Amplifikasi gen penyandi hemolsyn dari bakteri

II.BAHAN DAN METODE
2.1 Isolasi Dan Karakterisasi Pewarnaan Gram Bakteri Vibrio harveyi
Media TCBS disiapkan dalam keadaan aseptik, sampel udang yang
terserang vibriosis dipindahkan menggunakan ose dan digoreskan ke media TCBS
kemudian diinkubasi selama 24 jam. Identifikasi bakteri Vibrio harveyi dengan
menggunakan metode pewarnaan gram atau secara sederhana yaitu dengan cara
media TCBS dimasukkan ke dalam ruang gelap, jika terbentuk warna hijau
berpendar maka bakteri yang tumbuh tersebut merupakan bakteri V.harveyi.
Bakteri V. harveyi yang diperoleh dikultur murni dan ditumbuhkan pada media
TCBS dengan menggunakan agar miring. Selanjutnya, kultur dipindahkan dari
media padat ke media cair (NB) yang ditambahkan dengan NaCl 1,5% dan biakan
diletakkan dalam shaker selama 24 jam.
Langkah awal dalam pewarnaan Gram (Lampiran 2) yaitu bakteri V.
harveyi dioleskan diatas gelas objek. Kemudianlarutan kristal violet diteteskan
pada preparat olesan bakteri sebanyak 2-3 tetes dan dibiarkan selama 1 menit.
Selanjutnya preparat dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan kertas
isap. Kemudian preparat diteteskan larutan Kalium Iodida sebanyak 2-3 tetes dan
dibiarkan selama 1 menit. Preparat dicuci kembali dengan air dan dikeringkan.
Tahap selanjutnya preparat diteteskan alkoholdan didiamkan selama 30 detik,
kemudian preparat dicuci dan dikeringkan kembali. Selanjutnya larutan safranin
diteteskan dan didiamkan selama 30 detik, kemudian safranin dicuci dan
dikeringkan dengan kertas isap. Kemudian preparat diamati dibawah mikroskop.
2.2 Karakterisasi Ekspresi Gen Hemolysin Isolat Pada Media Agar Darah.
Media agar darah (blood agar), merupakan media differensial yang
berfungsi untuk membedakan bakteri berdasarkan kemampuan mereka untuk
melisiskan sel-sel darah merah. Pembuatan media agar darah dimulai dengan
melarutkan TSA sebanyak 40 gram dalam akuades sebanyak 1000 ml (Lampiran
5), kemudian pH media diukur sampai mencapai 7,3. Kemudian media dipanaskan
di penangas sampai larut dan diaduk sampai homogen. Setelah itu media
5
disterilkan. Ketika menunggu proses sterilisasi media, hangatkan darah kambing
segar sampai suhu 500C sebanyak 5% dari volume total media atau sebanyak 50
ml yang sudah didefibrinasi dengan menggunakan larutan Na citrat. Dinginkan
pula TSA steril sampai suhu mencapai 500C (Hadioeutomo, 1993).
Secara aseptik kemudian darah kambing segar dituangkan ke dalam labu
berisi TSA dan dicampur dengan cara memutar-mutar labu tersebut dengan hatihati. Kemudian media dituangkan sebanyak 12 ml ke dalam cawan petri steril.
Kemudian biakan bakteri ditanam dengan menggunakan ose dan digoreskan ke
media agar darah dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu ruang. Ekspresi dari
gen hemolysin dapat diketahui dari ada tidaknya zona bening di sekitar
goresan/koloni dari kultur yang ditumbuhkan yang menunjukkan adanya lisis sel
darah merah.
2.3 Ekstraksi DNA
Vibrio harveyi yang dikultur selama 18-24 jam dalam media cair LB (luria
bertani) (lampiran 3) diambil dengan menggunakan mikropipet sebanyak 1 ml
dan dimasukkan ke dalam eppendorf steril. Kemudian eppendorf disentrifuse
selama 1 menit pada suhu 4oC dan kecepatan 12000 rpm. Selanjutnya bagian
supernatan dibuang, pellet disuspensi kembali dengan menambahkan 500 µl
buffer steril dan disentrifuse kembali pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.
