific Region adalah daerah pertama yang menjadi target WHO untuk mengurangi angka
infeksi kronik Hep B menjadi 2% pada anak usia 5 tahun. Vaksinasi Hepatitis B telah masuk ke dalam Program Imunisasi
Nasional sejak tahun 2000 dan sukses dalam menurunkan angka prevalensi Hepatitis B di Indonesia, namun Indonesia masih
tergantung pada impor bulk antigen Hepatitis B dari luar negeri. Dalam rangka membangun kemandirian bangsa dalam produksi
bulk Hepatitis B, telah dibentuk Konsorsium Hepatitis B (HBV) yang merupakan program Kementrian Riset dan Teknologi
dalam upaya sinergi, produktivitas, dan pendayagunaan sumberdaya penelitian dan pengembangan (litbang) nasional, serta
peningkatan peran sektor produksi/swasta dalam program litbang kolaborasi. Konsorsium yang terdiri dari PT BIOFARMA,
Lembaga Eijkman, Pusat Teknologi Farmasi dan Medika BPPT, ITB dan Universitas Al Azhar Indonesia. Dalam proyek satu
tahun yang didanai oleh Insentif Sistem Inovasi Nasional (Isinas) Ristek ini, disiapkan rancangan konstruk vaksin Hepatitis B
rekombinan dengan memanfaatkan informasi sekuens nukleotida virus Indonesia. Makalah ini memaparkan hasil-hasil yang
diperoleh selama 10 bulan penelitian dan lesson learnt dari proyek Konsorsium HBV.
Kata Kunci: Virus Hepatitis B (VHB), Vaksin Hepatitis B Rekombinan, Konsorsium Hepatitis B, Isinas
I.
PENDAHULUAN
Hepatitis B masih merupakan permasalahan kesehatan
serius di dunia termasuk Indonesia. Salah satu resolusi yang
diajukan oleh Indonesia pada sidang World Health Assembly
2010, adalah penetapan hari Hepatitis sedunia dengan aksi
pencegahan dan eliminasi virus Hepatitis B salah satu
upayanya melalui vaksinasi Hepatitis B [1]. Walaupun
vaksinasi Hepatitis B sudah menjadi program Imunisasi
nasional dan telah berhasil menurunkan angka prevalensi
Hepatitis B, bulk vaksin masih diimpor dari luar negri.
Dalam rangka kemandirian bangsa dalam penyediaan
vaksin, maka dipandang perlu usaha dalam penguasaan
teknologi produksi vaksin Hepatitis B yang merupakan
vaksin rekombinan subunit protein antigen Hepatitis B
(HBsAg).
PT Bio Farma yang merupakan perusahaan kelas dunia
menyatakan bahwa produk vaksin Hepatitis B belum
menggunakan vaksin yang diproduksi di Indonesia dan
teknologi vaksin Hepatitis B terkini masih sangat tergantung
pada negara lain. Biaya royalty dari seed vaksin dan teknologi
vaksin ini relatif tinggi. Padahal Vaksin ini merupakan
kebutuhan nasional sesuai dengan inisiatif pemerintah
KO-224
untuk melenyapkan Hepatitis B dalam program Indonesia
Sehat 2010 [2].
Beberapa universitas dan lembaga litbang di Indonesia
telah melakukan penelitian di bidang pengembangan seed
vaksin. Namun, sebagian besar penelitian tersebut kadang
masih merupakan penelitian dasar dan belum merupakan
jawaban dari kebutuhan pasar. Oleh karena itu, bottleneck
yang dihadapi adalah belum dikomunikasikannya
kebutuhan industri vaksin Indonesia akan indigeneous seed
vaksin kepada para pelaku penelitian vaksin.
Dengan dikembangkannya vaksin Hepatitis B ini,
maka kerugian beban sosial ekonomi dan kesehatan karena
pengobatan dan kematian akibat penyakit Hepatitis B dapat
diturunkan. Vaksin Hepatitis B juga dapat diproduksi dalam
skala industri, sehingga bisa diperjualbelikan tidak hanya di
negara Indonesia, namun juga pada negara-negara.
