ii. materi dan metode - Fakultas Biologi

II. MATERI DAN METODE
2.1 Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian
2.1.1 Materi
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah cawan petri, tabung reaksi,
gelas ukur, pembakar spiritus, pipet, jarum ose, erlenmeyer, penggaris, pinset,
gunting, pisau, sprayer (botol semprot), botol selai, plastik pembungkus,
mikroskop, colony counter, timbangan, kompor, panci, blender, Laminar Air
Flow (LAF), autoclave, oven, kertas label, kertas saring, plastik, tissue, baki,
ember dan kapas.
Bahan yang digunakan adalah Pupuk Hayati Majemuk Cair Bioextrim,
isolat cendawan Fusarium oxysporum didapat dari koleksi Labolatorium Mikologi
Fakultas Biologi UNSOED Purwokerto, media King's B, media TSA (Tryptic Soy
Agar), Media Caceres, Media YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar), Media Asbhy,
media PDA (Potato Dextrose Agar), alkohol 70%, spirtus, aquades steril, tanah,
pasir dan benih cabai.
2.1.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Kaca
(green house) Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto.
Penelitian dilaksanakan dari bulan April sampai dengan bulan Juli 2014.
2.2 Metode Penelitian
2.2.1 Rancangan Percobaan
Penelitian dilakukan secara eksperimental menggunakan rancangan acak
lengkap (RAL). Perlakuan terdiri dari empat penginokulasian mikroba
biofertilizer pada media carrier alami yang berbeda yaitu: (1) Media alami Air
Kelapa (Ba); (2) Media alami Bonggol Pisang (Bb); (3) Media alami Cocopeat (Bc)
dan (4) Media alami Campuran dari ketiga bahan (Bd).
2.2.2 Variabel yang diamati
Variabel yang diamati dalam penelitian adalah variabel bebas dan variabel
terikat. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah macam media carrier alami.
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah viabilitas bakteri dalam media carrier
alami dan kemampuan bakteri asal biofertilizer dalam menekan pertumbuhan F.
oxysporum. Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah jumlah populasi
6
bakteri pada media carrier alami dan persentase indeks penyakit yang
ditimbulkan oleh patogen F. oxysporum terhadap tanaman cabai.
2.3 Cara Kerja
2.3.1. Sterilisasi Alat (Hadioetomo. 1990)
Sterilisasi alat dilakukan dengan membungkus semua peralatan dengan
menggunakan kertas kemudian dimasukkan dalam autoclave pada suhu 1210 C
dengan tekanan 2 atm selama 15 menit.
2.3.2.Isolasi dan Perhitungan Populasi Awal dari Bakteri yang Terkandung dalam
Biofertilizer komersial
Bakteri dalam biofertilizer komersial diisolasi kemudian dihitung jumlah
populasinya. Bakteri diisolasi menggunakan media selektif, yaitu media King’s B
untuk Pseudomonas spp., media Caceres untuk Azospirillum spp., media Asbhy
untuk Azotobacter spp., media TSA untuk Bacillus spp. dan media YEMA untuk
Rhizobium spp. Biofertilizer komersial diambil sebanyak 1 ml, kemudian
diencerkan dalam 9 ml akuades steril, dikocok hingga homogen dan dilakukan
pengenceran kembali hingga 6 kali seri pengenceran. Dua pengenceran seri
terakhir diambil sebanyak 0,1 ml dan ditanam duplo pada masing-masing
medium selektif. Perhitungan populasi sel dilakukan dengan metode TPC (Total
Plate Count). Cawan-cawan kemudian diinkubasi selama 2x24jam pada suhu
300C, dan penghitungan koloni menggunakan colony counter.
Jumlah sel = Jumlah koloni cawan 1,2,3,... dst x 1/fp
Jumlah cawan
cfu
2.3.3. Penyiapan Media Carrier Alami Biofertilizer
Media carrier alami terdiri dari air kelapa, bonggol pisang dan cocopeat.
Air kelapa terlebih dahulu disaring dan cocopeat diayak kemudian dicampur
dengan akuades steril hingga kandungan airnya menjadi 30-40% (ditandai
dengan tidak menetesnya air bila bahan digenggam dan akan mekar bila
genggaman dilepas), sedangkan bonggol pisang dipotong kecil-kecil dan
dihaluskan dengan blender. Ketiga bahan ini dipisah sesuai dengan perlakuan.
Media campuran terdiri dari 3 bahan media carrier alami (air kelapa, cocopeat
dan bonggol) dengan perbandingan komposisi yang sama. pH media di buat
sama yaitu 7 dan selanjutnya media disterilisasi dengan uap panas
menggunakan autoclave.
7
2.3.4. Fermentasi Media Carrier Biofertilizer
Media carrier alami yang telah disiapkan diinokulasikan secara aseptis
dengan biofertilizer komersial. Inokulan biofertilizer diinokulasikan ke dalam
media sebanyak 10 ml/1 lt bahan media cair atau 10 ml/1 kg bahan media padat
dengan jumlah populasi per mililiter dapat diketahui dari hasil jumlah
perhitungan populasi awal mikroba biofertiolizer. Setelah itu, media dimasukan
ke dalam toples plastik dan difermentasi selama tujuh hari pada suhu kamar.