Supernatan dibuang, kemudian ke dalam eppendorf diambahkan 100 µl lysozym
dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam. Setiap 15 menit sekali eppendorf
dibolak-balik perlahan. Kemudian ke dalam eppendorf ditambahkan 100 µl SDS
10% dan 10 µl Prot-K, kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37 oC selama 1
jam.
Tahap selanjutnya ke dalam eppendorf ditambahkan 100 µl NaCl 5 M
larutan dicampur dengan cara dibolak-balik perlahan. Kemudian ke dalam
eppendorf ditambahkan
ekstraksi buffer (2% CTAB, 100 mM Tris-HCL pH 8,
1.4 M NaCl, 20 mM EDTA) dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65oC.
Setelah itu ke dalam eppendorf ditambahkan 500 µl phenolchloroform-isoamyl
alkohol. Larutan kemudian dihomogenkan dengan cara eppendorf dibolak-balik
6
selama 1 menit. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu
4 oC selama 5 menit.
Setelah terbentuk tiga lapisan, lapisan paling atas diambil dandi pindahkan
ke dalam eppendorf baru sebanyak 50-100 µl menggunakan mikropipet dan
ditambahkan ethanol absolut atau isopropanol dingin dengan volume yang sama
dengan supernatan yang di pindahkan.Kemudian diinkubasi dalam freezer dengan
suhu -20 oC selama 20 menit. Langkah berikutnya eppendorf disentrifuse dengan
kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pellet DNA dicuci
dengan 1 ml ethanol 70% bersuhu -20 oC. Pellet dikeringkan di steril bench
selama 15-30 menit. Kemudian aquabides ditambahkan ke dalam eppendorf
sebanyak 50 µl.
2.4 PCR
Langkah awal saat PCR adalah mempersiapkan ”master-mix”. Komposisi
dalam ”master-mix” dapat dilihat pada tabel berikut :
Tabel 1. ”Master mix” yang digunakan untuk PCR
Reagent
Volume (µl)
dH2O (steril)
18.5
Buffer (10 x)
2,5
dNTP (2,5 mM)
2.5
Forward primer (5 µM)*
1
Reverse primer (5 µM) **
1
Taq DNA Polymerase
0,2
Primer yang digunakan ;
* Myhemo F1 5’-GATGGTCAGTGCCTCTCA-3’
** Myhemo R1 5’-CCCAGTTGTATAGCGGTA-3’
Template DNA yang digunakan adalah, V-U5, V-U7, V-U8, V-U9, V-U24, V-U27, VU41NL dan V-V44.
7
PrimerMyhemo dirancang dengan mengambil potongan DNA gen
hemolysin yang sebelumnya telah dilakukan penelitian oleh Yuhana et al, (2009).
yang dimulai dari urutan basa forward ke-86 dan reverse urutan basa ke-586
(Gambar 1) dengan target produk 518 bp.