Prakiraan oleh Amarasinghe et al. (2010) menunjukkan
sekitar 2.4-3.5 milyar dosis vaksin dibutuhkan pada 5 tahun
pertama setelah pengenalan produk dengan >75% diberikan
oleh sektor publik. Debottlenecking dapat dilakukan dengan
percepatan sinergi antara universitas/badan litbang
bersama-sama dengan industri (PT Bio Farma) dan tentu saja
Pemerintah sebagai pemilik saham dari sebagian industri
dan sekaligus sebagai regulator yang akan melengkapi satu
sama lain dan menghasilkan produk vaksin Indonesia.
Atas inisiasi dari Kemenristek dibentuklah Konsorsium
Hepatitis B yang terdiri dari PT BIOFARMA, Lembaga
Eijkman, Pusat Teknologi Farmasi dan Medika BPPT, ITB
dan Universitas Al Azhar Indonesia. Melalui program Isinas
2012, diberikan pendanaan penelitian untuk Konsorsium
Hepatitis B. Kegiatan konsorsium merupakan proyek
multiyears dimulai dari tahun 2012 dan direncakan sampai
tahun 2014. Program kerja Konsorsium meliputi desain dan
konstruksi gen pengkode protein subunit rekombinan
(tahun 2012); ekspresi dan purifikasi protein rekombinan
subunit kandidat vaksin Hepatitis B (kegiatan tahun 2013)
dan verifikasi fungsi protein rekombinan subunit kandidat
vaksin Hepatitis B (tahun 2014).
Sasaran yang ingin dicapai pada proyek penelitian
selama 10 bulan di tahun 2012,
sekurang-kurangnya
tersedia satu klon yang merupakan konstruksi gen
pengkode protein rekombinan sub unit kandidat vaksin
Hepatitis dalam vektor ekspresi yeast. Untuk mencapai
sasaran tersebut dilakukan pembagian tugas atau Working
Breakdown structure (WBS) di Konsorsium. Lembaga Eijkman
bertugas dalam deteksi, isolasi dan karakterisasi molekular
VHB dan konsensus gen yang diperlukan untuk vaksin
Hepatitis B. Tim UAI bertugas untuk menyiapkan design
contruct pada vektor ekspresi di sistem yeast dan membuat
data base sekuens untuk kemudahan akses informasi
sekuens VHB di Indonesia. PT Bio Farma sebagai
koordinator Konsorsium bertugas untuk menyiapkan
0711: Neni Nurainy dkk.
konstruk gen HbsAg pada sistem Hansenula polymorpha,
sedangkan BPPT pada sistem Saccaromyces cereviseae dan ITB
pada sistem Pichia pastoris.
Tulisan ini menjelaskan progres yang dicapai oleh
Konsorsium Hepatitis B terhadap dua tujuan ditahun 2012,
yaitu (i). deteksi, isolasi, dan karakterisasi virus Hepatitis B
isolat Indonesia sampai ke tingkat molekular; dan (ii)
konstruksi vektor ekspresi gen subunit kandidat vaksin
Hepatitis B di dalam sistem mikroba, seperti yeast.
II.
METODOLOGI
Deteksi, isolasi, dan karakterisasi molekuler patogen virus
Hepatitis B
Virus diisolasi dan diamplifikasi dari serum pasien asal
isolat Indonesia. Karakterisasi sampai tingkat molekuler
dilakukan terhadap semua isolat yang mewakili setiap
kelompok antigen, baik yang sudah berada dalam koleksi
maupun yang baru diperoleh dari kasus baru. Hasil
karakterisasi molekular akan dijadikan dasar untuk memilih
galur dan sekuens gen virus yang dianggap paling sesuai
maupun untuk penyusunan sekuens konsensus untuk
pengembangan benih protein rekombinan vaksin. Isolasi,
amplifikasi, dan karakterisasi isolat virus Hepatitis B akan
dilakukan di fasilitas kultur sel Lembaga Eijkman.