2.3.5. Uji Viabilitas Mikroba Hasil Fermentasi dengan Metode Total Plate Count (TPC)
(Lay, 1994)
Uji viabilitas inokulan dilakukan setelah 7 hari inkubasi dengan
mengencerkan 1 gram hasil fermentasi biofertilizer dengan 9 ml aquades steril,
dikocok hingga homogen dan dilakukan pengenceran kembali hingga 6 kali seri
pengenceran. Dua pengenceran seri terakhir diambil sebanyak 0,1 ml dan
ditanam duplo pada media selektif bakteri. Penghitungan populasi sel dilakukan
dengan metode TPC. Cawan-cawan selanjutnya diinkubasi selama 2x24jam pada
suhu 300C, dan penghitungan koloni menggunakan colony counter.
Jumlah sel = Jumlah koloni cawan 1,2,3,... dst x 1/fp cfu
Jumlah cawan
Setelah didapat nilai jumlah populasi akhir selanjutnya dihitung persentase
selisih jumlah populasi dengan rumus
Jumlah koloni mikroba akhir- Mikroba awal (cfu/ml)
Viabilitas (%) = ------------------------------------------------------------------------- x 100%
Total Jumlah koloni (Mikroba awal+mikroba akhir) (cfu/ml)
2.3.6. Pembuatan Inokulum Fusarium oxysporum
Perbanyakan isolat patogen F. oxysporum dilakukan dengan menggunakan
medium PDA. Media PDA steril sebanyak 250 ml dimasukan ke dalam
Erlenmeyer dan ditambah streptomycin 0.128 g/l, kemudian dituang dalam
cawan petri sebanyak 10 ml/cawan. Setelah medium memadat, potongan
miselium F. oxysporum dari biakan murni dipindah secara aseptis dan diinkubasi
selama 7 hari atau hingga miselium memenuhi cawan petri.
Untuk penularan pada tanaman, F. oxysporum diperbanyak pada media
organik yaitu campuran gabah dan sekam. Bahan media dengan perbandingan
gabah 70% dan sekam 30%, dicuci sampai bersih kemudian direbus (Kurrata,
2007). Diambil kurang lebih 150 gram dan dimasukkan dalam erlenmeyer 250 cc,
ditambah dengan pepton 5% sebanyak 5 ml, selanjutnya disterilisasi dalam
8
autoclave. Setelah dingin, media tersebut diinokulasi dengan jamur F.
oxysporum. Biakan sekam tersebut selanjutnya diinkubasikan selama 7 hari pada
suhu kamar. Setelah media organik tersebut dipenuhi jamur, biakan siap
diaplikasikan pada media tanam.
2.3.7. Uji Kemampuan Biofertilizer pada Media Carrier Alami Terhadap Pertumbuhan
Tanaman Cabai (Capsicum annum) yang diinfeksi dengan F. oxysporum
Pengujian kemampuan biofertilizer hasil fermentasi pada media carrier
alami terhadap jamur patogen F. oxysporum dicobakan pada pembibitan
tanaman cabai. Biji cabai disemai pada media semai. Media persemaian yang
digunakan adalah campuran pasir dan tanah dengan perbandingan 1:1. Media
persemaian ini disterilkan dengan cara memanaskan di dalam panci selama 1
jam dengan keadaan airnya mendidih, kemudian didinginkan selama 24 jam.
Selanjutnya media semai disterilisasi lagi dengan cara yang sama. Sebanyak 0,5
kg media persemaian dimasukkan ke dalam baki kecambah.
Media persemaian pada baki diinfeksi dengan patogen F. oxysporum
dengan menambahkan media organik F. oxysporum sebanyak 15 g/baki dan
diinkubasi selama 5 hari, selanjutnya biofertilizer hasil fermentasi dimasukkan ke
dalam baki persemaian sebanyak 10 g/ tanaman untuk media carrier padat dan
10 ml/ tanaman untuk media carrier cair, kemudian diinkubasikan selama 3
hari.
Biji cabai dengan ukuran seragam terlebih dahulu disucihamakan dengan
larutan kalsium hipoklorit 1,85% selama 3 menit dan dicuci lagi dengan akuades
steril sebanyak 4 kali. Biji cabe disemai pada media semai sebanyak 10 biji/baki.
Penyiraman dilakukan dengan akuades steril untuk memantapkan struktur dan
agregat tanah, dan tanaman dipelihara selama 3 minggu. Pemeliharaan tanaman
meliputi penyiraman setiap hari sekali dengan air sesuai dengan kebutuhan.
Penyiangan gulma dan pengendalian hama dilakukan bila perlu dengan cara
mekanis.
Pengamatan pertumbuhan tanaman dilakukan seminggu sekali mulai
umur 7 hari sampai tanaman berumur 14 hari sesudah tanam. Persentase
penyakit dihitung dengan menggunakan rumus yang diadaptasi dari Abadi
(2003).
Jumlah tanaman sakit
P (Persentase Indeks Penyakit) = ---------------------------------- x 100%
Jumlah seluruh tanaman
9
2.4 Metode Analisis
Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis dengan uji analisis varian
tunggal (one way anova) F pada taraf 5%. Hasil data yang diperoleh tidak berbeda
nyata antara perlakuan yang dicobakan, sehingga tidak dilanjutkan dengan uji Beda
Nyata Terkecil (BNT) pada taraf 5%.
10