Forward
>Vh_hemo
gatggatcatgaataaaactattacgttacttagtgcattattactaccactaagttttgctcacgctgccgagccaacattgtct
ccagagatggtcagtgcctctcaagtaagaagcgcgcaagcgaaacaaacttacacttatgtccgctgctggtaccgcacca
gttattcaaaagatgaacctgcgaccgattgggaatgggcagaaaatccagacggcagttacttcacgcttgatggctactgg
tggagttcggtttctttcaagaacatgttctacacagacacaccgcaaagtgttatcaagcaacgttgtgagcaaactctggac
ctagcaaatgaaaacgctgacatcaccttctttgcagccgataaccgtttctcctacaaccatactatctggagcaacgaccct
gtcatgcagccagaccaaatcaacaaggtcgtagcattgggtgacagcttgtctgatacaggcaacatctttaatgcatcaca
atggcgattcccgaatccaaatagctggttcttgggacacttctcaaacggttttgtgtggactgagtacattgctcaagcgaaa
aacttaccgctatacaactgggctgtgggtggcgcggcaggcgaaaaccaatacatcgctctgactggtgtaggtgagcaag
tttcctcttacttggcatatgcgaaattagcgaaaaactacaagcctgctaataccctgtttacccttgagtttggtctaaatgac
ttcatgaactacaaccgtagcgtgccagaagtgaaatcagactacgcggaagccttgattaaactgaccgatgcaggtgcga
agaacttgttgttgatgacactaccagatgcaacacgtgcaccacagtttacctactcgactcaagaagaaatcaacaagatc
cgcgcgaagatcgtggaaatgaatgagttcatcaaagcacaagcggcgtattacactgcacaaggctacaacgttaccttgta
cgatacgcatgcactgtttgaaagcttaacagcaaatccagagcaacacggttttgtaaacgcgagccaagcttgccaagac
atcaaccgctcttcatcggtagattacctataccatcactcattgcgttctgagtgtgcgtcttctggctctgataagtttgtattct
gggacgtaacacacccgaccacagcaacacaccactacgtggcagaaaaaatgctagaaagtacgaatcaattgtcaaacc
atcctttctaa
Revers
Gambar
Gambar 1.Sekuen Primer
hemolysin (Yuhana et al, 2009).
Master-mix yang telah dicampur divortex dan dispindown. Pencampuran
bahan-bahan dilakukan di atas es (on ice). Larutan master mix dimasukkan ke
dalam tabung PCR sebanyak 24,5 µl
untuk setiap sampel. Setelah itu,
ditambahkan 0,5 µl sampel DNA. Larutan kemudian divortex dan dispindown.
Kegiatan pencampuran harus dilakukan dengan cepat dan berhati-hati agar tidak
terjadi kontaminasi silang antar sampel. Kemudian tabung PCR dimasukkan ke
8
dalam mesin PCR dengan program sebagai berikut; Pre start 94oC selama 2
menit, denaturasi 94oCselama 1 menit, annealing 50oCselama 1 menit dan
ektension 72oC selama 1 menit yang dilakukan sebanyak 35 siklus. Untuk lebih
jelasnya tahapan prosesPCR dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini.
Gambar 2Siklus pembentukan molekul DNA baru dalam proses
PCR.(Muladno, 2002).
9
2.5 Elektroforesis
Pembuatan gel agarosa konsentrasi 0,7% dimulai dengan melarutkan
serbuk gel agarosa sebanyak 0,14 g dalam 20 ml larutkan tris boric EDTA (TBE)
yang mengandung etidium bromida (0,01 g/ml). Kemudian campuran dipanaskan
dalam microwave sampai agarosa larut dan larutan menjadi berwarna bening,
larutan tersebut didiamkan sampai hangat lalu dituangkan ke dalam cetakan
dengan ketebalan 3-5 mm. Sementara itu di dalam cetakan sudah terpasang sisir
untuk lubang. Kemudian gel dibiarkan sampai membeku. Setelah itu sisir
dilepaskan dan padatan gel dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi
buffer elektroforesis (TBE).
Kemudian sampel DNA dicampur dengan loading buffer (6X)dengan
perbandingan 3 µl DNA dicampur dengan 4 µlloading dye, setelah itu
DNAdimasukkan ke dalam lubang-lubang yang terdapat dalam gel dengan
menggunakan mikropipet. Sementara itu marker DNA juga dimasukkan ke dalam
lubang yang mengapit lubang-lubang yang berisi sampel. Setelah, itu bak
elektroforesis ditutup dan listrik dialirkan dengan tegangan 200 volt dan kuat arus
70mA. DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke positif. Setelah DNA
bermigrasi sampai tiga perempat bagian dari panjang gel, aliran listrik dihentikan.
Lalu gel diangkat dan dilepaskan dari cetakannya. Kemudian keberadaan DNA
dilihat dengan ultraviolet transilluminator dan didokumentasikan.
10