Sekuensing gen akan dilakukan oleh tim peneliti lembaga
Eijkman, sedangkan analisa sekuens akan dilakukan
bersama-sama antara tim peneliti lembaga Eijkman, PT Bio
Farma dan Universitas Al Azhar Indonesia (UAI).
Identifikasi, isolasi dan persiapan konstruksi gen
pengkode protein subunit rekombinan kandidat vaksin.
Berdasarkan hasil karakterisasi molekuler akan
disiapkan sekuens fragmen materi genetik yang akan dibuat
secara sintetik ke dalam vektor ekspresi mikroba yeast.
Teknologi platform vaksin yang akan digunakan dalam
penelitian ini adalah protein subunit rekombinan yang
diekspresikan di dalam yeast. Konstruksi ini akan
dilaksanakan secara kolaboratif antara tim peneliti PT. Bio
Farma, UAI, BPPT dan ITB.
Penelitian pada tahun anggaran 2012 lebih bersifat
desain dan pembuatan konstruksi vektor ekspresi. Tahap ini
sangat penting agar nantinya didapat seed dengan kriteria
yang diharapkan oleh industri vaksin, yaitu konstruksi gen
yang diinginkan dalam vektor ekspresi yang sudah
ditransformasi ke dalam sel inang dengan karakteristik yang
konstan dan stabil dari sisi genetik dan yield. Adapun
metode kerja penelitian seperti yang dijelaskan pada
Gambar 1.
0711: Neni Nurainy dkk.
KO-225
Gambar.1 Metode kerja konsorsium Hepatitis B yang terdiri dari Lembaga Eijkman, Universitas Al Azhar Indonesia, Institut Teknologi
Bandung (ITB), BPPT dan PT Bio Farma.
dapat dipertimbangkan sebagai acuan dalam sekuens SHBsAg.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Luaran utama dari penelitian ini adalah diperoleh klon
HBsAg dalam vektor ekspresi yeast, dalam penelitian ini
telah dicapai tiga kandidat klon, yaitu dalam vektor ekspresi
S.cereviseae, P.pastoris dan H.polymorpha. Luaran
tambahan yang diperoleh adalah draft patent vektor
ekspresi H. polymorpha dan tiga makalah penulisan ilmiah
serta database Genbank Indonesia. Luaran tambahan ini
digambarkan pada Gambar 2.
PT Bio Farma
Telah melakukan analisa dan penentuan sequence
DNA Hepatitis B untuk kandidat vaksin. Design konstruk
vektor ekspresi baru pada H. polymorpha dan kandidat klon
HBsAg dalam sistem ekspresi tersebut telah diperoleh.
Lembaga Eijkman
Dalam studi ini telah di dapat informasi sekuens
sHBsAg sebanyak 47 isolat dari Indonesia wilayah Barat,
Tengah dan Timur. Studi yang bertujuan untuk
mendapatkan sekuens yang representatif isolat Indonesia
untuk dijadikan acuan dalam pembuatan vaksin rekombinan
mengusulkan VHB genotipe adw-B3 isolat Indonesia untuk
Gambar 2. Luaran tambahan konsorsium Hepatitis B berupa
kandidat patent dan tiga makalah publikasi serta database genbank
Indonesia.
UAI
Telah didapat desain konstruk gen sintetik HBsAg
yang merupakan genotipe adw-B3 yang dapat diekspresikan
di dalam S. cerevisiae dan P. pastoris. Khusus untuk H.
KO-226
polymorpha desain telah dilakukan oleh tim Bio Farma dan
ITB. Telah dikembangkan pula sebuah database meliputi
genbank yang berfomat Fasta dan protein yang berformat
Fasta-seq dapat diakses pada alamat bionformatic.uai.ac.id
Tahap pembuatan phylogenetic tree program, telah
diselesaikan komputasi fase awal yaitu PSA (Pairwise
Sequence Alignment). T
Telah
dilakukan
karakterisasi
sekuens
yang
dikumpulkan yang menunjukkan pemisahan clade B, C, dan
D.
Telah dilakukan analisa gen sintetik dengan
mempertimbangkan codon bias yang menunjukkan bahwa
gen sintetik berpotensi terekspresikan dengan baik
ITB
DNA pengkode HBsAg yang telah dirancang
sebelumnya dengan menggunakan optimasi kodon oleh
UAI, telah berhasil disintesis dalam plasmid pJHBsAg dan
diperbanyak dalam E.coli TOP10. Hasil analisis restriksi dan
sekuensing menunjukkan bahwa DNA pengkode HBsAg
yang paling sesuai dengan rancangan (100 % identik) adalah
pJHBsAg1. DNA pengkode HBsAg tersebut selanjutnya
telah disubklon dengan pAO815 menghasilkan kandidat
rekombinan pAOHBs1 yang mengandung 3 copy fragmen
HBsAg.
BPPT
DNA sintetik pengkode HBsAg yang telah dirancang
dan dioptimasi dikonstruksi ke dalam vektor ekspresi pKS1ST yanng merupakan vektor ekspresi Saccharomyces
cereviseae
Dalam kegiatan konsorsium ini telah diperoleh data
genotipe VHB di Indonesia yaitu genotipe B, C dan D.
Genotipe B3 (serotipe adw) dipilih untuk design gen HBsAg
dengan mempertimbangkan sebaran dan mayoritas genotipe
VHB di Indonesia. Meskipun adw-B3 Indonesia dijadikan
acuan dalam penyusunan design konstruk HBsAg, tidak
berarti bahwa vaksin ini tidak dapat digunakan di negara di
luar Indonesia karena adanya daerah determinan “a” pada
design construct yang bersifat
lestari pada semua
serotype/genotype di dunia.
Dalam pemilihan sistem ekspresi, tahun 2012 ini
dilakukan tiga pendekatan sekaligus untuk sistem H.
polymorpha, P. Pastoris dan S. cereviseae. Tiga pendekatan
ini dilakukan mengingat adanya kelebihan dan keterbatasan
dari masing-masing sistem. Pada sistem H. polymorpha,
dikatakan produksi di sistem ekspresi ini memberikan yield
yang lebih tinggi dari dua sistem lainnya [3]. Akan tetapi
ada keterbatasan yaitu tidak tersedianya secara komersial
vektor ekspresi maupun galur H. polymorpha baik untuk
kebutuhan penelitian maupun kebutuhan produksi, dengan
demikian Konsorsium harus merancang sendiri vektor
ekpresi dan melakukan rekayasa dalam pengadaan galur H.
0711: Neni Nurainy dkk.
polymorpha spesifik untuk produksi vaksin rekombinan
dengan memperhatikan kaidah patent yang ada.
Pada sistem S. cereviseae, produksi protein rekombinan
akan lebih visible karena teknologi sudah off patent, akan
tetapi dari sisi yield masih rendah dibanding dua sistem
lainnya, sehingga diperlukan strategi khusus untuk
peningkatan yield produksi.
Sistem P. pastoris telah tersedia secara komersial untuk
kebutuhan penelitian, sehingga memudahkan untuk
pembuatan multi kaset ekspresi yang nantinya dapat
meningkatkan level ekspresi HBsAg[4]. Keterbatasan sistem
ini
adalah
penggunaan
methanol
dalam
sistem
fermentasinya yang merupakan bahan berbahaya dan harus
ditangani dengan baik, demikian pula sampai saat ini belum
ada vaksin Hepatitis B rekombinan yang telah diakui WHO
menggunakan sistem ini [5]. Dengan demikian untuk
mendapat pengakuan WHO diperlukan upaya pembuktian
bahwa vaksin yang dihasilkan dari sistem ini aman dan
memberikan respon imun yang diharapkan.
Hasil yang diperoleh dalam kegiatan penelitian ini
telah memenuhi luaran wajib dan luaran tambahan, namun
dalam pelaksanaanya ditemui beberapa kendala yaitu
kendala administrasi karena waktu penelitian yang terbatas,
padahal birokrasi antara lembaga berbeda dan perlu
penyesuaian; kendala berikutnya adalah komunikasi antar
lembaga, dan komitmen dari semua pihak dalam rangka
pencapaian tujuan bersama diantaranya dukungan dalam
pengadaan bahan baku. Kendala lainnya adalah isu patent
teknologi yang digunakan oleh para peneliti. Peneliti
menguasai teknologi tersebut, akan tetapi secara komersial
tidak dapat diproduksi karena dilindungi oleh paten. Oleh
karena itu strategi untuk penguasaan teknologi atau akses
terhadap patent diperlukan.
Dinamika pada tahun 2012 dijadikan pembelajaran
bagi semua pihak termasuk Kemenristek yang secara positif
telah melakukan perbaikan dari sisi administrasi terutama
dalam seleksi InSinas dan penetapan dilakukan pada tahun
sebelum kontrak proyek dan adanya key person yang
ditempatkan Kemenristek untuk mengawal konsorsium baik
dari sisi esensi meupun administrasi. Konsorsium Hepatitis
B secara internal akan melakukan langkah perbaikan untuk
kinerja yang lebih baik di masa yang akan datang.
IV. KESIMPULAN
Pada program InSinas 2012 ini, Konsorsium Hepatitis B
telah memperoleh capaian yang diharapkan yaitu
tersedianya klon HBsAg berdasarkan informasi sekuens dari
isolat asli Indonesia pada vektor ekspresi yeast S. cerevisiae,
H. polymorpha, dan P. pastoris, Selain juga capaian
tambahan berupa satu draft patent, tiga kandidat makalah
untuk journal nasional/international dan suatu databased
sekuens Hepatitis B di Indonesia.
0711: Neni Nurainy dkk.
Klon HBsAg tersebut diharapkan akan dikarakterisasi
dan diuji stabilitasnya pada kegiatan konsorsium
selanjutnya. Akselerasi melalui akuisisi teknologi protein
rekombinan pada sistem yeast akan membantu percepatan
pengembangan vaksin Hepatitis B. Agar kandidat seed
dapat diterima dan digunakan di industri kandidat tersebut
harus terkarakterisasi dengan baik, stabilitasnya teruji dan
data pembuatan seed didokumentasi dengan baik. Oleh
karena itu penyediaan infrastruktur (Laboratorium
penelitian) dan peralatan/instrumen yang tersertifikasi dan
dapat digunakan bersama sangat diperlukan dalam kegiatan
Konsorsium di masa yang akan datang.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini di biayai dari Dana Insentif Riset
Nasional 2012 Kementrian Riset dan Teknologi Indonesia
dan PT Bio Farma (Persero)
DAFTAR PUSTAKA
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
World Health Organization, World Health Assembly
Newsletter, May, 2010.
Departemen Kesehatan RI, Paradigma Indonesia Sehat
2010, Depkes RI, 2000.
Boer, E., Steinborn, G., Kunze, G., Gellisen, G., (2007)
Yeast expression platforms – mini review. Appl
Microbiol Biotechnol 77:513-523
Vassileva, Ana; Chugh, Dipti-Arora; Swaminathan,
Sathyamangalam; Khanna, Navin, 2001: Effect of Copy
Number on the Expression Levels of Hepatitis B
Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast Pichia
pastoris. Protein Expression and Purification 21(1): 7180
Brocke, P., Schaefer, S., Melber, K., Jenzelewski, V.,
Müller, F., Dahlems, U., Bartelsen, O., Park, K.-N.,
Janowicz, Z. A. and Gellissen, G. (2005) Recombinant
Hepatitis B Vaccines: Disease Characterization and
Vaccine
KO-227